TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC CAO THỊ THU THẢO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu HÀ NỘI - 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC CAO THỊ THU THẢO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Hóa học Hữu Người hướng dẫn khoa học PGS TS NGUYỄN VĂN BẰNG HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình làm khóa luận này, em nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo, anh chị bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới: PGS.TS Nguyễn Văn Bằng, người giao đề tài, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em hồn thành khóa luận TS Phạm Hải Yến, người tạo điều kiện giúp đỡ em trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn tới anh, chị phòng nghiên cứu cấu trúc - Viện hóa sinh biển - Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, giúp đỡ em nhiều trình em thực đề tài nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ, cổ vũ động viên em suốt thời gian qua Vĩnh Phúc, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Cao Thị Thu Thảo DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Corelation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc kí cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mas Spectroscopy FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment HMBCHeteronuclear Multiple Mas Spectrometry Bond Connectivity HMQCHeteronuclear Multiple Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử mhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bombardment Mas Spectrometry IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy ME Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography Nucler DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết phân đoạn từ đu đủ 33 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất CP3 CP4 34 Hình 4.1.a: Phổ H-NMR hợp chất CP3 36 13 Hình 4.1.b: Phổ C-NMR hợp chất CP3 37 13 Hình 4.1.c: Phổ C-NMR phổ DEPT hợp chất CP3 37 Hình 4.1.d: Cấu trúc hóa học hợp chất CP3 38 Bảng 4.1.1: Bảng số liệu phổ hợp chất CP3 39 Hình 4.2.a: PHổ H hợp chất CP4 40 13 Hình 4.2.b: Phổ C hợp chất CP4 41 Hình 4.2.c: Phổ 13 C DEPT hợp chất CP4 41 Hình 4.2.d: Cấu trúc hóa học hợp chất CP4 42 Bảng 4.2.1: Bảng số liệu phổ hợp chất CP4 43 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan chung đu đủ (Carica papaya) 1.1.1 Mô tả 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Những nghiên cứu hoạt tính sinh học đu đủ 1.1.4 Tình hình nghiên cứu thành phần h a học đu đủ nước 1.2 Giới thiệu lớp chất flavonoid 13 1.2.1 Giới thiệu chung 13 1.2.2 Các nhóm flavonoid 13 1.2.2.1 Flavon flavonoid 13 1.2.2.2 Flavanonol 15 1.2.2.3 Izo flavonoid 15 1.2.2.4 Auron 16 1.2.2.5 Anthocyanin 16 1.2.2.6 Catechin 17 1.2.2.7 Leucoanthocyanidin 17 1.2.2.8 Rotenoid 18 1.2.2.9 Neoflavonoid 18 1.3 Tổng quan chung phương pháp chiết 19 1.3.1 Đặc điểm chung chiết 19 1.3.2 Qúa trình chiết thực vật 19 1.3.2.1 Chọn dung môi chiết 19 1.3.2.2 Qúa trình chiết 20 1.4 Tổng qua chung phương pháp sắc ký 21 1.4.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc ký 21 1.4.2 Cơ sở trình sắc ký 22 1.4.3 Phân loại phương pháp sắc ký 22 1.4.3.1 Sắc ký cột 25 1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng 26 1.5 Một số phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu 27 1.5.1 Phổ hồng ngoại(Infrared spectroscopy, IR) 27 1.5.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) 27 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 27 1.5.4 Phổ H-NMR 28 13 1.5.5 Phổ C-NMR: 28 1.5.6 Phổ DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) 28 1.5.7 Phổ 2D - NMR 28 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Mẫu thực vật 30 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 30 2.2.1 Sắc ký lớp mỏng 30 2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 30 2.2.3 Sắc ký cột 30 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 30 2.4 Dụng cụ hóa chất 31 2.4.1 Dụng cụ 31 2.4.2 Hóa chất 31 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 32 3.1 Phân lập hợp chất 32 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất 34 3.2.1 Hợp chất CP3 34 3.2.2.Hợp chất CP4 35 CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 36 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất CP3 36 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất CP4 39 KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 MỞ ĐẦU Thế giới thực vật phong phú đa dạng, n cung cấp cho người nguồn tài nguyên vô quý giá đặc biệt hợp chất c hoạt tính sinh học Các hợp chất thứ cấp phân chia thành nh m như: terpenoid, alcaloid, steroid, flavonoid… Trong trình tiến h a mình, hợp chất thứ cấp đ ng vai trò quan trọng tồn phát triển thực vật, g p phần bảo vệ thực vật trước công động vật ăn cỏ, vi khuẩn, điều kiện bất lợi môi trường Vì hợp chất thứ cấp c hoạt tính sinh học đ ng vai trò quan trọng việc sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho người, vật nuôi, trồng, thuốc bảo vệ thực vật, chất kích thích, điều hồ sinh trưởng động thực vật làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm Cho đến nay, thuốc động vật làm thuốc nhiều dân tộc giới sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh khác Theo thống kê sơ bộ, số nước châu Á châu Phi, 80 % dân số phụ thuộc vào y học cổ truyền việc chăm s c sức khỏe Ở nhiều nước phát triển, 70 % đến 80 % dân số sử dụng thuốc chế phẩm n Các loài thảo mộc sử dụng dân gian, chứng minh nghiên cứu dược lý tạo nhiều loại thuốc Tây Trong vài thập kỉ qua, với thuốc dân gian đ dược liệu cổ truyền đ ng vai trò nguồn nguyên liệu cung cấp cho thuốc Tây với 40% tổng loại thuốc Hơn việc nghiên cứu h a học hoạt tính sinh học lồi thuốc c ý nghĩa vơ quan trọng nhằm làm sở khoa học cho việc sử dụng nguồn tài nguyên cách hiệu nhất, lý giải công dụng ngăn ngừa bệnh sử dụng thuốc dân tộc, phát hợp chất thể hoạt tính giúp định hướng bào chế phát thuốc Việt Nam đánh giá nước đứng thứ 16 giới phong phú đa dạng sinh vật Trong đ , hệ thực vật phong phú đa dạng Sự đa dạng loài thảo dược Việt Nam g p phần không nhỏ cho phát triển nghành y học cổ truyền nước ta, bên cạnh đ n đ ng g p vai trò lớn nghành y học đại Hiện nhà khoa học quan tâm đến hợp chất c hoạt tính sinh học thực vật Việc nghiên cứu thành phần h a học tác dụng dược lý loài thuốc c giá trị cao Việt Nam nhằm đặt sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý hiệu c tầm quan trọng đặc biệt Theo hướng nghiên cứu trên, kh a luận tập chung nghiên cứu, phân lập hợp chất Flavonoid đu đủ (carica papaya), nhằm tạo sở cho việc nghiên cứu lĩnh vực tìm kiếm phương thuốc mới, g p phần giải thích tác dụng chữa bệnh thuốc cổ truyền OH 5' HO 1' O OH OH 3' 10 O O O OH OH OH HO Hình 4.1.d: C u trúc hóa học h p ch t CP3 Bảng 4.1.1: Bảng số liệu phổ h p ch t CP3 C Ca,b [1] C H a,b a,c mult (J in Hz) 156.5 156.28 - 133.7 133.50 - 177.6 177.46 - 161.1 161.20 - 98.8 98.64 6.20 d (2.0) 164.2 164.11 - 93.7 93.47 6.40 d (2.0) 156.4 156.23 - 10 104.0 103.90 - 1′ 121.3 121.09 - 2′ 116.1 115.96 7.52 d (2.0) 3′ 144.8 144.78 - 148.4 148.42 - 115.3 115.16 6.80 d (8.0) 122.0 121.94 7.66 dd (2.0 8.0) 102.0 101.85 5.36 d (7.5) 71.3 71.20 3.57 t (8.5) 73.2 73.19 3.36 brs 67.9 67.90 3.65 brs 75.9 75.80 3.32 * 4′ 5′ 6′ 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ a * 60.2 b 60.12 c * 3.37 * đo t ong DMSO; 125 MHz; 500 MHz; * tín hiệ bị chập; C ố iệ phổ củ Quercetin-3-O- - D-galactopyranoside 4.2 Xác định c u trúc hóa học h p ch t CP4 Hợp chất CP4 phân lập từ dịch chiết metanol ổi thu dạng bột màu vàng Phổ H-NMR CP4 giống CP3 cho thấy hợp chất flavonoid với vùng tín hiệu H từ 6,18 ppm đến 7,64 ppm Sự xuất tín hiệu proton vòng thơm với hệ tương tác spin ABX H 7,56 (1H, d, J = 2,0 Hz), H 6,79 (1H, d, J = 8,5 Hz) H 7,64 (1H, br d, J = 8,5 Hz) cho thấy nh m vào vòng B phải nằm vị trí C-3′ C4′ Trên vòng A, giá trị H 6,18 (1H, br s) H 6,38 (1H, , br s) khẳng định vòng A bị vị trí proton lại vị trí meta với Hình 4.2.a: Phổ H h p ch t CP4 13 Phổ C-NMR CP4 xuất tín hiệu 15 cacbon PS2 thuộc vùng cộng hưởng vòng thơm, phổ DEPT xác định CP4 c cacbon bậc (CH) 10 cacbon bậc (C) Các giá trị C 156,18 104,05 điển hình cho C-9 C-10 vòng A hợp chất flavonoid c nối đôi C-2/C-3 Bên cạnh đ giá trị độ chuyển dịch h a học C 98,60 93,42 cho thấy vòng A c thêm nh m OH vị trí C-7 So sánh số liệu phổ 13 C-NMR CP4 PS2 (quercetin) ta thấy tương tự ngoại trừ vị trí C-2 C-3 thấy c khác biệt đáng kể gợi ý c nh m khác hydroxy (OH) liên kết với C-3 13 H h 4.2 : Phổ C củ h ch CP4 Hình 4.2.c: Phổ 13 C DEPT h p ch t CP4 Phân tích chi tiết kiện phổ thu so sánh với số liệu phổ 13 C-NMR chất quercetin-3-sulphate tài liệu công bố [4] ta thấy hoàn toàn phù hợp Như vậy, hợp chất CP4 xác định quercetin-3sulphate hợp chất biết phân lập từ loài Flaveria chloraefolia [4] CP4 c công thức phân tử C15H10O10S M= 382 OH 5' HO 1' O 10 O O OH H h 4.2.d C u OH 3' úc h O S O học củ h ch OH CP4 Bả g 4.2.1: Số iệu hổ củ h ch CP4 * C [1] d,f C a,b 156.6 156.65 H mult (J in Hz) - 132.3 132.37 - 177.7 177.65 - 161.3 161.21 - 98.4 98.60 6.18 brs 163.9 164.14 - 93.3 93.42 6.38 brs 156.1 156.18 - 10 104.1 104.05 - 1′ 121.6 121.69 - 2′ 115.1 115.21 7.56 d (2.0) 3′ 144.7 144.80 - 4′ 5′ 6′ a C d, e 148.3 148.51 b e f đo t ong DMSO; 100 MHz; 125 MHz; 500 MHz; * tín hiệ bị 115.9 115.65 6.79 d (8.5) * 121.6 chập; C a,b 121.37 7.64 brs d (8.5) quercetin-3-sulphate [5] KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, phân lập hai hợp chất thuộc loại flavonoid từ đu đủ là: Hợp chất: CP3 (quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside) CP4 (Quercetin-3-sulphate) phân lập từ dịch chiết etylaxetat Cấu trúc hợp chất CP3 CP4 xác định phương 13 pháp phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều( H-NMR, CNMR, DEPT 90, DEPT 135) H ch CP3: quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside C21H20O12 M= 464 OH 5' HO 1' O 3' OH 10 OH O O O OH OH OH HO H ch CP4: Que ce i -3-sulphate C15H10O10S M= 382 OH 5' HO 1' O OH OH 3' 10 O O O O S OH TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Huy B ch Đặ g Qu g Chu g (2006) Cây th ốc động vật àm th ốc Việt N m Nhà xuất hoa học kỹ thuật, tập 1, pp 824-827 [2] Đỗ T u g Đ (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp củ th ốc, Nxb Y học, Hà Nội [3] Đỗ Thị Thả (2006) Nghiên xác định khả phòng chống ng thư chất hó học củ ố th ốc Việt N m Luận án tiến sĩ sinh học [4] Gi g Thị Ki Li Đỗ Thị Lệ Uy hảo át thành ph n hoá học củ ố dịch chi t t ho đ đủ đ c th hái t i N ng Tạp chí hoa học Cơng nghệ ĐHĐN; Số: Số 03(88) 2015; Trang 119 [5] H Thị B ch Ngọc T (2007) iề t Thị Huyề Ng Nguyễ Vă Mùi hợp chất c otenoid t ong ố th c vật củ Việt N m Tạp chí khoa học ĐHQGHN, khoa học tự nhiên công nghệ, 23, pp 130-134 [6] Hồ Thị H (2014) Nghiên ho t tính inh học củ ố hợp chất chi t tách t đ đủ(C ic p p y inn) Luận án tiến sĩ Đại học Bách khoa Hà nội [7] Nguyễ Tườ g Vâ M h B h Ph k oid củ Đặ g Hồ g Vâ Ph Gi Khôi T Quốc Ki h (1983) Chi t x ất xác định c p ine đ đủ, Tạp chí dược học số [8] Nguyễ Vă Đ Nguyễ Viế Tựu (1985), Phương pháp nghiên hó học th ốc, Nxb Y học, Hà Nội [9] Ph ch Ki Mã cộ g ự (2001) Nghiên th ốc P n c in ức dùng t ong điề t ị ng thư Tạp chí dược liệu, (2+3), pp 58-62 [10] T t ite pene nđ Th h H T ị h Thị Điệ tiên phân ập t (2012) Hai cycloratane đ đủ (c ic p p y ) Tạp chí h a học, tập 50 (4A), pp 166-169 [11] A e C i i D ie Ae i i Giu e e D’A c ge Pietro Tagliatesta (2007)Gas chromatography-mass spectrometry analysis of phenolic compounds from carica papaya L leaf Journal of food composition and analysis, vol 20, pp 584-590 [12] Asmah Rahmat, Rozita Rosli, Wan Nor I`zzah Wan Mohd Zain, Susi Endrini and Huzaimah Abdullah Sani (2002).Antiproliferative Activity of Pure Lycopene Compared to Both Extracted Lycopene and Juices from Watermelon (Citrullus vulgaris) and Papaya (Caricapapaya) on Human Breast and Liver Cancer Cell Lines Journal of Medical Sciences.vol 2.Isuae 2.page 55-58 [13] Abrham W.B., (1978), Techniques of Animal and Clinical toxicology Med Pub Chicago, p 55 - 68 [14] Beverly A Teicher, (1997), Anticancer drug development guide: Preclinical screening, clinical trials, and approval, Humana Press, Totowa, New Jersey [15] Bamidele V, Owoyele, Olubori M, Adebukola, Adeoye A, Funmilayo and Ayodele O, Soladoye (2008) Anti - inflammatory activities of ethanolic extract of Carica papaya leave Inflammopharmacology, 16 (2008), pp 168 - 173 [16] Chung-Shih Tang (1979) New m c ocyc ic Δ1-piperideine alkaloids from papaya leaves: dehydrocarpaine I and II Phytochemistry, 1979, vol 18, pp 651-652 [17] David S., Seigler, Guido F., Pauli, Adolf Nahrstedt, Rosemary Leen (2002) Cyanogenic allosides and glucosides from passiflora edulis and carica papaya.Phytochemistry, vol 60, pp 873-882 [18] Eno AE, Owo OI, Itam EH, Konya RS, (2000), Blood pressure depression by the fruit juice of Carica papaya (L.) in renal and DOCAinduced hypertension in the rat, Phytother Res, Jun;14(4):235-9 [19] Gopalakrishnan M, Rajasekharasetty MR., (1978 ), Effect of papaya(Carica papaya Linn) on pregnancy and estrous cycle in albino rats of Wistar strain, Indian J Physiol Pharmacol, Jan-Mar;22(1):66-70 [20] Govindachari T.R., Naga rajan K and Viswanathan N (1965) Carpaine and pseudocarpaine Tetrahedron letters No 24, pp 19071916 [21] John R., Van (1998), “Mech ni m of nti inf mm to y ction of Non te vid g”, The American Jour of Med March 30, vol 104 (3A) p.2s -3s [22] Krishna K.L., Paridhavi M and Jagruti A Patel (2008) Review on nutritional,medicinal and pharmacological properties of papaya (Carica papaya Linn.) Natural product radiance, vol 7(4), pp 364-373 [23] Lohiya NK, Kothari LK, Manivannan B, Mishra PK, Pathak N, (2000), Human sperm immobilization effect of Carica papaya seed extracts: an in vitro study, Asian J Androl Jun;2(2):103-9 [24] Marline Nainggolan and Kasmirul Cytotoxicity activity of male Carica papaya L flowers on MCF-7 breast cancer cells Journal of Chemical and Pharmaceutical Research,2015, 7(5):772-775 , ISSN : 0975-7384 [25] Maisarah A.M., Nurul Amira B., Asmah R and Fauziah O (2013) Antioxidant analysis of different parts of Carica papaya International Food Research Journal,20(3), pp 1043-1048 [26] Pathak N,Mishra PK, Manivannan B, Loyhia NK, (2000), Stertility due to inhibition of sperm motility by oral administration of benzene chromatographic fraction of the chloroform extract of the seeds of Carica papaya in rats, Phytomedicine, 7, 325-333 [27] Rumiyati, Sismindari dan Ariyani (2006) Effect of protein fraction of Carica papaya L leaves on the expressions of p53 and Bcl - in breast cancer cells line Majalah Farmasi Indonesia, 17 (4), pp 170 - 176 [28] Rahman S., Imran M., Muhammad N., Hassan N., Chisthi A.K., Khan A.F., Sadozai K.S and Khan S.M (2011) Antibacetial screening of leaves and stem of Carica papaya Journal of Medicinal Plants Research, vol 5(20), pp 5167-5171 [29] Stephen Chinwendu Ukpabi Emmanuel O.Chukwu Henry C.Ezikpe Chizaram (2015) Chemical Composition Of Carica Papaya Flower (Paw-Paw) International Journal of Scientific Research and Engineering Studies (IJSRES) Volume Issue 3, ISSN: 2349-8862 [30] Sripanidkulchai B, Wongpanich V, Laupattarakasem P, Suwansaksri J, Jirakulsomchok D, (2001), Diuretic effects of selected Thai indigenous medicinal plants in rats J Ethnopharmacol May;75(2-3):185-90 [31] Satrija F, Nansen P, Bjorn H, Murtini S, He S., (1994), Effect of papaya latex against Ascaris suum in naturally infected pigs J Helminthol Dec;68(4):343-6 [32] Victor Njoku O and Chidi Obi (2009) Phytochemical constituents of some selected medicinal plants Afican Journal of Pure and Applied chemistry, vol 3(11), pp 228-233 ... chung đu đủ (Carica papaya) 1.1.1 Mô tả 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Những nghiên cứu hoạt tính sinh học đu đủ 1.1.4 Tình hình nghiên cứu thành phần h a học đu đủ nước...TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC CAO THỊ THU THẢO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CÂY ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu Người... cứu trên, kh a luận tập chung nghiên cứu, phân lập hợp chất Flavonoid đu đủ (carica papaya), nhằm tạo sở cho việc nghiên cứu lĩnh vực tìm kiếm phương thuốc mới, g p phần giải thích tác dụng chữa