LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bác sĩ, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS BSNT Vũ Thị Huyền giảng viên môn Y sinh học - Di truyền, trường đại học Y Hà Nội trực tiếp hướng dẫn từ bắt đầu đến kết thúc q trình nghiên cứu làm khóa luận, đóng góp cho tơi ý kiến q báu hồn thành khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy cô anh chị kỹ thuật viên môn tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, ban Giám hiệu, phòng Quản lý đại học môn Y sinh học - Di truyền, trường đại học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt thời gian hồn thành nghiên cứu Tôi xin cám ơn hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp đóng góp ý kiến q báu để tơi hồn thiện khóa luận Nhân dịp này, tơi kính trọng tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha, mẹ dành tất điều kiện để học tập, phấn đấu trưởng thành sống nghiệp Xin cảm ơn tất bạn bè dành cho nhiều động viên đóng góp Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Tạ Tiên Sinh LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài: “Hồn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định biến đổi số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic nam giới vô sinh nguyên phát” tự thân thực Tất số liệu tơi thu thập, kết luận văn trung thực chưa có cơng bố nghiên cứu khác Tôi xin đảm bảo tính khách quan, trung thực số liệu kết xử lý số liệu nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Tạ Tiên Sinh năm 2016 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic A Adenin Ala Alalin ARMS Amplification refractory mutation system Arg Arginin Asn Asparagin BN Bệnh nhân C Cytosin CYP1A1 Cytochrom P450-A1 G Guanin Gln Glutamin Gly Glycin GSTP1 Glutathion S transferase-P1 Ile Isoleucin NAT2 N-Acetyltransferase NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction T Thymin Thr Threonin Val Valin WHO World Health Organization MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Vô sinh 1.1.1 Khái niệm vô sinh lịch sử nghiên cứu vô sinh 1.1.2 Nguyên nhân vô sinh nam giới .4 1.2 Xenobiotic .6 1.2.1 Khái niệm xenobiotic ảnh hưởng số xenobiotic tới thể 1.2.2 Quá trình biến đổi chung xenobiotic 1.2.3 Gen chuyển hóa xenobiotic 11 1.3 PCR .17 1.3.1 Khái niệm lịch sử phát triển kỹ thuật PCR 17 1.3.2 Nguyên lý kỹ thuật PCR .18 1.3.3 Một số phương pháp PCR đặc hiệu 19 1.3.4 Phương pháp di truyền phân tử - kỹ thuật ARMS - PCR 21 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 25 2.1.3 Số bệnh nhân số mẫu 25 2.1.4 Phương pháp nghiên cứu .26 2.2 Đạo đức nghiên cứu 29 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Đặc điểm tuổi đối tượng nghiên cứu 30 3.2 Kết tách chiết đo độ tinh ADN 30 3.3 Kết phương pháp ARMS - PCR 31 3.3.1 Kết chạy điện di 31 3.3.2 Kết nghiên cứu đột biến CYP1A1 A2455G sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 32 3.3.3 Kết nghiên cứu đột biến GSTP1 C341T sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 33 3.3.4 Kết nghiên cứu đột biến GSTP1 G313A sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 34 3.3.5 Kết nghiên cứu đột biến NAT2 C481T sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 34 3.3.6 Kết nghiên cứu đột biến NAT2 G590A sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR .35 3.3.7 Kết nghiên cứu đột biến CYP1A1 A2455G, GSTP1 G313A, GSTP1 C341T, NAT2 C481T, NAT2 G590A nhóm bệnh 36 Chương 4: BÀN LUẬN 38 4.1 Đặc điểm sinh học nhóm đối tượng nghiên cứu 38 4.2 Hồn thiện quy trình kỹ thuật PCR để xác định biến đổi gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 39 4.2.1 Tách chiết ADN 40 4.2.2 Tiến hành PCR theo phương pháp ARMS điện di đọc kết .41 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đột biến CYP1A1 13 Bảng 1.2 Một số đột biến GSTP1 15 Bảng 1.3 Một số đột biến NAT2 17 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi polymorphism CYP1A1 (Ile462Val), NAT2 (Leu161Leu), GSTP1(Ile105Val Ala114Val) 28 Bảng 2.2 Chu trình luân nhiệt phản ứng PCR 28 Bảng 3.1 Đặc điểm độ tuổi đối tượng nghiên cứu nhóm chứng 30 Bảng 3.2 Kết đo nồng độ tinh ADN theo phương pháp Phenol/Chloroform 30 Bảng 3.3 Kết đo nồng độ tinh ADN theo phương pháp ADNexpress .31 Bảng 3.4 Kết chạy điện di nghiên cứu đột biến gen CYP1A1 A2455G sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 32 Bảng 3.5 Kết chạy điện di nghiên cứu đột biến gen GSTP1 C341T sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR .33 Bảng 3.6 Kết chạy điện di nghiên cứu đột biến gen GSTP1 G313A sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR .34 Bảng 3.7 Kết chạy điện di nghiên cứu đột biến gen NAT2 C481T sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR .34 Bảng 3.8 Kết chạy điện di nghiên cứu đột biến gen NAT2 G590A sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR .35 Bảng 3.9 Kết nghiên cứu đột biến gen CYP1A1 A2455G, GSTP1 G313A, GSTP1 C341T, NAT2 C481T, NAT2 G590A nhóm bệnh 36 Bảng 4.1 So sánh số ưu nhược điểm hai phương pháp tách ADN 41 Bảng 4.2 Thành phần mẫu PCR theo khuyến nghị nhà sản xuất 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa xenobiotic 10 Hình 1.2 Vị trí gen CYP1A1 NST 15 .12 Hình 1.3 Vị trí gen GSTP1 NST 11 14 Hình 1.4 Vị trí gen NAT2 NST 16 Hình 1.5 Chu trình giai đoạn PCR 19 Hình 1.6 Sơ đồ kỹ thuật ARMS - PCR 22 Hình 1.7 Mẫu kết chạy điện di kỹ thuật ARMS - PCR .22 Hình 3.1 Kết chạy điện di GSTP1 Ile105Val sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Vô sinh vấn đề cần quan tâm nhiều Việt Nam giới Vô sinh không ảnh hưởng tới chất lượng sống mà làm tăng tần suất ly hôn Hiện vô sinh khơng vấn đề riêng nữ giới Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO), cặp vợ chồng độ tuổi sinh sản gặp vấn đề sinh 30 - 40% nam giới 10% giới, 40% nữ giới khoảng 10% không rõ nguyên nhân [1] Tại nước Tây Âu, tỷ lệ vô sinh dẫn đến ly chiếm 15%, ngun nhân nam giới chiếm 50% Từ vơ sinh nam nghiên cứu cách sâu sắc toàn diện Cơ thể hệ thống mở tiếp nhận chất từ môi trường tự nhiên: thức ăn, thuốc, hóa chất,… Xenobiotic chất hóa học lạ thể, có ảnh hưởng tốt thể trình chống lại tác nhân lạ (ứng dụng thuốc điều trị bệnh lý nội ngoại khoa) song bên cạnh có tác dụng khơng tốt cho thể (hóa chất độc hại, thuốc lá, rượu,…), có nhiều chất có khả gây vô sinh Nhiệm vụ thể chuyển hóa chất độc hại đào thải chúng, giúp thể có cân hoạt động sống sinh sản Trong trình chuyển hóa xenobiotic, CYP1A1 gen có vai trò then chốt, tham gia mã hóa enzym liên quan đến biến đổi nhóm hoạt tính xenobiotic giai đoạn I chu trình; GSTP1 NAT2 hai gen giữ vai trò mã hóa hai enzym tham gia biến đổi xenobiotic giai đoạn II, biến đổi thành chất dễ dàng thải trừ ngồi mơi trường Vì việc nghiên cứu ảnh hưởng đột biến gen gây nên vô sinh nam giới tiến hành nhiều quốc gia Tuy nhiên, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu PCR kỹ thuật sinh học phân tử giúp chẩn đoán nhanh hữu hiệu bệnh phân tử Việc thực kỹ thuật ARMS - PCR việc nghiên cứu gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 để xác định biến đổi gen nam giới vơ sinh chưa có nghiên cứu tiến hành Việt Nam Vì chúng tơi tiến hành đề tài: “Hồn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định biến đổi số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic nam giới vô sinh nguyên phát” Đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu sau: Hồn thiện quy trình kỹ thuật ARMS - PCR để xác định biến đổi gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 nam giới vô sinh nguyên phát Mô tả số biến đổi gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 nam giới vô sinh nguyên phát Chương TỔNG QUAN 1.1 Vô sinh 1.1.1 Khái niệm vô sinh lịch sử nghiên cứu vô sinh 1.1.1.1 Khái niệm Theo WHO, vơ sinh (infertility) tình trạng cặp nam nữ độ tuổi sinh đẻ, chung sống quan hệ tình dục thường xun vòng 12 tháng mà khơng có con, dù khơng sử dụng biện pháp tránh thai [2] Vô sinh phân thành hai nhóm: vơ sinh ngun phát vơ sinh thứ phát Vô sinh nguyên phát người nam hay nữ chưa có lần Vơ sinh thứ phát tiền sử người nam nữ có lần sau khơng thể có dù quan hệ tình dục bình thường vòng 12 tháng mà không sử dụng biện pháp tránh thai Vô sinh nam vô sinh mà nguyên nhân bắt nguồn từ người nam giới, chức sinh sản người nam giới không đảm bảo người bình thường, cần có can thiệp y tế 1.1.1.2 Lịch sử nghiên cứu vô sinh Theo ước tính WHO (1991), giới có khoảng 12,15% cặp vợ chồng vơ sinh tương đương 50 - 80 triệu người [3] Năm 2003, nghiên cứu Krauz cộng kết luận nguyên nhân gây vơ sinh nam giới khoảng 50%, khoảng 40 - 50% nam giới có bất thường số lượng chất lượng tinh trùng [4] Tại Ả Rập, năm 2006, Ali Hellani tiến hành nghiên cứu cho rằng, khoảng 10 - 15% cặp vợ chồng vơ sinh, ngun nhân nam giới chiếm 50% [5] 45 gen CYP1A1 đột biến làm tăng tính nhạy cảm với xenobiotic, giảm khả oxy hóa enzym mã hóa với xenobiotic Các cá thể mang đột biến có tỉ lệ vơ sinh cao gấp 2,4 lần nhóm chứng (95%CI = 0,83 - 6,95) [30] Trong 10 bệnh nhân nghiên cứu tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến bị vô sinh 8/10 GSTP1 gen mã hóa enzym thuộc nhóm glutathion S-transferase đóng vai trò quan trọng giải độc xúc tác cho tiếp hợp nhiều hợp chất kỵ nước lực điện tử với glutathion, tham gia vào phase II q trình chuyển hóa xenobiotic Glutathion phân tử trao đổi chất thiết yếu sản xuất gan Các glutathion S-transferases xúc tác cho trình liên hợp glutathion với electrophin qua nhóm sulfhydryl Điều nhằm tăng khả hòa tan hợp chất xenobiotic, giúp chúng dễ dàng đào thải khỏi thể Các đột biến GSTP1 gây ảnh hưởng tới chức liên hợp này, nên nguyên nhân gây tích tụ sản phẩm độc hại q trình chuyển hóa xenobiotic ảnh hưởng tới chức hệ quan thể chức sinh sản Trong nghiên cứu đột biến G313A gen GSTP1 Xiong D.K cộng (2015) cho thấy tỉ lệ cá thể mang đột biến nhóm azoospermia 47,1% (OR = 1,48; 95%CI = 1,06 - 2,07; p = 0,023), nhóm oligospermia 50,8% (OR = 1,72; 95%CI = 1,10 - 2,68; p = 0,018) toàn nghiên cứu 48% (OR = 1,53; 95%CI = 1,11 2,11; p = 0,009) [39] Kết thu nghiên cứu tỉ lệ bệnh nhân vô sinh mang đột biến GSTP1 C313A 7/10 Niklam L cộng (2013) nghiên cứu đột biến C341T 95 bệnh nhân có OAT (oligoasthenoteratozoospermia) thu kết có 18,9% số bệnh nhân 46 mang đột biến [54] Trong kết 10 bệnh nhân chúng tơi có 7/10 bệnh nhân mang đột biến GSTP1 C341T NAT2 gen mã hóa enzym có chức acetyl hố xenobiotic tham gia với glutathione S-transferase chuyển hóa xenobiotic giai đoạn II, có chức acetyl hóa arylamine độc hại, amin thơm hidrazin Các đột biến gen gây lên acetyl hóa chậm xenobiotic sản phẩm giai đoạn I chuyển hóa xenobiotic khiến cho việc đào thải xenobiotic gặp khó khăn Yarosh cộng (2014) khẳng định nghiên cứu đột biến NAT2 đơn nucleotid hay gặp C481T G590A Nghiên cứu 203 bệnh nhân vô sinh nam kết thu có 65,5% bệnh nhân mang đột biến C481T 49,3% bệnh nhân mang đột biến G590A [45] Trong kết kiểm tra đột biến gen NAT2 thu có 8/10 bệnh nhân mang đột biến C481T 9/10 bệnh nhân mang đột biến G590A Như qua nghiên cứu bước đầu thấy bệnh nhân vô sinh I chưa rõ nguyên nhân có đột biến gen mã hóa enzyme chuyển hóa xenobiotic, bước đầu nhận định khái quát ảnh hưởng xenobiotic tới hệ thống sinh sản Khái quát lại nhận thấy đột biến gen chuyển hóa xenobiotic có ảnh hưởng tới q trình chuyển hóa xenobiotic qua giai đoạn khác Điều làm tăng lượng xenobiotic thể từ theo cách khác ảnh hưởng tới việc sản xuất tinh trùng nam giới chất lượng tinh trùng nam giới Ở mức độ sinh viên, bước đầu chúng tơi tiến hành thành cơng kỹ thuật quy trình kỹ thuật ARMS - PCR để xác định biến đổi gen 47 CYP1A1, NAT2, GSTP1 nam giới vô sinh nguyên phát mô tả đột biến nam giới vô sinh nguyên phát Trong điều kiện Việt Nam chưa có nghiên cứu liên quan tới vấn đề này, mong thời gian tới sau quy trình kĩ thuật hồn chỉnh có nghiên cứu sâu nhằm xác định ảnh hưởng yếu tố xung quanh việc thực quy trình đánh giá liên quan đột biến với vấn đề vô sinh nguyên phát nam giới cách tồn diện tìm biện pháp giúp đỡ, cải thiện, nâng cao lực điều trị bệnh nhân 48 KẾT LUẬN Hồn thiện quy trình kỹ thuật PCR để xác định biến đổi gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 theo phương pháp ARMS: + Tách chiết ADN theo phương pháp Phenol/Chloroform (OD260nm/280nm = 1,73 - 1,94) ADN-express (OD260nm/280nm = 1,82 - 1,98) thu ADN với nồng độ độ tinh đảm bảo quy trính kỹ thuật ARMS PCR + Tách chiết ADN theo phương pháp ADN-express có ưu việt thời gian thực ngắn, chi phí thấp, mức độ độc hại so với phương pháp Phenol/Chloroform + PCR theo phương pháp ARMS điện di thu hình ảnh rõ nét, phát đột biến rõ ràng Mô tả số biến đổi gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 nam giới vô sinh nguyên phát - Đối với nhóm bệnh: bệnh nhân vơ sinh I chưa rõ nguyên nhân xuất đột biến gen nghiên cứu, đó: + Với đột biến gen CYP1A1 A2455G bệnh nhân dị hợp tử đột biến 8/10, không mang đột biến 2/10 + Với đột biến gen GSTP1 C341T bệnh nhân dị hợp tử đột biến 7/10, không mang đột biến 3/10 + Với đột biến gen GSTP1 G313A bệnh nhân dị hợp tử đột biến 7/10, đồng hợp tử đột biến 1/10, không mang đột biến 1/10 + Với đột biến gen NAT2 C481T bệnh nhân dị hợp tử đột biến 8/10, không mang đột biến 2/10 + Với đột biến gen NAT2 G590A bệnh nhân dị hợp tử đột biến 8/10, đồng hợp tử đột biến 1/10, không mang đột biến 1/10 - Đối với nhóm so sánh khơng có xuất đột biến gen nghiên cứu 49 KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Kiến nghị: - Nên ứng dụng kỹ thuật ARMS - PCR chẩn đoán đột biến gen chuyển hóa xenobiotic nam giới vơ sinh nguyên phát - Cần nghiên cứu sâu rộng kỹ thuật ARMS - PCR chẩn đoán đột biến gen chuyển hóa xenobiotic nam giới vơ sinh ngun phát Hướng nghiên cứu tiếp theo: - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới kết phương pháp ARMS - PCR chẩn đoán đột biến gen chuyển hóa xenobiotic - Đánh giá mối liên quan đột biến gen chuyển hóa xenobiotic vấn đề vơ sinh nam giới TÀI LIỆU THAM KHẢO Jungwirth A et al (2013) Guilines on male infertility, European Association of Urology, 10, 14-16 WHO (2000) WHO manual for the standardized investigation, diagnosis, and management of the infertile in male, Cambridge, Cambridge University Press, 32-35 WHO (1991) Infertility: a tabulation of available data on prevalence of primary and secondary infertility, Geneva, WHO Programme on Maternal and Child Health and Family Planning, Division of Family Health, 67-76 Krausz C., Forti G., McElreavey K (2003) The Y chromosome and male fertility and infertility International Journal of Andrology, 26, 7075 Ali Hellani, Saad Al Hassan (2006) Y chromosome microletions in infertile men with idiopathic oligo - or azoospermia Journal of Experimental & Clinical assisted reproduction, 3, 1043-1050 Poongothai J., Gopenath T.S., Manonayaki S (2009) Genetics of human male infertility Singapore Med J, 50(4), 336-347 WHO (2010) Laboratory manual for the Examination ADN processing of human semen, 5th ed, Cambridge, Cambridge University Press, 103-112 Ngô Gia Hy (2000) Hiếm muộn vô sinh nam, Nhà xuất Thuận Hóa, 79-84 Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh, Phạm Gia Khánh cộng (2002) Nghiên cứu số vấn đề vô sinh nam giới lựa chọn kỹ thuật lọc rửa, lưu trữ tinh trùng để điều trị vô sinh, Đề tài cấp Nhà nước 10 Trần Quán Anh, Nguyễn Bửu Triều (2009) Bệnh học giới tính nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 88-95 11 Nguyễn Viết Tiến (2013) Cập nhật hỗ trợ sinh sản Báo cáo Hội thảo quốc tế, Hà Nội, 6/11/2013 12 Tran Duc Phan (2010) Health status and reproductive health surveillance in Viet Nam, 9th annual scientific congress of Asia Pacific association of medical toxicology collaboration agains poisoning from regional experience to gobal vision, 45 13 Zago M.P., Oteiza P.I (2001) The antioxidant properties of zinc: interactions with iron and antioxidants Free Radialc Biology Medicine, 31, 266–274 14 Egozcue S., Blanco J., Vendrell J.M et al (2000) Human male infertility: chromosome anomalies, meiotic disorders, abnormal spermatozoa ADN recurrent abortion Human Reproduction Update, 6(1), 93-105 15 Giwercman Y.L., NikoshkovA., Byström B et al (2001) A novel mutation (N233K) in the transactivating domain and the N756S mutation in the ligand binding domain of the androgen receptor gene are associated with male infertility Clinical Endocrinology, 54(6), 827-834 16 Kent-First M., Muallem A., Shultz J et al (1999) Defining regions of the Y-chromosome responsible for male infertility and identification of a fourth AZF region (AZFd) by Y-chromosome microdeletion detection Molecular Reprodroduction and Development, 51(1), 27-41 17 Dowsing A.T., Yong E.L., Clark M et al (1999) Linkage between male infertility and trinucleotide repeat expansion in the androgen-receptor gene The Lancet, 354(9179), 640-643 18 Sharma H., Mavuduru R.S., Singh S.K (2014) Increased frequency of CFTR gene mutations identified in Indian infertile men with nonCBAVD obstructive azoospermia and spermatogenic failure Gene, 548(1), 43-47 19 Yunsang C., Wanxi Y (2011) Functions of essential nutrition for high quality spermatogenesis Science Citation Index, 2(4), 182-197 20 Islam N., Trainer P.J (1998), The hormonal assessment of the infertile male, Br J Urol, 82(1), 69-75 21 Kogevinas M (2011) Human health effects of dioxins: cancer, reproductive and endocrine system effects Human Reproduction Update, 7(3), 331-339 22 Patterson A.D., Gonzalez F.J., Idle J.R (2010) Xenobiotic metabolism – A view through the metabolometer Chemical Rearch in Toxicology, 23(5), 851-860 23 Al-Turki H.A (2015) Effect of smoking on reproductive hormones and semen parameters of infertile Saudi Arabians Urology Annals, 7(1), 63-66 24 Muthusami K.R., Chinnaswamy P (2005) Effect of chronic alcoholism on male fertility hormones and semen quality Fertility and Sterility, 84, 919-924 25 Neghab M., Momenbella-Fard M., Naziaghdam R et al (2014) The effects of exposure to pesticides on the fecundity status of farm workers resident in a rural region of Fars province, southern Iran Asian Pacific J ournal Tropical Biomedicine, 4(4), 324-328 26 Gaikovitch E.A., Cascorbi I., Mrozikiewicz P.M et al (2003) Polymorphisms of drug-metabolizing enzymes CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP1A1, NAT2 and of P-glycoprotein in a Russian population European Journal of Clinical Pharmacology, 59(4), 303312 27 Boyland E., Chasseaud L.F (1969) The role of glutathione ADN glutathione S-transferases in mercapturic acid biosynthesis Advance Enzymology Related Areas of Molecular Biology, 32, 173–219 28 Liska D.J (1998) The detoxication enzyme systems Alternative Medicine Review, 3(3), 187-198 29 http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl? gene=CYP1A1&keywords=CYP1A1 30 Fritsche E., Schuppe H.C., Dohr O., et al (1998) Increased frequencies of cytochrome P4501A1 polymorphisms in infertile men Andrologia, 30, 125-128 31 Aydos S.E., Taspinar M., Sunguroglu A et al (2009) Association of CYPlAl and glutathione S-transferase polymorphisms with male factor infertility Fertility and Sterility, 92(2), 541-547 32 Dohle, Gert R (2010) Male infertility in cancer patients: Review of the literature International Journal of Urology, 17(4), 327–331 33 Luo H., Li H., Yao N et al (2014) Association between 3801T>C polymorphism of CYP1A1 and idiopathic male infertility risk: a systematic review and meta-analysis PLoS One, 9(1) 34 Udomsinprasert R., Pongjaroenkit S., Wongsantichon J et al (2005) Identification, characterization and structure of a new Delta class glutathione transferase isoenzyme Biochemical Journal, 388(3), 763-771 35 Atkinson H.J., Babbitt P.C (2009) Glutathione transferases are structural and functional outliers in the thioredoxin fold Biochemistry, 48(46), 11108-11116 36 http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl? gene=GSTP1&keywords=GSTP1 37 Ali-Osman F., Akande O., Antoun G et al (1997) Molecular cloning, characterization, and expression in Escherichia coli of full-length cDNAs of three human glutathione S-transferase Pi gene variants Evidence for differential catalytic activity of the encoded proteins Biochemistry, 272(15), 10004-10012 38 Yarosh S.L., Kokhtenko E.V., Churnosov M.I et al (2015) Joint effect of glutathione S-transferase genotypes and cigarette smoking on idiopathic male infertility Andrologia, 47(9), 980-986 39 Xiong D.K., Chen H.H., Ding X.P et al (2015) Association of polymorphisms in glutathione S-transferase genes (GSTM1, GSTT1, GSTP1) with idiopathic azoospermia or oligospermia in Sichuan, China Asian Joural of Andrology, 17(3), 481-486 40 Blum M., Grant D.M., McBride W et al (1990) Human arylamine Nacetyltransferase genes: isolation, chromosomal localization, and functional expression DNA and Cell Biology, 9(3), 193-203 41 http://www.genecards.org/cgibin/carddisp.pl? gene=NAT2&keywords=NATs 42 Magalon H., Patin E., Austerlitz F (2008) Population genetic diversity of the NAT2 gene supports a role of acetylation in human adaptation to farming in Central Asia European Journal Human Genetics, 16(2), 243251 43 Cascorbi I., Brockmoller J., Bauer S et al (1996) NAT2*12A (803A-G) codes for rapid arylamine N-acetylation in humans Pharmacogenetics, 6(3), 257-259 44 Delomenie C., Sica L., Grant D.M et al (1996) Genotyping of the polymorphic N-acetyltransferase (NAT2*) gene locus in two native African populations Pharmacogenetics, 6(2), 177-185 45 Yarosh S.L., Kokhtenko E.V., Churnosov M.I et al (2014) Synergism between the N-acetyltransferase gene and oxidant exposure increases the risk of idiopathic male infertility Reprod Biomed Online, 29(3), 362-369 46 Templeton N.S (1992) The polymerase chain reaction History, methods, and applications Diaqn Mol Pathol, 1(1), 58-72 Newton C R., Graham A., Heptinstall L E., et al (1989) Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Research, 17(7), 2503-2516 47 Laczmanski L., Slezak R., Karpinski P et al (2013) Validation of the minisequencing method for detection of G1691A (Leiden) factor V mutation Gynecol Endocrinol, 29(4), 314 48 Heidari Z., Mahmoudzadeh-Sagheb H., Hashemi M et al (2015) Association between IFN-γ +874A/T and IFN-γR1 (-611A/G, +189T/G, and +95C/T) Gene Polymorphisms and Chronic Periodontitis in a Sample of Iranian Population International Journal Dentistry, Volume 2015 49 Khosravi A., Jalali-Far M., Saki N et al (2016) Evaluation of α-Globin Gene Mutations Among Different Ethnic Groups in Khuzestan Province, Southwest Iran Hemoglobin, 40(2), 113-117 50 Nguyễn Đức Nhự (2015) Nghiên cứu bất thường nhiễm sắc thể phát đoạn AZFabcd nam giới vô tinh thiểu tinh nặng, Luận văn Tiến sỹ y học, trường đại học Y Hà Nội 51 Brahem S., Mehdi M., Elghezai H et al (2011) The effects of male aging on semen quality, sperm DNA fragmentation and chromosomal abnormalities in an infertile population Reproduction and Genetics, 28(5), 425 – 432 Journal of Assisted 52 Medrano R.F., De Oliveira C.A (2014) Guidelines for the tetra-primer ARMS-PCR technique development Molecular Biotechnology, 56(7), 599-608 Niklam L., Azadeh M., Shirin F., Mohammad mehdi A et al (2013) The Association of Seminal Plasma Antioxidant Levels and Sperm Chromatin Status Genetic Variant of GSTM1 and GSTP1 (Ile105Val and Ala114Val) in Infertile Men with Oligoasthenoteratozoospermia, Disease Marker, 34(3), 205-210 PHỤ LỤC MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ MÔN Y SINH HỌC - DI TRUYỀN ID : Ngày tháng năm 20 BỆNH ÁN Chồng Họ tên:………………………… Tuổi:……… Nghề nghiệp:…………… Địa chỉ:………………………………………………………………………… Năm kết hơn:…………………………… ĐT:……………………………… Tiếp xúc phóng xạ, hóa chất (nếu có ghi rõ loại):…………………………… Bị thương phận sinh dục: ……………………………………………… Bị bệnh:……………………………………………………………………… Thuốc lá: ……………điếu/ngày Bia: ……cốc/lần,……lần/tuần Lần xuất tinh gần nhất:……… Thuốc lào: ……………điếu/ngày Rượu: ………chén/lần,… lần/tuần Số lần giao hợp/tuần:……………… Có mộng, di tinh: ……………… lần/tháng Vợ Họ tên: ……………………………Tuổi: ……… Nghề nghiệp:………… Có kinh năm ………tuổi Chu kì:………ngày Đều/Khơng PARA: ……………………………………………….(con đầu …… tuổi) Các bệnh mắc:………………………………………………….………… ……………………………… Trường Đại Học Y Hà Nội XÉT NGHIỆM TINH DỊCH BM Y sinh học-Di truyền (Bằng máy CASA) (Phòng 201A nhà A3) Mã số: Họ tên bệnh nhân: Tuổi: Chẩn đoán lâm sàng: ……………………………………………………… Kết xét nghiệm Độ di động tinh trùng (%) Mật độ Thể tích pH (7,2 (≥1,5 -8) ml) Tổng số Tỉ lệ tinh tinh sống trùng trùng (≥ (≥15 (triệu 58% triệu/ml ) ) ) Hình thái tinh trùng Bình thường (≥ 15%) Cổ Đuôi Tiến tới Nhanh Không tiến tới Tiến tới Chậ m Tế bào khác Khơng bình thường (%) Đầu Tiến tới (≥32%) (≤ triệu/ml) Tốc độ di động Khôn trung bình g di động tinh trùng (µm/giây) Hóa Màu lỏng sắc Bào tương Khác: Hà Nội, ngày tháng năm 201 Người đọc kết quả: DANH SÁCH BỆNH NHÂN LÀM ARMS-PCR Độ nhớt STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Họ tên Trần Văn V Lê Văn H Nguyễn Văn T Vũ Minh T Nguyễn Bảo Tr Phan Huy S Vũ Văn G Nguyễn Thanh H Phạm Việt Đ Lưu Bình M Lã Đình Tr Nguyễn Xuân T Nguyễn Thanh T Vũ Đình Th Trần Đức C Trần Trung K Nguyễn Hồng T Nguyễn An Ngh Lê Anh Q Dương Thành N Tuổi 27 31 23 41 28 42 43 26 27 26 43 28 27 27 26 27 43 30 28 31 ... trình kỹ thuật PCR để xác định biến đổi số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic nam giới vơ sinh ngun phát Đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu sau: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật ARMS - PCR để xác định. .. Tơi xin cam đoan đề tài: “Hồn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định biến đổi số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic nam giới vơ sinh ngun phát tự thân thực Tất số liệu tơi thu thập, kết luận... định biến đổi gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 nam giới vô sinh nguyên phát Mô tả số biến đổi gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 nam giới vô sinh nguyên phát 3 Chương TỔNG QUAN 1.1 Vô sinh 1.1.1 Khái niệm vô sinh