1 Phần I LÝ THUYẾT NỘI QUY, AN TỒN PHỊNG THÍ NGHIỆM I NỘI QUY AN TỒN PHỊNG THÍ NGHIỆM Chỉ phép làm việc phòng thí nghiệm khi: - Được cho phép người phụ trách phòng thí nghiệm - Sau huấn luyện quy tắc an tồn phòng thí nghiệm Quy định chung - Khơng đưa trẻ em, bạn bè, vào phòng thí nghiệm - Trong phòng thí nghiệm phải giữ thái độ nghiêm túc, không cười đùa, nghịch ngợm tránh gây điều đáng tiếc cho người khác - Quan sát, tìm hiểu thật kỹ xếp, bố trí phòng thí nghiệm: + Hóa chất, thiết bị, + Hệ thống điện, nước, gas + Các thiết bị an tồn: vòi nước sạch, hệ thống chữa cháy, hộp báo động, + Các số điện thoại cần thiết: Người phụ trách, Y tế, Cứu hỏa, - Không tự ý thay đổi bố trí phòng thí nghiệm - Chỉ phép vận hành máy móc sau hướng dẫn thực hành - Không vào tự phòng thí nghiệm - Khơng mang đồ ăn, uống vào phòng thí nghiệm, khơng bảo quản thức ăn đồ uống tủ lạnh đựng mẫu, hóa chất - Khơng hút thuốc phòng thí nghiệm - Mặc trang phục gọn gàng, phù hợp Không mặc quần áo dài ngắn, tóc dài phải buộc gọn khơng dép xỏ ngón dép q cao gót dễ trượt ngã - Khơng chân trần phòng thí nghiệm có mảnh thủy tinh vỡ, hóa chất, - Trong phòng thí nghiệm thiết phải mặc áo blouse Khi làm thí nghiệm phải đeo trang găng tay - Khi tiếp xúc với tác nhân độc (hóa chất độc, sinh vật gây bệnh, thiết bị phóng xạ, ) phải mặc trang phục bảo hộ (quần áo bảo hộ, kính, trang, găng tay, mặt mạ phòng độc, mũ ) tuân thủ nghiêm ngặt quy định riêng tác nhân độc - Trước sau làm việc phải vệ sinh vị trí làm việc, bàn thí nghiệm, thiết bị dụng cụ cần thiết - Không nếm thử chất phòng thí nghiệm Lưu ý không để miệng chạm vào vật phòng thí nghiệm - Khơng nhìn trực tiếp, thẳng góc vào ống nghiệm Phải quan sát từ phía cạnh - Khơng đưa mũi ngửi trực tiếp chất ống nghiệm bình, lọ - Nghiêm cấm sử dụng pipet miệng Khi hút nhiều hóa chất lúc phải hút pipet khác phải thay đầu tip pipetman - Khi làm việc với dung mơi có mùi dễ bay (phenol, chloroform, õ- Mecaptoethanol, acetic acid, ) phải làm tủ hood - Các hóa chất pha phải gắn nhãn cẩn thận (tên hóa chất, cơng thức hóa học, nồng độ, ngày pha, tên người, ) - Trước sử dụng hóa chất phải đọc kỹ nhãn mác vỏ chai/lọ hóa chất, tránh nhầm lẫn chất có tên gọi, cơng thức hóa học giống - Trên bàn thí nghiệm để hóa chất dùng lúc - Lập kế hoạch cụ thể cho cơng việc (kiểm tra lại dụng cụ, hóa chất, thiết bị, nhân lực, ) Nếu sử dụng thiết bị chiếm nhiều thời gian phải bàn bạc, xếp với đồng nghiệp khác - Phải báo cáo cho người phụ trách phòng thí nghiệm xảy cố dù nhỏ - Khi cân không để hố chất trực tiếp lên mặt cân, phải có đĩa cân giấy cân - Không để dây dung mơi, hóa chất lên thiết bị đo đạc, phân tích - Khi sử dụng thiết bị phân tích điều khiển qua máy tính, có cố phần mềm, giữ nguyên trạng báo cho người phụ trách phòng thí nghiệm - Khi chuẩn bị dung dịch hóa chất phải tuân thủ quy trình pha (khơng đổ nước vào dung dịch axit đậm đặc mà phải cho từ từ axit vào nước,…) - Các chất thải phòng thí nghiệm phải phân loại Những chất thải thông thường cho vào túi, buộc chặt trước đưa Đối với chất thải hoá chất phải để riêng vào bình chứa đánh dấu theo tính chất đặc hiệu hay chủng loại (chất dễ cháy, chất độc bảng A, chất oxy hóa, axit, kiềm, phenol,…) Tuyệt đối không thải chúng trực tiếp qua bồn nước - Đối với plasmid mang DNA tái tổ hợp, vi sinh gây bệnh, mẫu vật, phải xử lý (hấp vô trùng) trước thải môi trường - Khi bị bỏng da phải nhúng chỗ bị thương vào nước mát vòi nước sạch, báo cho người phụ trách, gọi sơ cứu từ y tế quan - Nếu bị hóa chất dây vào mắt phải xả liên tục vòi nước sạch, báo cho người phụ trách gọi sơ cứu từ y tế quan - Trả lại phòng thí nghiệm vật liệu dụng cụ vị trí sau dùng - Sau hồn tất cơng việc, rửa/lau sạch, làm khơ tất cá dụng cụ, thiết bị, bàn thí nghiệm, khu vực làm việc Ghi nhật ký tình trạng sử dụng trang thiết bị II HOÁ CHẤT VÀ CÁCH BẢO QUẢN Hố chất: Hố chất trạng thái rắn, lỏng, khí đóng gói chai, lọ thuỷ tinh, nhựa, Trên nhãn có thơng tin: - Tên hố chất - Cơng thức hoá học - Trọng lượng hoá chất - Trọng lượng phân tử - Hãng sản xuât - Điều kiện bảo quản - Các ký hiệu an tồn phòng thí nghiệm ký hiệu cấm Cách sử dụng bảo quản hoá chất - Chai lọ hoá chất phải có nắp - Trước lấy hố chất phải lau nắp cổ lọ - Không dùng lẫn nắp đậy dụng cụ lấy hố chất - Khơng dùng hố chất rơi vãi - Trên bàn thí nghiệm để hố chất dùng lúc - Các hố chất dễ bốc hơi, có mùi phải lấy tủ hood - Khi làm việc với axit, kiềm chất độc phait tuân thủ quy định - Khơng ngửi hay nếm hố chất - Các hố chất dễ cháy, nổ khơng để gần lửa III AN TỒN PHỊNG THÍ NGHIỆM Phương pháp rửa dụng cụ Các dụng cụ thí nghiệm bao gồm ống nghiệm, chai lọ, đĩa pettri, bình tam giác, hộp, thủy tinh; đầu côn, eppendoff, hộp đựng đầu côn, nhựa; cối chày sứ, Mỗi loại dụng cụ phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu khác rửa phương pháp khác 1.1 Yêu cầu: Các dụng cụ cần phải mặt hóa học (khơng dính chất hữu cơ, vơ cơ) mặt sinh học (không chứa nấm, vi khuẩn, bào tử, ) 1.2 Xử lý dụng cụ trước rửa: - Dụng cụ thuỷ tinh mua, chưa sử dụng, cần ngâm nước lã H2SO4 loãng vòng 24h Rửa lại xà phòng nước nhiều lần pH trung tính - Các dụng cụ sử dụng có chứa vi sinh vật gây bệnh, plasmid mang DNA tái tổ hợp, trước rửa thiết phải khử trùng nước áp lực cao để giết chết tế bào, để đảm bảo an tồn cho người rửa, khơng reo rắc mầm bệnh vào môi trường - Các dụng cụ sử dụng có chứa hố chất có độc dễ bay (phenol, chloroform, acetic acid, õ-Mecaptoethanol, TEMED, ) trước rửa phải mở nắp dụng cụ để tủ hood ngày cho bay hết - Các dụng cụ sử dụng chứa mẫu vật hố chất thơng thường xếp vào nồi chậu nhơm chun dụng, đổ nước xà phòng, dìm dụng cụ ngập kín nước, đun sơi 15-30 phút Gom cặn bẩn vào túi nilon, buộc kín, cho vào thùng rác - Các dụng cụ bẩn thiết phải ngâm chìm nước lã chưa thể rửa để tránh tượng đóng cặn ăn mòn 1.3 Dung dịch dùng để rửa - Nước rửa chai lọ (có chứa SDS) - Dung dịch 5N NaOH - Nước rửa crom: 5% K2Cr207 100ml H2SO4 đặc Cách pha: Lượng K2Cr207 cần đủ pha nghiền nhỏ cối chày sứ sau chuyển sang cốc chịu nhiệt (nếu pha 200ml cần cốc chịu nhiệt 1000ml), đổ H2SO4 từ từ đặc vào khuấy liên tục đũa thuỷ tinh, đổ cẩn thận 5-10 ml nước cất vào để tăng nhiệt độ dung dịch lên cho dể tan Sau 20 phút dung dịch tự ổn định Khi dung dịch nguội cho vào chai giữ cẩn thận Chú ý: Pha tủ hood ngồi ban cơng - Nước cất lần, nước cất lần Các phương pháp rửa: 2.1 Rửa dụng cụ nhựa: - Rửa đầu côn eppendof: Dụng cụ dùng xong rửa nước lã, đầu côn dùng tia phun nước, eppendof dùng quấn vào đầu tăm rửa nước rửa chai lọ Sau đun dung dịch kiềm (5ml dung dịch 5N NaOH 600ml nước cất) 20 phút, để sau đun lại lần Sau rửa nước lã 10 lần, tráng nước cất Đun nước cất hai lần, lần 15 phút Sấy khô khoảng 30 phút 800C Dụng cụ rửa máy siêu âm dung dịch kiềm Rửa dụng cụ nhựa thông thường: Xả nước lã, dùng khăn mềm thấm xà phòng rửa dụng cụ, xả kỹ nước lã, tráng lại nước cất, dụng cụ phải úp ngược rổ cho nước không bị bám cặn bẩn, không bị bụi rơi vào 2.2 Rửa dụng cụ thuỷ tinh Chai lọ thuỷ tinh dùng nuôi cấy vi sinh, thực vật, gieo hạt, : Dụng cụ thuỷ tinh sau dùng xong rưả nước lã, dùng miếng nhám thấm cồn lau kỹ hiệu ghi dụng cụ, chọn chổi rửa thích hợp với loại ống bình, rửa nước rửa chai lọ, dùng khăn mềm rửa phía ngồi, xả nhiều lần phía phía ngồi (*) Tráng lại nước cất, dựng ngược ống va bình vào rổ có lót giấy để thấm nước, làm khơ nhiệt độ phòng 1200C - Các dụng cụ thuỷ tinh để phục vụ thí nghiệm sinh hoá: Nhất thiết phải dùng dung dịch crom Dụng cụ sau rửa đến bước (*) tráng dung dịch crom, sau 30 phút đến 1giờ rửa lại nước lã nhiều lần, tráng nước cất làm khơ - Pipet dùng hút dịch có chứa vi sinh vật: Sau sử dụng cần ngâm vào ống nước sát trùng Khều bỏ nút bông, ngâm tiếp vào ống nước xà phòng ngày Chuyển sang bình rửa pipet tự động qua đêm, tráng nước cất, hong khơ Nếu rửa trực tiếp vòi, cần điều chỉnh cho dòng nước chảy qua bên pipet Rửa xà phòng, tráng lại nước cất - Pipet dùng cho phản ứng hố học: Khơng cần ngâm nước sát trùng Đặt pipet vòi nước chảy, xả bớt hố chất bám dính bên Ngâm vào ống nước xà phòng ngày, rửa sạch, tráng nước cất Hong khơ nhiệt độ phòng, khơng sấy nhiệt độ cao dẫn đến làm cho thuỷ tinh giãn nở dẫn đến sai lệch thể tích Kính sử dụng chạy điện di: Sau dùng xong phải ngâm vào dung dịch tảy rửa sát trùng, rửa nước rửa chén, dùng khăn mềm tránh xước kính, xả sạch, tráng nước cất Sau thí nghiệm phải rửa nước crom lần Phương pháp khử trùng: 3.1 Mục đích khử trùng: Nhằm loại bỏ tất yếu tố sinh học vi sinh vật, enzyme 3.2 Các phương pháp khử trùng: - Khử trùng nồi hơi: Là phương pháp thường dùng Với phương pháp này, yếu tố cần tiêu diệt bị loại bỏ nhờ nhiệt độ áp lực nước (thông thường 1.06 atm (tương đương với 1210C) thời gian 20 phút) - Khử trùng lò sấy khơ với nhiệt độ cao: vi sinh vật thường bị tiêu diệt nhiệt độ 1700C khoảng 1giờ 30phút - Khử trùng phương pháp chiếu tia UV (ultraviolet-tia cực tím): Nhiều loại vi sinh vật bị tiêu diệt tia tử ngoại tủ cấy thương lắp đèn cực tím để khử trùng trước sau làm việc - Khử trùng hoá chất: + Dung dịch chloramine 5%: Là dung dịch khử trùng tốt, thường dùng để lau chùi, tảy uế khu vực nhiễm trùng, ngâm dụng cụ bẩn sau thao tác + Cồn 70%: Có tác dụng tiệt trùng số đối tượng vi sinh vật, dùng để lau bàn, tủ cấy trước sau làm việc, khử trùng tay trước sau làm việc + Các dung dịch tảy rửa: Xà phòng, sữa tắm, dầu gội, có tác dụng tiệt trùng loại bỏ vi trùng tốt Khi làm việc với tác nhân độc cần phải loại bỏ tư trang áo choàng, mũ giày, trang, găng tay, tắm gội trước khỏi khu vực làm việc 3.2.1 Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh: Khử trùng lò sấy khơ nhiệt độ cao: - Các dụng cụ trước khử trùng phải rửa kỹ càng, làm khơ gói giấy để đảm bảo tính vơ trùng sau sấy + Pipét: Mỗi pipét gói dải giấy dài có chiều rộng 4-5cm Đầu hút pipet nút bơng Gói từ phía đầu nhỏ giọt, cuộn giấy đând dần vào theo kiểu xoắn trôn ốc chô đến hết phía đầu có nút bơng Phải cuộn giấy cho sát khít vào pipét Sau cuộn giấy, để giữ cho khỏi bẩn bị rách ta buộc pipét thành bó cho vào ống đựng pipét làm kim loại hay bìa cứng + Đĩa petri xếp theo gói thành chồng khoảng 2-4 xếp vào ống trụ làm thép không rỉ nhô + Các chai lọ, ống nghiệm, bình tam giác, ống burri,…đều phải đậy nắp nút nút bông, bịt giấy bạc trước khử trùng - Các bước khử trùng: + Các dụng cụ chuẩn bị tốt xếp vào tủ sấy Khơng nên xếp q khít để khơng khí lưu thơng làm nóng vật cần khử trùng + Đóng cửa tủ sấy thật kín sau đóng lỗ thơng khí + Bật công tắc điện + Khi nhiệt độ 160-1800C bắt đầu tính thời gian trì nhiệt độ khoảng 1giờ 30phút + Nếu tủ sấy khơng có thiết bị điều nhiệt phải theo dõi suốt thời gian nhiệt độ tụt xuống khơng đủ khử trùng, vượt q làm cháy bông, giấy vượt qúa mức cho phép làm vỡ nhiệt kế thủy ngân tủ sấy + Khử trùng xong tắt công tắc điện đợi cho nhiệt độ hạ xuống 80 C mở tủ ra, không thay đổi nhiệt độ đột ngột làm nứt vỡ dụng cụ làm ảnh hưởng đến tính vô trùng dụng cụ + Các dụng cụ khử trung xong cất giữ chỗ kín, sạch, khơ Khơng bóc bỏ giấy - Khử trùng nước áp lực cao: Các dụng cụ chịu nhiệt ngồi khử trùng lò sấy khơ khử trùng nồi áp lực cao 3.2.2 Khử trùng mơi trường dinh dưỡng hóa chất Pha chế môi trường - Đọc kỹ công thức môi trường, chuẩn bị hoá chất dụng cụ liên quan - Tuân thủ công thức pha môi trường, cân, đong thành phần Đánh dấu vào công thức thành phần cân đong - Nếu môi trường phải đun nấu, ngồi thể tích nước theo cơng thức, nên bổ sung lượng nước nhỏ bù lại thể tích nước bị bay (khoản 15-20ml/lit mơi trường) - Mỗi hố chất xúc thìa riêng cân Cho chất cân lên đĩa (có giấy cân) cách từ từ tới vữa đủ Nắm vững cách sử dụng loại cân - Với thành phần có hàm lượng nhỏ nên pha dung dịch gốc (stock solution), tính tốn hàm lượng cần lấy bổ sung vào môi trường Đun môi trường - Nếu thành phần dễ hồ tan nước khơng cần đun, khuấy máy khuấy từ để chất hồ tan Với mơi trường thạch đun lò vi sóng Nếu khơng có lò vi sóng đun bếp, vừa đun vừa khuấy đũa thuỷ tinh đến môi trường sôi, thạch tan hết Chỉnh pH - Dùng máy đo pH để đo pH mơi trường (mơi trường có chứa chất dính nhớt phải dùng giấy đo pH) - Nếu hoá chất đạt tiêu chuẩn, thành phần cân đo xác sau pha mơi trường đạt giá trị pH cần có - Nếu pH sai khác lớn phải kiểm tra lại hoá chất (chủng loại, thời hạn sử dụng, ) q trình pha chế Cần thiết phải pha lại mơi trường - Nếu sai khác giá trị pH không lớn, điều chỉnh dung dịch kiềm axit loãng, việc điều chỉnh pH cần tiến hành thận trọng để sau chỉnh thể tích mơi trường khơng bị thay đổi ngồi phạm vi cho phép - Giá trị pH thấp cao làm ảnh hưởng đến tính chất mơi trường, pha chế mơi trường có pH axit kiềm cần đọc kỹ dẫn, khử trùng riêng thành phần chộn lại với sau khử trùng khử trùng thành phần pH trung tính sau dùng dung dịch kiềm axit để chỉnh pH (nhưng phải điều kiện vô trùng) - Sau khử trùng pH mơi trường thay đổi lại nên cần phải kiểm tra lại Khử trùng - Mơi trường dinh dưỡng hóa chất có trạng thái vật lý tính bền với nhiệt khác nên khử trùng phương pháp khác Khử trùng môi trường nồi hấp áp lực - Ngun tắc: Làm gia nhiệt mơi trường, hố chất dụng cụ nhờ nước bão hoà áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất tăng lên nhiệt độ tăng theo - Tác dụng phối hợp nhiệt độ cao áp suất đảm bảo cho việc khử trùng thực tốt Khi hấp áp lực tiêu diệt tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử vi sinh vật Đồng thời phân huỷ tốt enzyme - Các môi trường khử trùng nồi hấp áp lực rót đến mức khơng q nửa chiều cao dụng cụ đựng chúng Các dụng cụ chứa môi trường không vặn nắp chặt mà phải nới lỏng nút nút Nút phải làm cẩn thận, không lỏng không chặt, phải đảm bảo không cho vi sinh vật khơng khí nhiễm vào đồng thời phải đảm bảo cung cấp khơng khí vào mơi trường nuôi cấy Hơi nước khử trùng thiết phải qua nút vào bên dụng cụ để việc khử trùng đạt yêu cầu - Hiện có nhiều loại nồi khử trùng, thông dụng nồi điện có chế độ tính tự ngắt điện - Cách vận hành: Xem “Quy trình nồi hấp vô trùng” theo hãng cung cấp - Khi hết thời gian khử trùng phải đợi cho áp suất nồi cân với áp suất khí (nhiệt độ 1000C) mở nắp Nếu không, áp suất hạ đột ngột dễ dẫn đến tai nạn, môi trường dụng cụ sơi lên làm trào ngồi làm tác dụng vô trùng Khi mở nắp tránh để mặt thẳng diện với nồi tránh bị bỏng nước, lấy dụng cụ phải găng tay - Sau khử trùng dụng cụ, hoá chất, môi trường bảo quản nơi quy định Khử trùng với thành phần bền nhiệt - Phương pháp Pasteur: Đun nóng dung dịch 800C/15 phút làm nguội - Phương pháp Tyndal: Đun cách thủy dung dịch 30 phút, lặp lại lần, lần 24 Hai phương pháp diệt tế bào sinh dưỡng, không diệt bào tử kháng nhiệt - Khử trùng phiến lọc vi khuẩn: Dùng để tiệt trùng dung dịch có thành phần bền nhiệt như: vitamin, glucoza, Phiến lọc dụng cụ kèm theo phải khử trùng trước sử dụng, có dụng cụ lọc khuẩn khử trùng dùng lần IV AN TOÀN SINH HỌC Khái niệm an tồn sinh học Các phòng thí nghiệm sinh học, đặc biệt phòng thí nghiệm vi sinh vật mơi trường làm việc đặc biệt, môi trường mở, môi trường thực hành tác nhân sinh học vi khuẩn, nấm mốc, virus nhiều tác nhân khác gây bệnh cho người động vật Do vậy, phòng thí nghiệm sinh học tiềm ẩn nguy lây nhiễm bệnh cho người làm việc phòng thí nghiệm cộng đồng dân cư xung quanh Theo công bố, năm trước có nhiều trường hợp gây dịch bệnh thương hàn, bệnh tả, bệnh lở mồm long móng bệnh uốn ván có ngun nhân từ phòng thí nghiệm vi sinh vật y sinh Theo thống kê, có tới khoảng 72% bệnh nhiễm trùng lây nhiễm từ phòng thí nghiệm, bệnh nhiễm trùng tự nhiên chiếm khoảng 16% tất bệnh truyền nhiễm Các trường hợp mắc bệnh phòng thí nghiệm vi sinh vật y sinh học phần lớn liên quan đến việc thao tác phòng thí nghiệm khơng cách sử dụng miệng để hút pippette sử dụng kim tiêm không cách Theo Pike (1979), hiểu biết nguyên nhân gây bệnh, kỹ thuật thực hành phòng thí nghiệm tốt trang thiết bị đầy đủ, phù hợp ngăn cản hầu hết bệnh nhiễm trùng phòng thí nghiệm Do đó, Mỹ người ta bắt đầu xây dựng quy định, tiêu chuẩn hóa cơng tác phòng thí nghiệm y sinh học, hướng dẫn chi tiết kỹ thuật, thiết bị thực hành phòng thí nghiệm, cơng bố tác nhân gây bệnh địa ngoại lai để khắc phục tình trạng Sổ tay “Phân loại tác nhân dựa vào mối nguy hại” xem tài liệu tham khảo chung cho hoạt động phòng thí nghiệm có sử dụng tác nhân sinh học gây bệnh Mỹ Cơng nghệ sinh học đại có nhiều tiềm phát triển sống người, đáp ứng nhu cầu thiết yếu thực phẩm, nông nghiệp sức khỏe người Để tăng cường tính an tồn công nghệ sinh học, giảm tối thiểu mối đe dọa tiềm tàng tới đa dạng sinh học nguy ảnh hưởng đến sức khỏe, an toàn sinh học vấn đề đề cập Công ước Đa dạng Sinh học nhằm bảo vệ sức khỏe người khỏi tác động tiêu 10 - Sản xuất quanh năm: Q trình sản xuất tiến hành vào thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ Hạn chế vi nhân giống - Hạn chế chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật nay, tất trồng nhân giống thương phẩm vi nhân giống Nhiều trồng có giá trị kinh tế quý chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy tái sinh tế bào thực vật in vitro chưa giải đáp - Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm cao so với phương pháp truyền thống chiết, ghép nhân giống hạt - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây ni cấy mơ sai khác với mẹ ban đầu tượng biến dị tế bào sôma Kết khơng giữ đặc tính q mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp giai đoạn đầu nhân giống, sau có chiều hướng tăng lên nuôi cấy kéo dài tăng hàm lượng chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị cần lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu giống đồng mặt di truyền 5.2 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng tạo bệnh Trong nhiều trường hợp trồng bị nhiễm virus gây ảnh hưởng lớn đến sản xuất Ví dụ bệnh virus Tungro phát triển lúa làm thiệt hại nửa triệu thóc nhân dân Philippine năm 1971 Một đặc điểm trồng bị nhiễm bệnh virus khả lây lan nhanh xử lý hóa chất Phương pháp tái sinh từ mô phân sinh đỉnh cho phép tạo bệnh từ nguồn vật liệu nhiễm virus 41 - Năm 1949, Limmasets Cornuet phát virus phân bố không đồng thường khơng thấy có virus vùng đỉnh sinh trưởng - Năm 1952, Morel Martin tạo bệnh virus giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Ngày nay, kỹ thuật với số cải tiến trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus dùng rộng rãi nhiều loài trồng khác - Năm 1952, Morel Martin lần thực vi ghép in vitro thành công Theo Morel Martin, nồng độ virus thực vật giảm dần phận gần đỉnh sinh trưởng Riêng đỉnh sinh trưởng có độ virus cao Đỉnh sinh trởng có kích thước khoảng 0,01 – 0,1 mm khó khăn để tách nên kỹ thuật nuôi cấy mô thường phải lấy mẫu có kích thước lớn Nguồn vật liệu sử dụng cho nuôi cấy thường chồi đỉnh (chồi ngọn), chồi nách, chồi phát sinh từ rễ thân Trong thực tế, vật liệu nuôi cấy ban đầu nhiễm virus Tuy nhiên, tốc độ phân chia nhanh tế bào đỉnh sinh trưởng, kết hợp với chọn lọc, virus loại bỏ dần q trình ni cấy - Năm 1960, Morel thực bước ngoặt cách mạng sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhân nhanh loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật Kỹ thuật vi ghép sau ứng dụng rộng rãi tạo nguồn giống bệnh virus tương tự virus nhiều trồng nhân giống phương pháp vơ tính khác nhau, đặc biệt tạo giống ăn bệnh 5.3 Công nghệ phơi vơ tính hạt nhân tạo - Cơng nghệ phơi vơ tính: Ở thực vật tồn hai dạng phơi, phơi vơ tính phơi hữu tính Trong trường hợp phơi hữu tính, sau thụ tinh, hợp tử phát triển thành phơi gọi phơi hữu tính (zygotic embryo) Phơi hữu tính có cấu trúc phân cực rõ ràng tạo 42 thành hai miền sinh trưởng gồm miền sinh trưởng rễ miền sinh trưởng Quá trình nảy mầm hạt, hai miền sinh trưởng đồng thời phát triển để tạo thành Phơi vơ tính (somatic embryo) dạng phơi hình thành từ tế bào soma khơng qua thụ tinh có chất di truyền hồn tồn giống với tế bào soma phát sinh Trong tự nhiên, phơi vơ tính tồn với phơi hữu tính hạt nhiều loài thực vật, chúng hoàn toàn giống phơi hữu tính mặt hình thái, q trình phát triển sinh lý khác nguồn gốc di truyền Trong điều kiện nhân tạo, nhiều loài cây, người ta nhận thấy tế bào phân chia vô tổ chức tạo nên mô sẹo (callus) ni cấy Có thể thay đổi hướng phát triển chúng để tạo phơi vơ tính với bước phát sinh hình thái giống với phơi hữu tính Điểm khác biệt so với phơi hữu tính phơi hữu tính ln kèm với nội nhũ quan dự trữ lượng chất dinh dưỡng phục vụ cho trình mầm sau phơi vơ tính khơng có nội nhũ nên gieo cấy điều kiện bình thường khơng khó phát triển thành Khả tạo phơi vơ tính ni cấy mơ thực vật phụ thuộc vào điều kiện vật lý, hóa học phụ thuộc lớn vào giống (cultivars), dòng (strains) lồi Khả liên quan đến gene chuyên trách Cơng nghệ tạo phơi vơ tính có vai trò quan trọng việc tạo quần thể đồng hình thái di truyền, hệ số nhân giống cao, có khả cơng nghiệp hố để sản xuất số lượng lớn Quy trình sản xuất phơi vơ tính bao gồm bước sau: + Chọn mẫu nuôi cấy môi trường tạo phôi: mẫu lựa chọn khác tùy loại trồng sau vơ trùng mẫu hóa chất cắt thành phận nhỏ nuôi cấy môi trường tạo phôi điều kiện nhiệt độ ánh sáng phù hợp Phơi vơ tính hình thành sau – tuần tùy thuộc vào loại trồng mẫu nuôi cấy 43 + Nhân nhanh: đưa cụm phơi hình thành bước sang môi trường nhân nhanh (môi trường lỏng), chọn lọc phơi có kích thước phù hợp cách lọc dung dịch ni cấy chứa phơi qua lưới lọc có kích thước phù hợp + Tái sinh phơi thành hồn chỉnh: chuyển phôi sang môi trường tạo chồi để phát triển thành hồn chỉnh - Cơng nghệ tạo hạt nhân tạo: Hạt nhân tạo (synthetic seed artificial seed) hạt sản xuất điều kiện phòng thí nghiệm cơng nghiệp hố (ngồi thể sống) Hạt nhân tạo cấu tạo gồm phần phơi hạt phần vỏ bọc bên ngồi Phơi hạt nhân tạo tùy mục đích sử dụng lấy từ nguồn khác thông thường phôi vơ tính sản xuất phương pháp ni cấy mơ Mỗi hạt thường có phơi sàng lọc kích thước để tạo đồng Phần vỏ hạt bọc bên ngồi phơi hạt bao gồm số thành phần dinh dưỡng chủ yếu giúp cho phôi nảy mầm sinh trưởng ban đầu Vỏ hạt đóng vai trò thay chức nội nhũ hạt tự nhiên Thành phần chủ yếu vỏ thành phần dinh dưỡng mơi trường MS có chứa khống đa lượng, vi lượng, nước dừa, chất sinh trưởng, đường… chất kết dính sinh học Chất kết dính thường polymer tự nhiên, đó, alginate chiết suất từ rong biển chất kết dính sử dụng phổ biến có hiệu Quy trình tạo hạt nhân tạo bao gồm bước sau: (1) tạo phơi vơ tính, (2) tạo hạt nhân tạo (3) bảo quản hạt kỹ thuật gieo hạt 5.4 Nuôi cấy bao phấn chọn tạo giống Trong công tác giống trồng, việc tạo giống chủng cải tiến thực cách tiến hành tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều hệ (5-7 hệ) chọn lọc dòng mong muốn Việc tốn nhiều thời gian công sức Năm 1934, Stow phát phát triển khác thường hạt phấn thành cấu trúc giống túi phơi số lồi thực vật Hiện 44 tượng cho thấy hạt phấn có khả phân chia để hình thành tế bào mơ sinh trưởng điều kiện thích hợp chúng tiếp tục phát triển thành đơn bội Đây sở phương pháp nuôi cấy hạt phấn bao phấn Nuôi cấy bao phấn kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục môi trường dinh dưỡng nhân tạo để tạo đơn bội Kết hợp với xử lý colchicine, số lượng nhiễm sắc thể đơn bội nhân đôi để tạo lưỡng bội đồng hợp hoàn toàn toàn, gọi thể đơn bội kép Việc nuôi cấy bao phấn có ích nhà chọn giống hệ đơn bội kép tạo hệ sử dụng làm dòng tự thụ phấn giao phấn nên rút ngắn nhiều thời gian công tác chọn tạo giống so với phương pháp truyền thống, lưỡng bội tạo đồng hợp tử hoàn toàn phương pháp truyền thống sau nhiều hệ có tồn dư thể dị hợp Hơn nữa, phương pháp nuôi cấy bao phấn, gene lặn có hội biểu thành kiểu hình nên thuận lợi cho công tác chọn lọc Giá trị đơn bội nghiên cứu di truyền chọn giống người ta biết đến từ lâu Kể từ Blakeslee (1921) mô tả đơn bội tự nhiên Datura stramonium, đơn bội tự nhiên tìm thấy nhiều loại khác Tuy đơn bội tự nhiên xuất cách ngẫu nhiên với tần suất thấp đáp ứng yêu cầu nghiên cứu chọn giống Lần giới, hai nhà khoa học Ấn Độ Guha Maheshwari (1967), thành công việc tạo hàng loạt đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro cà Datura innoxia Ngay sau đó, đơn bội tạo nuôi cấy bao phấn hàng loạt loại trồng khác Các nhà khoa học tìm yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thành cơng q trình ni cấy ảnh hưởng kiểu gen, giai đoạn phát triển hạt phấn điều kiện môi trường nuôi cấy Quy trình ni cấy bao phấn bao gồm bước sau: 45 + Chọn bao phấn: bao phấn thích hợp có chứa hạt phấn thể nhân đến sau lần nguyên phân thứ Bao phấn hoa cho kết tốt bao phấn hoa muộn + Xử lý nụ hoa: nụ hoa sau cắt khỏi mẹ trước tách bao phấn cần xử lý nhiệt độ thích hợp nhằm kích thích phân chia hạt phấn + Ni cấy mơi trường thích hợp, điều chỉnh nhiệt độ ánh sáng phù hợp để tạo mô sẹo tạo trực tiếp qua phôi gián tiếp thông qua mô sẹo Cây sau chuyển qua mơi trường rễ + Chọn lọc đơn bội: tất tái sinh nuôi cấy bao phấn đề đơn bội mơ sẹo phơi lưỡng bội phát sinh từ tế bào vỏ bao phấn cần phải chọn lọc đơn bội nhiều phương pháp làm tiêu xác định số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA tế bào, so sánh hình thái, khả sinh trưởng… + Lưỡng bội hóa thể đơn bội xử lý cochicine liều lượng phù hợp Nuôi cấy bao phấn áp dụng thành công nhiều đối tượng Theo Hu Zhang (1985), đơn bội có nguồn gốc hạt phấn tạo 216 lồi thực vật Thơng qua ni cấy bao phấn tạo nhiều giống lúa chủng Khao 85, Khao 1107, VH2 Đặc biệt, thông qua chọn dòng tế bào soma thu giống DR1, DR2 DR3 mở rộng quy mô sản xuất Tuy nhiên, hạn chế việc áp dụng rộng rãi phương pháp khả nuôi cấy khó tính đặc thù cao kiểu gen Ví dụ, nhà chọn giống lúa Indica sử dụng kỹ thuật có hiệu nhà chọn giống lúa Japonica kiểu gene Indica khó ni cấy, hạt phấn bị ảnh hưởng giai đoạn phát triển bao phấn, điều kiện sinh lý cho phấn, điều kiện xử lý trước nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy hiệu lưỡng bội hố colchicine 46 Hình Tạo giống lúa công nghệ nuôi cấy bao phấn Ngồi ni cấy bao phấn, nhà khoa học có thành cơng lớn việc ni cấy nỗn chưa thụ tinh, ni cấy hạt phấn tách rời Kỹ thuật tạo đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử đại bào tử phát triển thành ni hạt phấn, nỗn cho phép nhanh chóng tạo hàng loạt đơn bội phục vụ đắc lực cho mục đích nghiên cứu di truyền tạo giống trồng 5.5 Nuôi cấy dịch huyền phù nồi lên men Trước đây, nồi lên men sử dụng chủ yếu công nghệ vi sinh Trên sở thiết bị đó, với số cải tiến, nhiều loại mơ sẹo, phơi vơ tính, thể chồi, cụm chồi, củ nhỏ nuôi cấy thành công nồi lên men Phơi vơ tính cà phê sản xuất thành cơng Brazil nồi lên men dung tích – lít Nồi vận hành theo nguyên tắc bình lên men sục khí Mỗi mẻ thu – triệu phơi vơ tính cà phê Cụm chồi dưa đưa vào sản xuất thành cơng với bình lên men 10 lít Indonesia Củ khoai tây siêu bi (microtuber) có kích thước nhỏ hạt ngơ, hồn tồn bệnh virus công ty Microtuber Inc (Mỹ) sản xuất thành công nồi lên men Trong nồi lên men, đoạn thân kích thích rễ tạo củ nhỏ Q trình tạo củ hồn tồn khơng cần chiếu sáng 47 Đặc biệt, nay, nuôi cấy dịch huyền phù mô tế bào thực vật ứng dụng rộng rãi sản xuất hợp chất sinh học có giá trị Trong lĩnh vực ứng dụng này, nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có ưu điểm so với phương pháp truyền thống sản xuất cách có định hướng, theo quy mô công nghiệp, khối lượng sản phẩm lớn, không phụ thuộc vào mùa vụ; tỷ lệ phần trăm khối lượng khô hợp chất thứ cấp cao so với nguyên liệu thực vật thu hái tự nhiên; khơng tốn nhiều diện tích thu sinh khối tế bào lớn thời gian ngắn Nhiều hợp chất sinh học từ thực vật sản xuất thành công nhờ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật hệ thống lên men (Bảng.1.) Bảng Một số hợp chất sinh học sản xuất nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật hệ thống lên men Hợp chất Thực vật sử dụng nuôi cấy dịch huyền phù Diosgenin Cây Củ nâu (Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb) Codein morphin Cây Anh túc (Papaver somniferum) Steviol Cây Cỏ (Stevia rebaudiana) Taxol dẫn xuất taxane Cây Thông đỏ (Taxus brevifolia) Scopolamine hyoscyamine Cây Scopolia japonica Saponin sapogenin Nhân sâm (Panax ginseng) Betalaine Cây củ cải đỏ (Beta vulgaris) Thực tế, số dược liệu quý khó trồng cho hàm lượng chất có giá trị cao sinh khối thấp nên nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật công cụ để sản xuất chất hoạt tính sinh học Cơng nghệ bao gồm bước sau: - Chọn lọc loài thực vật giống trồng sản xuất chất có giá trị thương mại 48 - Nuôi cấy tế bào, mô quan tách rời in vitro tạo sinh khối tế bào - Gây đột biến chọn dòng tế bào sơma có khả tạo sinh khối lớn, có hàm lượng hoạt chất cao - Chiết rút, thu hồi chất hoạt tính từ sinh khối Cho đến nay, có số q trình cơng nghệ ứng dụng sản xuất quy mô pilot công nghiệp Hầu hết bioreactor nuôi cấy tế bào thực vật nghiên cứu cải tiến từ loại nồi lên men sử dụng nuôi cấy tế bào vi sinh Mặc dù nhà khoa học đạt số thành công sản xuất dược chất cơng nghệ bioreactor phải tiếp tục cải tiến để nâng cao suất, đơn giản hoá thiết bị để giảm giá thành sản xuất Hiện bioreactor sử dụng để sản xuất chất có giá trị cao, đắt tiền hợp chất sản xuất đường khác Gần hướng phát triển gọi canh tác phân tử hình thành, trồng xem loại bioreactor để sản xuất chất quý Bước đầu, gen liên quan đến dược liệu chế phẩm công nghiệp vacxin, kháng thể, enzym từ người, động vật, vi sinh vật chuyển vào thực vật, tạo trồng chuyển gen có khả tăng tạo sinh dược đồng ruộng nhà kính 5.6 Kỹ thuật chọn tạo biến dị tế bào sôma khả ứng dụng Biến dị tế bào sôma - tượng chung phổ biến xảy nuôi cấy mô in vitro Căn vào quy luật Vavilốp, điều kiện môi trường giống quan sát thấy biến dị di truyền giống loài gần phân loại Số liệu 30 năm qua cho thấy mô tế bào tách rời, nuôi cấy mơi trường nhân tạo nguồn khơng có giới hạn biến dị di truyền Larkin Scowcroft (1981) đưa khái niệm biến dị tế bào sôma làm tên gọi chung cho loại biến dị 49 Nguồn gốc biến dị tế bào sôma Những thay đổi di truyền xảy trước nuôi cấy mơ in vitro: Trong q trình phát triển cá thể, phân hố già hố mơ tế bào số thay đổi di truyền xảy tích luỹ tế bào sơma (D'amato, 1985) Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, tái sinh từ tế bào sôma đột biến Các nhà khoa học đưa khái niệm automutagenesis - tự đột biến (đột biến xảy không tác nhân từ bên gây nên) De Vries (1901) - người khởi xướng học thuyết đột biến cho bị đột biến tái sinh từ hạt già (có nhiều đột biến tiềm ẩn từ trước hạt già) Ba mươi năm sau, Nawacin chứng minh đột biến hạt già chất tham gia trình trao đổi chất sản phẩm cặn bã có hạt gây nên Các chất là: hợp chất chứa lưu huỳnh, amin, amino axit, amid, aldehyde, alkloide, phenol, quinone, axit nucleic sản phẩm khác Nguyên nhân gây đột biến cấu trúc bình thường hạt tế bào bị phá vỡ - enzym tiếp xúc với chất tạo sản phẩm đột biến Tuỳ theo phương thức nuôi cấy tế bào sôma, người ta phân biệt loại biến dị đây: - Biến dị dòng tế bào mơ sẹo (callusoclonal variation): biến dị tái sinh từ mô sẹo (callus) - Biến dị dòng tế bào trần (protoclonal variation)-khi biến dị tái sinh từ tế bào trần Ngoài Evans cộng (1984) đưa khái niệm "biến dị giao tử" (gameto-clonal variation) tái sinh từ tế bào sinh dục (gamete) Những biến dị di truyền xảy phát trình ni cấy in vitro gọi chung đột biến tế bào dòng Những thay đổi di truyền xảy trình in vitro: 50 Một nguồn biến dị tế bào sôma quan trọng thay đổi máy di truyền xảy nuôi cấy tạo mô sẹo phân hoá quan in vitro Đến nhà khoa học phát hai nguyên nhân dẫn đến biến dị (đột biến) xảy tế bào nuôi cấy in vitro: - Tế bào nuôi chịu tác động trực tiếp chất hố học mơi trường ni cấy - Trong điều kiện in vitro, gen di động (transposon) hay gọi gen nhảy hoạt động mạnh, gen nhảy phát lần ngô năm 1963 Người phát minh gen nhảy (transposon) McClintocr, bà giải thưởng Nobel năm 1983 nhờ phát minh Đến nay, khoa học xác định gen nhảy tồn hầu hết trồng Hoạt động chúng phụ thuộc vào kiểu gen điều kiện môi trường Trong cấy mô, gen di chuyển tích cực, cài vào gen nhiễm sắc thể gây tần số đột biến cao Chroqui Bercetch (1985) cho biết auxin gây đa bội hố bên tế bào ni cấy (endopolyploidization) Oono (1982) nuôi cấy mô sẹo từ hạt lúa tái sinh từ mơ sẹo cho biết BAP có nồng độ 30 mg/l tạo tần số đột biến lớn gấp 50 lần so với BAP nồng độ mg/l Mức độ đột biến tế bào sôma lớn đến mức tần số đột biến chất đột biến gây không cao (Larkin and Scowcroff, 1981) Orton (1984) cho biết thời gian nuôi cấy môi trường dinh dưỡng, hệ gen tế bào thực vật trải qua q trình cải tổ nhanh chóng phát thay đổi số lượng, cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến gen Tần số đột biến gen nhiều cao (10-2-10-1) tính theo locus Thay đổi di truyền phổ biến xảy tế bào nuôi cấy đa bội thể Sau mơ ni cấy, nhân tế bào trải qua trình nội phân (endoreduplication) làm số lượng nhiễm sắc thể tế bào tăng lên gấp đôi không xẩy phân chia tế bào Kết số lượng nhiễm sắc thể tế bào tăng lên Quá trình nội phân nhiễm sắc thể trước phân bào 51 cho phép người ta nhận lưỡng bội đồng hợp (dihaploid) từ hạt phấn đơn bội nuôi cấy bao phấn Phổ rộng biến đổi nhiễm sắc thể quan sát thấy nhiều loài trồng khác (Murashige Nakano, 1967; Sacristan Melchers, 1960; Sunderland 1973; Nishi Mitsuoka, 1969) Nghiên cứu tế bào học cho thấy 10% số lồi phân hố quan khơng kèm theo tượng nội phân nhiễm sắc thể, 90% số lồi phân hố quan có kèm theo nội phân nhiễm sắc thể 5.7 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần (protoplast) thao tác di truyền mức tế bào Tách nuôi tế bào trần Khác với tế bào vi sinh tế bào động vật, tế bào thực vật có thành tế bào cứng tạo nhiều loại polyme khác Thành tế bào có chức học, tạo khung xương tế bào hệ màng liên kết tế bào với Thành phần hoá học tế bào phức tạp Cellulose thành phần chủ yếu màng tế bào thực vật Cơng thức hố học tổng qt cellulose (C6H15O5)n Phân tử cellulose có hình sợi dài, chí dài với liên kết hàng nghìn phân tử đường đơn với Ngồi cellulose có hemicellulose, pectin, lignin, số chất béo chất khoáng, pectin đóng vai trò quan trọng liên kết tế bào với Tế bào trần (protoplast) tế bào loại bỏ màng tế bào (một lớp polyme bao bọc tế bào) màng liên kết tế bào Các enzym đóng vai trò chủ yếu phân huỷ màng tế bào tạo tế bào trần cellulase pectinase Tế bào sau bị lớp màng cứng có dạng hình cầu áp suất thẩm thấu phù hợp môi trường Tế bào trần tách từ mô quan khác lá, rễ, mơ sẹo ni cấy in vitro (hình - tách nuôi tế bào trần từ mô cải dầu) 52 Ưu kỹ thuật tách nuôi cấy tế bào trần tế bào khơng có màng cứng, trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu đơn vị thể tích mơi trường cao (đạt 106 tế bào/1 ml mơi trường) Tế bào trần số trồng có khả tái sinh mạnh, ví dụ tế bào mô thịt thuốc lá, cải dầu Bằng thao tác di truyền tế bào trần dễ dàng tạo tế bào biến đổi gen Tế bào với kiểu gen biến đổi bảo tồn tái sinh tế bào thành hoàn chỉnh Một số ứng dụng kỹ thuật tế bào trần - Lai xa: Người ta dễ dàng lai tế bào trần khác loài với nhau: khoai tây với cà chua, cam ba với cam tạo lai khác loài - Lai tế bào chất tạo dòng đồng đẳng bất dục: Phương pháp tạo dòng đồng đẳng bất dục tóm tắt sau: - Tạo quần thể tế bào trần từ dòng củng cố bất dục (dòng B tiềm năng) với tế bào chất bình thường - Tạo quần thể tế bào trần từ dòng bất dục đực tế bào chất (dòng CMS) với tế bào chất bất dục - Phá nhân dòng CMS chiếu xạ hoá chất - Dung hợp (hay lai) hai loại tế bào trần với tái sinh tế bào lai thành - Chọn lọc từ tế bào lai mang tồn gen nhân dòng B tế bào chất dòng CMS Cây chọn lọc bất dục đực dòng A đồng đẳng bất dục đực dòng B, giống hệt gen nhân, dòng A khác dòng B tính trạng bất dục đực tế bào chất Nhân dòng lai thông qua thụ phấn phấn dòng B để tạo dòng A Dòng B tiềm trở thành dòng B củng cố (maintainer) dòng A Phương pháp cho phép nhanh chóng tạo dòng 53 đồng đẳng bất dục phục vụ cho tạo giống ưu lai Nhưng kỹ thuật chưa ứng dụng với nhiều kinh tế quan trọng lúa, ngô 5.8 Ứng dụng bảo tồn nguồn gene thực vật in vitro Mục đính bảo quản nguồn tài nguyên di truyền thực vật trì phong phú, đa dạng di truyền loài, loài hệ sinh thái nói chung, để qua tìm hiểu đặc trưng sinh trưởng phát triển, làm sở cho việc khai thác sử dụng chúng cho cho tương lai (Khanna cộng sự,1991) Các nguồn gene trồng bảo quản phương pháp bảo quản hạt, bảo quản chỗ việc trì nguồn gene mẹ vườn sản xuất Đối với bảo quản nguồn gene in vitro, nguồn gene bảo quản trì tồn vật chất di truyền thông qua bảo quản phận cây, khối tế bào quan sinh sản Bảo tồn nguồn gene in vitro có nhiều ưu điểm trì thời gian dài, có khả cung cấp nguồn gene bệnh cho sản xuất mục tiêu nghiên cứu; vật liệu bảo tồn gọn nhẹ, dễ vận chuyển, tiết kiệm khơng gian; dễ dàng điều tiết môi trường phù hợp với điều kiện bảo tồn nên không phụ thuộc vào mùa vụ Tuy nhiên, hạn chế lớn bảo tồn in vitro đòi hỏi phải có hiểu biết kỹ thuật yêu cầu đầu tư thiết bị chi phí lớn, tốn nên áp dụng trung tâm khoa học sở sản xuất tiên tiến Tùy theo thời gian bảo quản dài hay ngắn mục đích bảo quản, mẫu đưa bảo quản đa dạng, tế bào đơn, tế bào huyền phù, mô sẹo, thân, rễ, phôi non hoàn chỉnh Trong bảo quản ngắn hạn, mẫu bảo quản quan sinh sản, phôi, chồi, mầm Mẫu bảo quản phải khỏe mạnh, làm bệnh đưa vào môi trường bảo quản sử dụng phương pháp ức chế sinh trưởng khác tùy thuộc vào chất trồng bảo quản nhiệt độ thấp (6 – 18oC), bổ sung chất ức chế sinh trưởng (abcisic acid), bổ sung chất làm giảm áp suất thẩm thấu dinh dưỡng oxygene (manitol, dầu phủ tăng nồng độ sucruse môi trường nuôi cấy) để làm giảm khả 54 sinh trưởng tế bào giảm hàm lượng chất dinh dưỡng Trong trường hợp bảo quản dài hạn, mẫu sử dụng bao gồm phôi, mô, tế bào Mẫu xử lý với prolin 5–10% manitol 3-6%, xử lý chống đông hóa chất DMSO 1M có thêm glycerol 1M sucrose 2M đưa vào môi trường bảo quản nhiệt độ -180 đến -196oC Ở điều kiện này, trình trao đổi chất, sinh trưởng, phát triển ngưng trệ Thời gian bảo quản từ 20 đến 30 năm 55 ... sinh học gây bệnh Mỹ Cơng nghệ sinh học đại có nhiều tiềm phát triển sống người, đáp ứng nhu cầu thi t yếu thực phẩm, nông nghiệp sức khỏe người Để tăng cường tính an tồn công nghệ sinh học, ... BÀO THỰC VẬT CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÁI NIỆM Trong công nghệ sinh học thực vật, nuôi cấy mô (tissue culture) khái niệm chung q trình ni cấy ống nghiệm từ nguyên liệu thực vật... sinh học nguy hại, sở nghiên cứu triển khai công nghệ, sở sản xuất phòng khám bệnh, chẩn đoán bệnh thuộc sở y tế, bệnh viện… Căn vào kết đánh giá an toàn sinh học phân chia tác nhân sinh học thuộc