BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ BÙI THỊ NGA NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN MÃ HÓA ENZYM CHỐNG OXY HÓA CYP1A1 VÀ NỒNG ĐỘ GỐC TỰ DO Ở NAM GIỚI THIỂU TINH NẶNG VÀ VÔ TINH ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ BÙI THỊ NGA NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN MÃ HÓA ENZYM CHỐNG OXY HÓA CYP1A1 VÀ NỒNG ĐỘ GỐC TỰ DO Ở NAM GIỚI THIỂU TINH NẶNG VÀ VÔ TINH Chuyên ngành : Y Sinh học- Di truyền Mã số : 62720301 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lương Thị Lan Anh PGS.TS Trần Đức Phấn HÀ NỘI - 2017 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AR : Androgen Receptor AZF : Azoospermia Factor CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrance Conductance Regulator FSH : Follice Stimulating Hormone GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone GTMTT : Giãn tĩnh mạch thừng tinh ITT : Ít tinh trùng KCTT : Khơng có tinh trùng LH : Luteinizing Hormone NST : Nhiễm Sắc Thể OS : Oxidative Stress RCS : Reactive Clo Species ROS : Reactive Oxygen Species TT : Thiểu tinh TTN : Thiểu tinh nặng VT : Vô tinh WHO : World Health Organization (Tổ chức y tế Thế giới) MỤC LỤC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI .1 BÙI THỊ NGA ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI .2 BÙI THỊ NGA Mã số : 62720301 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: .2 TS Lương Thị Lan Anh PGS.TS Trần Đức Phấn HÀ NỘI - 2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Chương .3 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu vơ sinh vô sinh nam giới 1.1.1 Khái niệm vô sinh vô sinh nam giới 1.1.2 Tình hình vơ sinh vô sinh nam giới 1.1.3 Tình hình vơ sinh vô sinh nam Việt Nam 1.2 Các nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam 1.2.1 Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới Vô sinh nam giới nhiều nguyên nhân khác nhau, hầu hết dẫn đến hậu người nam khơng có tinh trùng tinh trùng suy giảm mức độ khác nhau, bất thường hình thái tinh trùng 1.2.1 Nguyên nhân ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng 1.2.2 Nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng tinh dịch 11 1.3 Gốc tự stress oxy hóa 12 1.3.1 Khái niệm phân loại gốc tự 12 1.3.2 Stress oxy hóa ảnh hưởng lên hệ sinh sản nam 14 1.3.3 Vai trò gốc kháng oxy hóa điều trị vơ sinh nam .16 1.3.4 Các phương pháp xác định mức độ stress oxy hóa tinh dịch .18 1.4 Gen chuyển hóa gốc tự CYP1A1 thể 19 1.4 Kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán xác định biến đổi gen 20 1.5.1 Khái niệm PCR 20 1.5.2 Nguyên lý kỹ thuật PCR 21 1.5.3 Một số phương pháp PCR đặc hiệu .22 1.5.4 Kỹ thuật ARMS-PCR 24 Chương 26 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Số bệnh nhân số mẫu 26 2.3 Quy trình nghiên cứu .27 2.4 Hóa chất dụng cụ 27 2.5 Phương pháp nghiên cứu 27 2.5.1 Loại hình nghiên cứu 27 2.5.2 Cách tiến hành nghiên cứu .27 2.5.3 Xét nghiệm tinh dịch đồ mức độ stress oxy hóa kit Oxisperm 28 2.5.4 Tách chiết DNA 28 2.5.5 Nhân đoạn gen sử dụng phương pháp ARMS-PCR .29 2.5.6 Điện di .30 2.5.7 Xử lí số liệu 30 2.6 Các tiêu nghiên cứu 30 2.7 Đạo đức nghiên cứu .31 Chương 32 DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .32 3.1 Đặc điểm sinh học đối tượng nghiên cứu 32 3.1.1 Độ tuổi trung bình nhóm bệnh nhóm chứng .32 Nhóm bệnh: 30 bệnh nhân .32 Nhóm chứng: bệnh nhân .32 Độ tuổi trung bình nhóm thể bảng sau: 32 Đặc điểm .32 Nhóm bệnh 32 Nhóm chứng 32 (X ± SD) 32 3.1.2 Đặc điểm nhóm bệnh phân loại theo mật độ tinh trùng 32 Dựa vào mật độ tinh trùng tinh dịch, chúng tơi phân loại nhóm bệnh thành: Vơ tinh thiểu tinh nặng 32 Đặc điểm .32 Vô tinh 32 Thiểu tinh nặng .32 Tổng32 Số lượng 32 30 32 Tỉ lệ % 32 100 32 32 3.2 Xác định biến đổi A2455G gen CYP1A1 kỹ thuật ARMS-PCR 33 3.2.1 Kết chạy điện di .33 3.2.2 Xác định biến đổi A2455G gen CYP1A1 33 Alen 35 Nhóm bệnh 35 (n=30) 35 Nhóm chứng 35 (n=5) 35 P 35 A( A2455G) 35 G(A2455G) 35 3.3 Xác định nồng độ gốc tự tinh dịch mối liên quan với biến đổi gen CYP1A1 35 Đo nồng độ gốc tự do: 35 Tiến hành đo gốc tự tinh dịch theo protocol kit Sau phân loại kết thành nhóm: 35 Mức I: Nồng độ gốc tự thấp 35 Mức II: Nồng độ gốc tự trung bình thấp 35 Mức III: Nồng độ gốc tự trung bình 35 Mức IV: Nồng độ gốc tự cao 35 Ta có bảng sau: 35 Mẫu 36 Mức độ gốc tự tinh dịch 36 36 36 36 36 … 36 Từ kết trên, ta thu đồ thị thể tỉ lệ mức gốc tự đây: 36 36 Bước đầu mô tả mối liên quan nồng độ gốc tự tinh dịch biến đổi A2455G gen CYP1A1 .36 Theo kết biến đổi gen, chia đối tượng nghiên cứu thành hai nhóm: Bình thường (khơng có biến đổi gen AA), bất thường (dị hợp tử AG đồng hợp tử GG) 36 Phân bố mức độ stress oxy hóa tinh dịch biến đổi gen CYP1A1: 36 Bình thường 37 n(%) 37 Bất thường 37 n(%) 37 I 37 II 37 III 37 IV 37 37 37 Biến đổi gen CYP1A1 với số số tinh dịch đồ 38 So sánh biến đổi gen nghiên cứu CYP1A1 nam giới thiểu tinh nặng vô tinh với tỉ lệ sống, tỉ lệ di động tiến tới, vận tốc trung bình bất thường hình thái tinh trùng thể bảng sau: 38 Chương 39 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 39 Chúng dự kiến bàn luận vấn đề sau: .39 4.1 Đặc điểm sinh học nhóm đối tượng nghiên cứu 39 4.2 Đặc điểm biến đổi gen CYP1A1 nhóm đối tượng nghiên cứu .39 4.3 Xác định nồng độ gốc tự bước đầu mô tả mối liên quan với biến đổi gen CYP1A1 nam giới thiểu tinh nặng vô tinh .39 Trong 30 mẫu tiến hành đo gốc tự tinh dịch theo protocol kirt, có… mẫu mức độ I, …mẫu mức độ II, …mẫu mức độ III … 39 mẫu mức độ IV 39 Ở mức stress oxy hóa I, tỉ lệ bất thường gen là… 40 Ở mức stress oxy hóa II, tỉ lệ bất thường gen là… .40 Ở mức stress oxy hóa III, tỉ lệ bất thường gen là… 40 Ở mức stress oxy hóa IV, tỉ lệ bất thường gen là… 40 Mức stress oxy hóa tinh dịch với biến đổi A2455G gen mã hóa enzyme chống oxy hóa CYP1A1 có mối liên quan …với p… 40 Mối tương quan số đặc điểm tinh dịch đồ với mức độ stress oxy hóa tinh dịch40 Có mối tương quan mức độ stress oxy hóa tinh dịch với số số tinh dịch đồ: 40 Tỉ lệ sống ( r =…, p