BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG I HC Y H NI NGUYN TH H đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán viêm phổi cộng đồng ë trỴ em Chun ngành : Nhi – Hơ hấp Mã số : CK62721610 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP II Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Yến TS Đoàn Mai Thanh HÀ NỘI - 2019 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ VIÊM PHỔI MẮC PHẢI TẠI CỘNG ĐỒNG 1.1.1 Khái niệm .3 1.1.2 Sinh bệnh học viêm phổi 1.1.3 Căn nguyên gây viêm phổi trẻ em 1.1.4 Chẩn đoán 1.2 TỔNG QUAN VỀ POLYMERASE CHAIN REACTION 1.2.1 Khái quát PCR 1.2.2 Real-time PCR gì? .9 1.2.3 PCR đa mồi 10 1.2.4 Nguyên tắc PCR 10 1.2.5 Kỹ thuật tiến hành 11 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 13 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn .15 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 16 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.1.4 Thời gian nghiên cứu 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu .17 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 17 2.2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.4 Kỹ thuật thu thập thông tin 25 2.3 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 26 2.4 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 26 2.5 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 27 Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 CÁC THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .28 3.2 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG CAP 29 3.2.1 Phân bố bệnh nhân theo lý vào viện .29 3.2.2 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng nhập viện .29 3.2.3 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng thực thể phổi nhập viện .30 3.2.4 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng phổi nhập viện 30 3.2.5 Đặc điểm X quang phổi .30 3.2.6 Đặc điểm huyết học .31 3.2.7 Đặc điểm yếu tố thời gian theo nhóm tuổi 31 3.2.8 Kết xét nghiệm mPCR 32 3.2.9 Kết nuôi cấy dịch tỵ hầu .32 Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN .33 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 34 DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ .34 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Phân bố tuổi bệnh nhân nghiên cứu 28 Bảng 3.2: Phân bố bệnh nhân theo lý vào viện 29 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng nhập viện 29 Bảng 3.4 Đặc điểm triệu chứng thực thể phổi theo nhóm nghiên cứu 30 Bảng 3.5 Đặc điểm triệu chứng ngồi phổi theo nhóm nghiên cứu .30 Bảng 3.6: Đặc điểm X quang phổi 30 Bảng 3.7 Đặc điểm biến đổi huyết học theo nhóm nghiên cứu 31 Bảng 3.8 Đặc điểm yếu tố thời gian theo nhóm tuổi 31 Bảng 3.9: Kết xét nghiệm mPCR 32 Bảng 3.10: Tải lượng vi khuẩn phế cầu qua xét nghiệm mPCR 32 Bảng 3.11: Kết nuôi cấy dịch tỵ hầu .32 Bảng 3.12: So sánh kết xét nghiệm mPCR nuổi cấy dịch tỵ hầu 32 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Phân bố giới bệnh nhi nghiên cứu 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi mắc phải cộng đồng (CAP) bệnh phổ biến trẻ em, đặc biệt nước phát triển Trên toàn giới, CAP nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trẻ tuổi Các yếu tố làm tăng tỷ lệ mắc mức độ nghiêm trọng bệnh bao gồm sinh non, suy dinh dưỡng, tình trạng kinh tế xã hội thấp, tiếp xúc với khói thuốc chăm sóc y tế [1] Theo thống kê WHO (năm 2000) trung bình trẻ mắc 0,28 đợt/trẻ/năm Các nước phát triển có tỷ lệ trẻ tuổi mắc CAP cao gấp lần nước phát triển, Việt Nam đứng hàng thứ số nước có mắc CAP cao giới [2] Ước tính tử vong viêm phổi trẻ tuổi giới 0,26 trẻ/1000 trẻ sơ sinh sống Như hàng năm có khoảng 1,8 triệu trẻ tử vong viêm phổi (không kể viêm phổi sơ sinh) [3] Tại Na Uy, nghiên cứu tiến hành từ năm 2002 – 2005 thấy, 1000 trẻ tuổi có 32,8% trẻ mắc CAP, tỉ lệ trẻ tuổi 42,1% Tại Anh, tỉ lệ trẻ tuổi mắc CAP 1000 trẻ 33,8%, tỉ lệ phải nhập viện 28,7% [5] Tại Việt Nam, theo số liệu báo cáo năm 2004 WHO UNICEF, năm có khoảng 4500 trẻ tuổi tử vong viêm phổi, chiếm 12% [4] Nguyên nhân gây CAP có nhiều vi khuẩn, virus, ký sinh trùng, nấm…Tại nước phát triển, vi khuẩn nguyên gây bệnh phổ biến [2] Nguyên nhân cụ thể phụ thuộc nhiều vào độ tuổi trẻ Nhiễm virus Streptococcus pneumoniae phổ biến trẻ em tuổi mẫu giáo, Mycoplasma pneumoniae thường gặp trẻ lớn [1] Tần suất trẻ bị CAP phế cầu gặp biến chứng hoại tử, tràn dịch màng phổi / tràn dịch màng phổi phức tạp áp xe phổi dường gia tăng [5] Việc chẩn đoán xác định viêm phổi phế cầu chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng xét nghiệm đờm, ni cấy xét nghiệm đặc hiệu để xác định tác nhân gây bệnh Tuy nhiên việc nuôi cấy dịch đường hô hấp để phân lập vi khuẩn thường nhiều thời gian phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển thời gian lưu giữ bệnh phẩm Kỹ thuật Real-time PCR đa mồi kỹ thuật nhân DNA ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Nhờ chu kỳ nhiệt mà đoạn DNA đích nhân theo cấp số nhân để sau 30 đến 40 chu kỳ, đoạn DNA đích nhân thành hàng tỷ dễ dàng phát Nhờ khuếch đại phát nên kỹ thuật có độ nhạy cao, giới hạn thấp phát phân tử Chính vậy, real - time PCR đa mồi công cụ hữu dụng phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh Trong kỹ thuật nuôi cấy, người ta phân lập vi khuẩn khuếch đại gen từ phát vi sinh vật gây bệnh, xét nghiệm real - time PCR đa mồi phát tác nhân gây bệnh khơng khác ni cấy khơng phải nuôi cấy gen mà đoạn gen đặc hiệu vi sinh vật gây bệnh (không phải môi trường phân lập nuôi cấy phức tạp mà đơn giản ống chứa dung dịch phản ứng – PCR mix) thành hàng tỷ sau định danh xem có vi sinh vật muốn tìm khơng dựa vào kích thước và/hay trình tự nucleotide Do độ đặc hiệu real – time PCR đa mồi khơng khác nuôi cấy Kỹ thuật real – time PCR đa mồi có ưu điểm vượt trội so với xét nghiệm vi sinh kết có sớm vòng kể từ bắt đầu làm xét nghiệm xét nghiệm vi sinh cần từ 48 đến 72 giờ, chẩn đốn vi khuẩn gây bệnh mà phương pháp nuôi cấy dịch tỵ hầu cho kết âm tính bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước đó, đồng thời real – time PCR đa mồi phát lúc nhiều loại tác nhân gây bệnh Vậy, phương pháp Real – time PCR đa mồi có thực hữu ích việc tìm nguyên gây viêm phổi cộng đồng ? Xuất phát từ vấn đề này, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng giá trị kỹ thuật real – time PCR đa mồi chẩn đoán viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh nhi từ tháng đến tuổi bệnh viện Nhi trung ương” nhằm hai mục tiêu: Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng viêm phổi mắc phải cộng đồng trẻ em Xác định ngưỡng phát phế cầu thích hợp để ứng dụng chẩn đốn viêm phổi cộng đồng kỹ thuật real – time PCR đa mồi Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ VIÊM PHỔI MẮC PHẢI TẠI CỘNG ĐỒNG 1.1.1 Khái niệm Viêm phổi tình trạng tổn thương viêm nhu mô phổi bao gồm viêm phế nang, túi phế nang, tổ chức liên kết kẽ viêm tiểu phế quản tận [6] Viêm phổi lan toả hai bên phổi tập trung thuỳ phổi Viêm phổi chia làm loại: viêm phổi mắc phải cộng đồng (community-acquired pneumonia, CAP), viêm phổi mắc phải bệnh viện (hospital-acquired pneumonia, HAP), viêm phổi liên quan đến thở máy (ventilator acquired pneumonia, VAP), viêm phổi liên quan đến chăm sóc y tế (health care-acquired pneumonia, HCAP) Viêm phổi cộng đồng định nghĩa viêm phổi mắc phải bệnh nhân sống ngồi bệnh viện khơng sử dụng phương tiện chăm sóc dài ngày.Theo hướng dẫn y tế viêm phổi cộng đồng viêm phổi cộng đồng 48 nằm [7] 1.1.2 Sinh bệnh học viêm phổi 1.1.2.1 Các đường vào phổi vi sinh vật Đường hô hấp : Do hít phải mơi trường khơng khí: từ hạt nước bọt (chứa vi sinh vật) người mang mầm bệnh hắt hơi, ho từ hạt bụi có chứa vi khuẩn động vật (nhiễm Chlamydia psittaci), từ hạt nước chứa Legionella [8] Do hít phải vi khuẩn từ ổ nhiễm đường hô hấp trên: viêm nhiễm vùng tai mũi họng, viêm lợi, viêm xoang… Đường máu: vi sinh vật theo đường máu từ ổ nhiễm trùng ban đầu tới phổi Đường cận phổi 1.1.2.2 Cơ chế bảo vệ máy hô hấp - Cơ chế học:  Lông chuyển : giúp làm đường thở thường xuyên [9] Chất nhầy : ngưng kết hạt bụi , vi sinh vật ngăn cản tiếp xúc với chất kích thích hít vào niêm mạc đường thở [99] - Cơ chế bảo vệ tế bào dịch thể  Các globulin miễn dịch : IgA, IgG, IGM  Lactoferrin : ức chế phát triển vi khuẩn  Lysozyme: chống lại xâm nhập nấm, vi khuẩn  Surfactan: bất hoạt vi khuẩn, tăng cường khả làm việc bạch cầu  Peroxidase  Các yếu tố khác:, bổ thể, chất chống oxy hóa, fibronectin góp phần làm bất hoạt, tan tác nhân gây bệnh  Miễn dịch tế bào : kháng nguyên xâm nhập vào đường hô hấp bị đại thực bào bắt giữ, sau trình diện cấu trúc với tế bào CD4 Các tế bào tiết IL-2 kích thích tăng sinh tế bào lympho B tạo kháng thể phần tạo dòng tế bào nhớ [10] 1.1.2.3 Bệnh sinh Ở trẻ em viêm phổi vi khuẩn thường thứ phát sau nhiễm virus đường hô hấp nhiễm virus làm rối loạn chế phòng vệ đường hơ hấp chế : - Làm biến đổi chất chất tiết bình thường đường hơ hấp - Ngăn cản thực bào - Biến đổi khuẩn giới đường hô hấp - Làm tổn thương tạm thời hệ biểu mơ có lơng chuyển niêm mạc khí đạo Viêm phổi thùy: 24h đầu giai đoạn sung huyết, đặc trưng sung huyết mạch máu phù nề phế nang, có diện vi khuẩn bạch cầu đa nhân trung tính Hai, ba ngày sau giai đoạn gan hóa đỏ, đặc trưng xuất nhiều hồng cầu, bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào biểu mơ bong sợi fibrin bên phế nang Hai, ba ngày sau giai đoạn gan hóa xám có chất tiết mủ fibrin, hồng cầu bị phân hủy hemosiderin Giai đoạn cuối phục hồi cấu trúc phổi Q trình xuất tiết fibrin xảy màng phổi tạo tiếng cọ màng phổi dẫn đến dày dính màng phổi Phế quản phế viêm: Là tổn thương đặc phổi đám, ảnh hưởng đến nhiều thùy Chất xuất tiết chứa bạch cầu đa nhân trung tính phế nang tiểu phế quản, phế quản gần Viêm phổi kẽ: Là tổn thương viêm đám lan tỏa ảnh hưởng đến tổ chức kẽ, đặc trưng thâm nhiễm lympho, đại thực bào tương bào Phế nang không chứa chất xuất tiết có màng hyaline giàu protein lót bên lòng phế nang Bội nhiễm gây kiểu hỗn hợp viêm bên phế nang tổ chức kẽ Viêm phổi dạng kê: Là tổn thương kín đáo nhiều lan tỏa vi khuẩn phổi qua đường máu lao kê, histoplasmosis, coccidioidomycosis biểu tổn thương hạt hoại tử casein ổ Nhiễm herpes virus, cytomegalvirus virus varicella-zoster gây tổn thương xuất huyết hoại tử cấp nặng bệnh nhân suy giảm miễn dịch [11] 1.1.3 Căn nguyên gây viêm phổi trẻ em Viêm phổi trẻ em vi khuẩn, virus vi sinh vật khác Theo WHO, nguyên nhân hay gặp là: Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza Respiratory Synticyal virus Ở trẻ lớn, thường gặp vi khuẩn khơng điển hình, đại diện Mycoplasma pneumonia S.pneumoniae (phế cầu) nguyên nhân vi khuẩn hàng đầu gây viêm phổi cộng đồng trẻ em tuổi, cầu khuẩn gram dương có vỏ Phế cầu có 90 type huyết Hiện giới có vaccine đa giá tiêm phòng phế cầu Haemophilus influenza (HI) trực khuẩn gram âm có vỏ khơng vỏ Chủng gây bệnh thường có vỏ phân thành type từ a đến f HI type b nguyên nhân gây viêm màng não viêm phổi trẻ em Tại Việt Nam, từ năm 2009, vaccine phòng HI type b đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng tồn quốc Mycoplasma pneumonia vi khuẩn nội bào khơng có vỏ, ngun nhân hàng đầu gây viêm phổi khơng điển hình, tới 50% nguyên nhân trẻ tuổi Vi khuẩn kháng tự nhiên với kháng sinh có chế phá vách như: Betalactam, Amynoside,…Chúng bị tiêu diệt kháng sinh nhóm Macrolid, Tetracyclin, Quinolone Ngồi vi khuẩn khác nguyên nhân gây viêm phổi trẻ em như: tụ cầu, liên cầu, trực khuẩn ho gà, M cataralis, C pneumonia,… Nguyên nhân viêm phổi vi khuẩn thường gặp theo lứa tuổi: Trẻ sơ sinh: liên cầu B, trực khuẩn gram âm đường ruột, Listerria monocytogent, Chlamydia trachomatis Trẻ tháng đến tuổi: phế cầu, HI, M pneumonia, tụ cầu,… Trẻ > tuổi: M.pneumonia, phế cầu, tụ cầu,…[12] 1.1.4 Chẩn đoán Chẩn đoán viêm phổi mức độ nặng (viêm phổi, viêm phổi nặng) trẻ em chủ yếu dựa vào lâm sàng 23 Đây xét nghiệm Realtime PCR đa mồi cho phép khuyếch đại phát đồng thời axit nucleic mục tiêu vi khuẩn Chlamydophila pneumoniae (CP), Mycoplasma pneumoniae (MP), Legionella pneumophila (LP), Bordetella pertussis (BP), Bordetella parapertussis (BPP), Streptococcus pneumoniae (SP), Haemophilus influenzae (HI) mẫu bệnh phẩm đường hơ hấp bệnh nhân Qui trình thực - Chuẩn bị trang thiết bị vật liệu - Thu thập mẫu Sử dụng bệnh phẩm dịch tỵ hầu nội khí quản, lấy vào ống vơ trùng falcon 15ml Bệnh phẩm khảo sát nghiên cứu đờm lấy sau bệnh nhân chẩn đoán CAP phải nhập viện đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu trước cho bệnh nhân dùng kháng sinh Để lấy đờm, bệnh nhân yêu cầu súc miệng nước muối sinh lý vô trùng trước khạc đờm Đờm khạc cho vào lọ vô trùng nắp vặn chặt Trường hợp bệnh nhân không khạc đờm bệnh phẩm dịch hút từ khí quản lấy qua đường mũi hay nội soi Bệnh phẩm sau lấy xong chuyển tới phòng xét nghiệm vi sinh bệnh viện - Bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm chuyển tới khoa xét nghiệm sớm hành chính, bảo quản tủ 4ºC khoa lâm sàng chờ chuyển tới khoa xét nghiệm Thời gian chờ không 48 - Tách chiết mẫu bệnh phẩm Lưu ý: Quá trình xử lý mẫu phải thực tủ an toàn sinh học tránh tượng lây nhiễm chéo đảm bảo an toàn cho môi trường cán xử lý mẫu 24 - Các mẫu cấp mã, đánh số lưu vào ống ly tâm vô trùng 1,5 ml Quy trình tách chiết bệnh phẩm hệ thống tách chiết tự động tự động MagNA Pure 2.0 (Roche) Hệ thống trang bị cánh tay robot xử lý 32 mẫu bệnh phẩm khác lần chạy Hệ thống tách chiết dựa công nghệ bi từ kết hợp với sử dụng hóa chất tinh cao đảm bảo việc tách chiết cho vật chất di truyền đạt chất lượng cao đồng kết Thời gian hoàn tất lần chạy máy 32 mẫu khoảng 90 phút - Chuẩn bị phản ứng Realtime PCR - Chạy phản ứng máy Realtime PCR CFX96TM (Bio-rad) - Đọc hiểu kết Phân tích Chất phát Biểu đồ 1(tác nhân) Biểu đồ (tác nhân) Streptococcus pneumoniae Legionella pneumophila (SP) Haemophilus influenzae (LP) Bordetella parapertussis (HI) Mycoplasma pneumoniae (BPP) huỳnh quang FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 (MP) IC (Internal Control) Bordetella pertussis (BP) Chlamydophila pneumoniae (CP) - Các kết dương tính giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct)=42 Diễn giải kết 25 Tác nhân Biểu Biểu đồ + + + + - đồ + + + + - Nội Đọc hiểu kiểm + Dương tính với tác nhân phát - Dương tính với tác nhân phát Có thể dương tính với tác nhân vi khuẩn khác + - Âm tính Xét nghiệm bị lỗi, cần chạy lại -IC yếu âm tính chất lượng mẫu có chất ức chế -Tách lại mẫu khác -Nếu kết mẫu tách lại không thay đổi, tiến hành pha loãng mẫu 1/3 đến 1/10 với PBS lặp lại xét nghiệm 2.2.4 Kỹ thuật thu thập thông tin - Nghiên cứu tất bệnh nhân viêm phổi cộng đồng vào viện từ 1/6/2019 đến 30/12/2020 Mỗi bệnh nhân vào viện làm hồ sơ bệnh án nghiên cứu, thăm khám lâm sàng, làm xét nghiệm cận lâm sàng Các thông tin bệnh nhân hỏi trực tiếp cha mẹ người trực tiếp chăm sóc bệnh nhi, thu thập số liệu nghiên cứu theo mẫu bệnh án thống cho tất bệnh nhi - Các bác sỹ tham gia nghiên cứu trực tiếp khám, chẩn đoán, định xét nghiệm cận lâm sàng, theo dõi bệnh nhi điền đầy đủ thông tin vào mẫu bệnh án nghiên cứu  Khống chế sai số 26 - Căn vào tiêu chuẩn đưa vào loại để lựa chọn bệnh nhân, nghiên cứu viên kiểm sốt ghi thơng tin vào bệnh án mẫu tất trường hợp - Đảm bảo tuân thủ đề cương nghiên cứu - Dùng mẫu bệnh án rõ ràng, hợp lý để thu thập thơng tin - Các thơng tin chẩn đốn phân loại thống rõ ràng - Làm số liệu trước xử lý - Khi nhập số liệu xử lý số liệu tiến hành hai lần để đối chiếu kết 2.3 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU Tất thông tin ghi nhận bệnh nhân nhập vào bảng biến số phần mềm thống kê SPSS16.0 Sử dụng thuật tốn thống kê thích hợp 2.4 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu dựa mẫu bệnh phẩm lấy để phục vụ lợi ích trước mắt giúp chẩn đoán nguyên gây VP, điều trị bệnh theo quy trình thơng thường nên có lợi ích nhiều nguy - Bố mẹ đối tượng nghiên cứu thơng tin giải thích rõ ràng mục đích, quyền lợi nghĩa vụ tham gia nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành chấp thuận bệnh nhân gia đình Bệnh nhân đảm bảo quyền lợi điều trị giữ bí mật thơng tin cá nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu lúc Khách quan, trung thực đánh giá xử lý số liệu 2.5 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Bệnh nhân viêm phổi cộng đồng (2th-5 tuổi) - Lâm sàng: - Cận lâm sàng: 27 Cấy dịch tỵ hầu PCR đa mồi loại vi khuẩn PCR đa mồi âm tính PCR đa mồi dương tính Cấy vi khuẩn âm tính Mục tiêu 1: Nhận xét đặc điểm dịch tễ, lâm sàng viêm phổi có nhiễm phế cầu trẻ em Cấy vi khuẩn dương tính Mục tiêu 2: Xác định ngưỡng giá trị thích hợp chẩn đốn VP 28 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 CÁC THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Biểu đồ 3.1: Phân bố giới bệnh nhi nghiên cứu Nhận xét: Bảng 3.1: Phân bố tuổi bệnh nhân nghiên cứu Nhóm tuổi Số lượng Tỷ lệ n % < tháng 6-