BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT NẤM MEN GIÀU KẼM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM BỔ SUNG TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62.42.02.01 Hà Nội, 2019 Cơng trình hồn thành Viện Cơng nghiệp Thực phẩm Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Đức Mạnh TS Nguyễn Thị Minh Khanh Viện Công nghiệp thực phẩm Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Phản biện 2: PGS.TS Phan Thanh Tâm Phản biện 3: TS Phạm Hương Sơn Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án phiên thức Viện Cơng nghiệp thực phẩm, 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Công nghiệp thực phẩm - Trang web Bộ GD&ĐT MỞ ĐẦU Kẽm có thành phần 160 loại enzyme khác nhau, đặc biệt có hệ thống enzyme vận chuyển, thủy phân, đồng hóa, xúc tác phản ứng gắn kết chuỗi phân tử ADN [81] Do đó, hệ quan hệ thần kinh trung ương, da niêm mạc, hệ tiêu hóa, tuần hồn nhạy cảm với thiếu hụt kẽm Ngày nay, tình trạng thiếu kẽm vấn đề phổ biến cộng đồng Chính vậy, việc bổ sung kẽm vào chế độ dinh dưỡng cộng đồng cần thiết Có nhiều phương pháp để tạo hợp chất kẽm như: tổng hợp hóa học, chiết xuất từ tự nhiên, nhờ vi sinh vật… Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp hóa học có hạn chế như: dễ sinh sản phẩm phụ, khó kiểm sốt, gây ảnh hưởng tới sức khỏe người Phương pháp chiết xuất hợp chất kẽm từ tự nhiên an toàn chi phí sản xuất cao Vì vậy, giới tập trung nghiên cứu sử dụng nấm men đối tượng nghiên cứu nhằm chuyển hóa ion kim loại từ môi trường thành dạng hợp chất hữu tích lũy nấm men Các nghiên cứu so sánh khả hấp thu chuyển hóa dạng kẽm vô kẽm hữu động vật động vật bổ sung kẽm dạng hữu có nồng độ kẽm huyết hàm lượng kẽm dự trữ xương, thịt, quan nội tạng cao bổ sung kẽm dạng vô [56] Việc nghiên cứu khoa học để tạo quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm bột nấm men giàu kẽm cần thiết Những nhu cầu thực tiễn nêu sở để đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sảnxuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung” thực Mục tiêu nghiên cứu  Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức Nội dung nghiên cứu  Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả tích lũy kẽm cao từ tự nhiên Sưu tập giống VSVCN – Viện Cơng nghiệp thực phẩm  Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm  Nghiên cứu nâng cao hiệu lên men phương pháp lên men bổ sung môi trường  Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm Phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm  Xây dựng quy trình cơng nghệ triển khai sản xuất thử nghiệm bột nấm men giàu kẽm Viện CNTP Những đóng góp luận án  Phân lập chủng nấm men S cerevisiae A112 có khả tích lũy kẽm hữu cao  Phân tích tỉ lệ kẽm hữu số dạng kẽm tồn sinh khối nấm men  Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm triển khai sản xuất thử nghiệm Viện Công nghiệp thực phẩm Đây cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách có hệ thống sản xuất bột nấm men giàu kẽm, từ việc nghiên cứu điều kiện sinh trưởng, tối ưu hóa q trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, đến việc thu hồi dịch chiết, tạo chế phẩm nấm men giàu kẽm dạng bột CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu nguyên tố vi lượng kẽm - Tầm quan trọng nguyên tố vi lượng kẽm Nhu cầu kẽm thể - Tình hình thiếu kẽm giới Việt Nam - Những dạng hợp chất phổ biến kẽm hấp thu vào thể Đặc tính ưu việt nấm men sản xuất công nghiệp Khả hấp thụ kim loại chế tích lũy kẽm tế bào nấm men - Khả hấp thụ kim loại nấm men - Cơ chế, vị trí tích lũy kẽm tế bào nấm men - Các yếu tố ảnh hưởng tới q trình tích lũy kẽm nấm men Các phương pháp lên men sử dụng sản xuất sinh khối nấm men giàu kẽm - Phương pháp lên men gián đoạn (batch fermentation) - Phương pháp lên men gián đoạn bổ sung chất (fed-batch fermentation) Các nghiên cứu nấm men giàu kẽm Các phương pháp phá tế bào nấm men - Phương pháp học - Phương pháp phi học - Sử dụng kết hợp phương pháp Các sản phẩm chức giàu kẽm giới CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu - Nguồn phân lập nấm men: 56 mẫu gồm đất nhiễm kim loại nặng, hoa chín, dịch lên men rượu gạo, nước thải… thu thập từ địa phương Hà Nội, Thái Nguyên - 96 chủng S.cerevisiae cung cấp từ Bộ Sưu tập giống VSV – Viện Công nghiệp Thực phẩm - Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng dòng Bal b/c, cung cấp Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Môi trường phân lập Sabouraud, môi trường giữ giống maltglucose agar 4°Bx, môi trường hoạt hóa nấm men, mơi trường lên men Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phân tích hàm lượng kẽm tổng AAS [139] - Phương pháp phân tích phân đoạn kẽm thực theo Liu cộng (2015) [89, 104] - Phương pháp xác định nồng độ protein hoà tan theo phương pháp Lowry [107] - Phương pháp xác định hoạt độ enzyme [69] - Phương pháp phân tích tiêu chuẩn sở hàm lượng kim loại nặng, tiêu vi sinh bột nấm men giàu kẽm theo AOAC 999.11, AOAC 971.21, TCVN 5667:1992 - Phương pháp sàng lọc chủng nấm men có khả tích lũy kẽm [10] - Phương pháp xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho trình nhân giống S.cerevisiae A112 - Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm - Phương pháp lên men bổ sung môi trường (fed-batch fermentation) Phương pháp thu hồi dịch chiết nấm men giàu kẽm tạo sản phẩm nấm men giàu kẽm dạng bột - Nghiên cứu so sánh hấp thu, hoạt tính sinh học kẽm sulphat chiết xuất nấm men giàu kẽm chuột thí nghiệm [172] - Phương pháp xử lí số liệu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả tích lũy kẽm cao từ tự nhiên Sưu tập VSVCN – Viện CNTP Sàng lọc khả tích kẽm từ 96 chủng nấm men từ Sưu tập VSVCN 25 chủng nấm men từ nguồn phân lập Kết có 44 chủng thể khả tích kẽm thấp mg/g sinh khối khô chiếm tỷ lệ 36,37 %; 54 chủng tích kẽm khoảng từ 1-3 mg/g sinh khối chiếm tỷ lệ 44,63% 23 chủng có khả tích lũy kẽm với hàm lượng mg/g sinh khối chiếm tỷ lệ 19,01 % Trong đó, chủng thể khả tích luỹ kẽm cao chủng nấm men phân lập A112 với hàm lượng kẽm tích lũy sinh khối lên tới 10,95 mg/g, lượng sinh khối đạt 1,02 g/100ml 3.1.1 Nghiên cứu xác định dạng kẽm tồn sinh khối nấm men giàu kẽm 12 chủng nấm men có khả tích kẽm với hàm lượng 5mg/g sinh khối lựa chọn để phân tích định lượng kẽm hữu dạng liên kết kẽm sinh khối nấm men Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm chủng nấm men A112 Bảng 3.1 Hàm lượng kẽm hữu tồn 12 chủng nấm men S cerevisiae Sinh khối (g/100ml) Hàm lượng kẽm (mg/g) Tỉ lệ kẽm hữu (%) CNTP 4007 0,93 ± 0,08 7,50 ± 0,21 80,43 ± 2,13 CNTP 4017 0,90 ± 0,09 5,23 ± 0,22 51,56 ± 1,53 CNTP 4059 0,89 ± 0,09 7,05 ± 0,19 78,64 ± 1,46 CNTP 4080 0,87 ± 0,08 7,65 ± 0,12 85,86 ± 1,24 CNTP 4087 0,94 ± 0,11 8,91 ± 0,21 86,86 ± 1,51 CNTP 4130 0,87 ± 0,09 5,47 ± 0,19 78,92 ± 2,16 CNTP 4131 0,95 ± 0,13 5,89 ± 0,3 62,65 ± 3,05 CNTP 4157 0,89 ± 0,09 7,19 ± 0,12 74,98 ± 1,34 CNTP 4158 0,91 ± 0,09 6,35 ± 0,19 71,12 ± 1,12 A112 1,02 ± 0,07 10,95 ± 0,13 0,83 ± 0,08 8,16 ± 0,18 0,71 ± 0,09 6,43 ± 0,17 CO8 A78 88,17 ± 1,27 86,05 ± 1,13 70,87 ± 2,16 Kẽm liên kết protein (%) Kẽm liên kết polysacarit (%) 9,70 ± 0,19 12,16 ± 0,27 8,42 ± 0,17 11,18 ± 0,19 14,50 ± 0,21 19,21 ± 0,20 6,47 ± 0,09 16,61 ± 0,50 15,40 ± 0,18 20,52 ± 0,81 11,01 ± 0,26 14,84 ± 0,19 14,65 ± 0,18 17,90 ± 0,23 9,12 ± 0,23 11,86 ± 0,27 6,80 ± 0,85 12,40 ± 0,31 15,86 ± 0,25 28,25 ± 0,16 12,86 ± 0,25 18,25 ± 0,19 10,81 ± 0,11 15,01 ± 0,18 Như vậy, kẽm phân bố chủ yếu dạng liên kết với hợp chất hữu cơ, dao động từ 51,56 tới 88,17% so với lượng kẽm có dịch chiết mẫu phân tích Kết chứng minh khả chuyển hóa nguồn kẽm vơ mơi trường ni cấy, thành dạng kẽm liên kết với hợp chất hữu tích lũy tế bào chủng nấm men Kẽm dạng hữu chiếm tỉ lệ cao sinh khối chủng nấm men phân lập A112 đạt giá trị 88,17% Roepcke cộng (2011) tiến hành tối ưu hóa điều kiện ni cấy thu nấm men giàu kẽm chủng Pichia guilliermondii LBP 063 kết cho thấy 91% kẽm liên kết với dạng hợp chất hữu [132] Trong nghiên cứu này, tỉ lệ kẽm hữu cao đạt 88,17% chủng S.cerevisiae A112, giá trị thấp nghiên cứu Roepcke cộng Tuy nhiên, chủng có khả tích lũy kẽm hữu với hàm lượng cao sinh khối Ở chủng nấm men, dạng kẽm liên kết với phân đoạn polysacarit lớn dạng kẽm gắn với phân đoạn protein Kẽm có vai trò quan trọng q trình trao đổi chất thể Kẽm liên kết với hợp chất hữu hấp thụ dễ dàng ứng dụng y học Dạng kẽm liên kết với polysacarit chứng minh có tác dụng giải độc bị ngộ độc kim loại nặng [141] Việc phân tích dạng tồn kẽm có ý nghĩa việc làm sáng tỏ chế tác dụng dịch chiết nấm men giàu kẽm 3.1.2 Xác định đặc tính chủng nấm men tuyển chọn Khuẩn lạc chủng nấm men A112 có kích thước to nhỏ khác nhau, khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, bề mặt trơn láng Tế bào nấm men quan sát kính hiển vi điện tử qt có hình tròn, ovan với kích thước tế bào nằm khoảng ữ ì ữ 11àm Nhng c im hỡnh thái tế bào khuẩn lạc chủng nấm men A112 có tương đồng với S.cerevisiae CNTP 4087 số loài thuộc chi Saccharomyces [28] Khuẩn lạc nấm men A112 Tế bào chủng nấm men A112 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng nấm men A112 chủng nấm men có khả đồng hóa glucose, galactose, sucrose, maltose khơng có khả đồng hóa D-glucosamine, Dxylose, L-arabinose, D-sorbitol, Lactose, 2-keto-D-gluconate, Sắt citrate Đồng thời, chủng có khả lên men rượu, sinh khí CO2, phát triển tốt điều kiện nhiệt độ 25oC - 33oC, pH từ 5-8 Đặc biệt, chủng nấm men A112 có khả sinh trưởng điều kiện nhiệt độ lên tới 35oC đặc tính vơ có ý nghĩa sản xuất công nghiệp [101]… 3.1.3 Định tên chủng nấm men A112 sinh học phân tử Kết so sánh gen 26S rDNA chủng A112 cho thấy, chúng tương đồng 99,25% với chủng S cerevisiae GITA551, phát sinh chủng loại chủng A112 có quan hệ gần với loài S cerevisiae Như vậy, dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí sinh hóa sinh học phân tử cho thấy chủng nấm men A112 thuộc loài S cerevisiae Chủng nấm men S.cerevisiae A112 thể đặc tính tốt khả sinh trưởng tích lũy kẽm sinh khối nên lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu điều kiện phù hợp cho cho q trình lên men tích lũy kẽm 3.2 Nghiên cứu điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 3.2.1 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm a Ảnh hưởng nguồn muối kẽm tới khả tích lũy kẽm sinh khối nấm men S.cerevisiae A112 Muối kẽm nitorat, kẽm clorua kẽm sunphat sử dụng để khảo sát lựa chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàu kẽm Tiến hành thí nghiệm Khi tăng nồng độ yeast extract từ 5g/l lên tới 10g/l chủng S cerevisiae A112 có chiều hướng gia tăng hàm lượng kẽm tích lũy sinh khối khối lượng sinh khối sau lên men Cụ thể, nồng độ yeast extract 10g/l khả tích lũy kẽm sinh khối đạt tới 10,41 mg/g, với lượng sinh khối tương ứng 0,72 g/100ml Tuy nhiên, điều đáng ý bổ sung nguồn dưỡng chất nồng độ cao từ 15 lên tới 20 g/l lại có tác động bất lợi cho q trình hấp thu kẽm Brady Ducan (1994) rằng, yeast extract có ảnh hưởng tích cực tới phát triển nấm men hấp thu kẽm sinh khối nồng độ thích hợp Tuy nhiên, nồng độ cao chúng liên kết trực tiếp với ion kim loại môi trường nuôi cấy gây giảm hấp thu kẽm sinh khối nấm men [33] Khối lượng sinh khối sau nhân nuôi Hàm lượng kẽm sinh khối 12 10.41 9.55 1.2 10 9.25 9.01 0.8 0.61 0.72 0.79 0.79 0.4 Hàm lượng kẽm (mg/g) Khối lượng sinh khối (g/100ml) 1.6 0 5g/l 10g/l 15g/l 20g/l Yeast extract (g/l) Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ yeast extract tới hàm lượng kẽm tích lũy lượng sinh khối khơ tới S cerevisiae A112 11 3.2.2 Tối ưu hóa q trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm Có thể nhận thấy, có mối tương quan tuyến tính nồng độ kẽm bổ sung môi trường nuôi cấy với lượng kẽm sinh khối, nồng độ glucose với khối lượng sinh khối Trong nghiên cứu này, mục tiêu đặt trình lên men thu hàm lượng kẽm sinh khối khô đạt 15 mg/g cho lượng sinh khối nấm men thu cao tốt Dữ liệu thực nghiệm dùng làm đầu vào cho q trình phân tích điểm tối ưu, sử dụng phần mềm JMP tính tốn, kết thu sau: Nồng độ kẽm môi trường nuôi cấy 1,5 g/l, nồng độ glucose 100 g/l cao nấm men 5g/l Hình 3.4 Điều kiện tối ưu hiệu suất dự kiến phần mềm JMP 3.2.3 Nghiên cứu động học trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm theo phương pháp lên men gián đoạn Nghiên cứu động học trình tích lũy kẽm sinh khối với điều kiện tối ưu lựa chọn Kết thể hình 3.5 12 2.5 16 14 12 1.5 10 0.5 Lượng sinh khối (g/100ml) Hàm lượng kẽm sinh khối (mg/g) Nồng độ đường khử (g/100ml) 18 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h 36h Thời gian (h) Hàm lượng kẽm sinh khối (mg/g) Nồng độ đường khử (g/100ml) Lượng sinh khối khô (g/100ml) Hình 3.5 Động học trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm theo phương pháp lên men gián đoạn Như vậy, từ 0-3h sau tiếp giống, tế bào giai đoạn tiềm tàng Tuy nhiên, từ 3-21h tế bào nấm men chuyển sang pha logarit, phát triển mạnh gia tăng sinh khối tế bào Từ 24-36 giờ, nguồn chất glucose cạn kiệt, tế bào ngừng sinh trưởng đạt trạng thái cân Sự hấp thu kẽm xảy mạnh mẽ thời điểm từ 9-18h chậm lại khoảng thời gian 21-36h Kết phù hợp với nghiên cứu Walker (2004), tác giả cho q trình tích lũy kẽm diễn sau tiếp nguồn muối kẽm, pha sớm trình lên men, nguồn lượng mức cao [158] Đồng thời, lên men thiết bị lên men tự động, sau 18h hàm lượng kẽm trung bình sinh khối đạt 15,56 ± 0,71 mg/g với lượng sinh khối tương ứng 1,51 ± 0,11 g/100ml Lượng sinh khối thu tăng 121% so với lượng sinh khối lên men điều kiện tối ưu bình tam giác (1,25 ± 0,11 g/100ml) 13 3.3 Nghiên cứu nâng cao hiệu lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm phương pháp lên men bổ sung môi trường Động học q trình phát triển khả tích lũy kẽm Hàm lượng kẽm sinh khối (mg/g) Nồng độ đường khử (g/100ml) 20 3.5 15 2.5 10 1.5 Lượng sinh khối khô (g/100ml) Lượng kẽm sinh khối (mg/g) Nồng độ đường khử (g/100ml) nấm men thể hình 3.6 0.5 0 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h 36h Thời gian (h) Hình 3.6 Động học trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm phương pháp lên men bổ sung môi trường Như vậy, so với phương pháp lên men theo mẻ phương pháp lên men có bổ sung môi trường làm tăng cường hiệu lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm Quá trình lên men theo mẻ cho hàm lượng kẽm trung bình sinh khối đạt 15,56 ± 0,51 mg/g với lượng sinh khối tương ứng 1,51 ± 0,09 g/100ml Trong đó, với phương pháp lên men có bổ sung mơi trường, hàm lượng kẽm trung bình sinh khối đạt 17,32 ± 0,54 mg/g với lượng sinh khối lên tới 2,16 ± 0,10 g/100ml Arakaki cộng (2011) tiến hành đánh giá khả thu hồi sinh khối nấm men giàu Cu phương pháp lên men gián đoạn lên men có bổ sung mơi trường thiết bị lên men 10 l, tự động điều chỉnh nồng độ oxi hòa tan mức 30% Kết cho thấy, lượng sinh khối sau lên men có bổ sung chất đường mía tăng 48% so với lên men theo phương pháp gián đoạn Đồng thời, tỉ lệ 14 tích lũy Cu tăng từ 91,98% lên tới 100% phương pháp lên men có bổ sung mơi trường [23] Hình thái tế bào S cerevisiae A112 trước bổ sung muối kẽm sulphat sau bổ sung kẽm sulphat nồng độ 1,5 g/l đánh giá (hình 3.7) a Hình ảnh tế bào trước b Hình ảnh tế bào sau bổ bổ sung ZnSO4 sung ZnSO4 1,5 g/l Hình 3.7 Hình ảnh S cerevisiae kính hiển vi điện tử qt Kết hình 3.25 cho thấy, kích thước tế bào nấm men trước bổ sung muối kẽm sulphat vào khoảng 6,6 ± 0,8 µm sau bổ sung muối kẽm sulphat 4,9 ± 0,9 µm Như vậy, nghiên cứu tế bào nấm men S.cerevisiae A112 có sụt giảm kích thước ni mơi trường có chứa kẽm Kết phù hợp với nghiên cứu Małgorzata cộng (2006), nghiên cứu cho rằng, nuôi dưỡng môi trường ưu trương chứa nồng độ kẽm cao nồng độ kẽm nội bào, tế bào sinh vật có xu hướng co lại giảm thể tích chúng Do chênh lệch áp suất thẩm thấu, chúng giảm tới 60% so với thể tích ban đầu [111] 3.4 Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm 3.4.1 Phá vỡ tế bào phương pháp tự phân Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, thời gian tới trình tự phân thể bảng 3.3 15 Bảng 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu thu hồi kẽm STT Nhiệt o độ ( C) pH Thời gian (giờ) Thông số 40 45 50 55 60 3,5 4,5 5,5 6,5 16 24 32 40 48 Hàm lượng protein dịch chiết (mg/ml) 2,27 ± 0,59 3,96 ± 0,98 4,85 ± 0,89 3,23 ± 1,03 1,08 ± 0,53 3,88 ± 0,99 4,34 ± 1,08 4,92 ± 0,99 2,03 ± 0,93 2,98 ± 0,37 4,11 ± 1,06 5,33 ± 0,79 5,57 ± 0,53 6,68 ± 1,18 6,28 ± 1,18 Hiệu thu hồi kẽm hữu (%) 18,83 ± 3,73 34,35 ± 2,54 39,14 ± 4,06 32,13 ± 3,58 7,36 ± 1,04 30,98 ± 5,73 36,63 ± 1,25 40,01 ± 4,58 17,93 ± 3,27 18,74 ± 1,93 40,65 ± 5,95 45,61 ± 5,38 45,86 ± 5,04 45,87 ± 3,57 45,90 ± 3,05 Như vậy, tăng nhiệt độ tự phân từ 40 đến 50oC, nồng độ protein dịch tự phân tăng dần đạt giá trị cực đại 4,85 mg/ml 50oC Nhận thấy, 50oC khả tự phân nấm men hiệu thu hồi kẽm đạt giá trị cao nên mức nhiệt lựa chọn cho trình tự phân nấm men Giá trị pH 5,5 cho khả tự phân tốt thể nồng độ protein giải phóng khỏi mơi trường hiệu thu hồi kẽm đạt giá trị cao Vì vậy, giá trị pH 5,5 lựa chọn cho trình tự phân thu nhận dịch chiết nấm men giàu kẽm Giá trị pH nằm khoảng pH mà tác giả Champane cộng (2003) đưa thực trình tự phân Tác giả cho trình tự phân nấm men diễn khoảng pH từ 4-6 [39] Đồng thời, để đảm bảo hiệu kinh tế cho sản xuất trình tự phân kết thúc thời điểm 24 16 3.4.2 Phá tế bào kết hợp trình tự phân thuỷ phân enzyme Bổ sung enzyme protease vào trình phá vỡ tế bào sau tự phân giúp tăng hiệu thu hồi kẽm so với mẫu đối chứng không bổ sung chế phẩm Việc bổ sung enzyme Flavourzyme nồng độ 0,4% 2h cho khả phá vỡ tế bào cao, hiệu thu hồi kẽm tăng từ 45,26% lên tới 70,15% 3.5 Phương pháp nâng cao chất lượng cảm quan, khử màu , khử mùi dịch thủy phân nấm men 3.5.1 Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến q trình khử màu, mùi dịch thủy phân nấm men thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến q trình khử màu, mùi Nồng độ than hoạt tính (%) (đối chứng) Tỉ lệ hao hụt kẽm (%) 3,05 ± 0,14 3,62 ± 0,25 4,87 ± 0,38 6,34 ± 0,51 8,25 ± 0,55 OD (550nm) 1,18 ± 0,09 0,78± 0,04 0,31± 0,04 0,10 ± 0,03 0,09 ± 0,03 0,08 ± 0,02 Đánh giá cảm quan Dịch đục, màu nâu, mùi nấm men đặc trưng Dịch đục, màu nâu, mùi nấm men đặc trưng Dịch đục, màu nâu nhạt, không mùi Dịch trong, không màu, không mùi Dịch trong, không màu, không mùi Dịch trong, không màu, không mùi Kết cho thấy, nồng độ than hoạt tính cao khả khử màu mùi dịch chiết nấm men tốt Tuy nhiên, hao hụt thể tích dịch chiết nấm men kẽm dịch chiết nấm men lớn, khó khăn việc loại than, tăng chi phí sản xuất Nhận thấy, nồng độ than hoạt tính bổ sung 3% cho dịch chiết sau lọc trong, không mùi với tỉ lệ hao hụt kẽm mức vừa phải 4,87% nên nồng độ lựa chọn cho q trình xử lí màu mùi dịch chiết 17 3.5.2 Ảnh hưởng thời gian xử lý đến trình khử màu, mùi dịch thủy phân nấm men Ảnh hưởng thời gian đến trình khử màu dịch nấm men than hoạt tính thể bảng 3.31 Bảng Ảnh hưởng thời gian đến trình khử màu, mùi dịch thủy phân Thời gian (phút) OD (550nm) (ĐC) 1,17 ± 0,09 30 0,896 ± 0,09 60 0,437 ± 0,08 90 0,11 ± 0,03 120 0,095 ± 0,03 Hao hụt kẽm % 3,25 ± 0,09 3,82 ± 0,11 4,58 ± 0,29 5,01 ± 0,36 Đánh giá cảm quan Dịch đục, màu nâu, mùi dịch chiết nấm men đặc trưng Dịch đục, màu nâu, có mùi nồng Dịch đục, có màu nâu nhạt, mùi nồng giảm mạnh Dịch trong, không màu, không mùi Dịch trong, không màu, không mùi Có thể thấy, việc xác định thời gian xử lí cần thiết cho trình khử màu, khử mùi dịch chiết Kết cho thấy, tăng thời gian xử lí than hoạt tính từ 30 đến 120 phút, tỉ lệ hao hụt kẽm tăng từ 3,25 đến 5,01 % Đồng thời, thời gian xử lí than hoạt tính thơng số có ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu khử màu, khử mùi dịch chiết nấm men Thời gian xử lí than hoạt tính từ 30 tới 60 phút chưa đủ để khử màu mùi dịch chiết, thể giá trị OD (0,437) ngưỡng cao Khi tăng thời gian xử lí than lên 90-120 phút cho giá trị quang OD thấp tương đương nhau, dịch chiết nấm men trong, không màu, không mùi Hơn nữa, xử lí than hoạt tính 90 phút, tỉ lệ hao hụt kẽm 4,58 %, thấp so với thời điểm120 phút Vì vậy, để rút ngắn thời gian cho q trình xử lí dịch, thời gian 90 phút lựa chọn thơng số cho q trình khử màu, khử mùi dịch chiết nấm men giàu kẽm 18 3.6 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu quy mô thực nghiệm Chủng nấm men S cerevisiase A112 Hoạt hóa (YM, 30oC, 24h) Nhân giống (YM glucose 50g/l, 30oC, 24h) Chất phá bọt Lên men (ZnSO4 1,5g/l,30oC, pH 6, 24h) Muối kẽm ZnSO4 Ly tâm thu, rửa sinh khối lần (6000 vòng/phút) Tự phân (50oC, pH 5,5, 24 giờ) + Thủy phân (0,4% Flavourzyme 50oC, pH 5,5, giờ) Ly tâm thu dịch chiết (6000rpm) Khử màu, mùi (than hoạt tính 3%, 80oC) Loại thành tế bào Cơ đặc (nhiệt độ 75oC, 15oBx, giờ) Sấy phun (95oC, 5l/giờ, 15% Maltodextrin) Bột nấm men giàu kẽm Hình 3.8 Quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm quy mơ thực nghiệm 19 Thuyết minh quy trình cơng nghệ Chuẩn bị môi trường: Môi trường lên men chuẩn bị theo thành phần: 100 g/l glucose; g/l yeast extract; MgSO4 0,5 g/l; KH2PO4 g/l; Fe2(SO4)3 0,1 g/l; ZnSO4 1,5 g/l Dùng NaOH 1M để chỉnh pH Môi trường tiệt trùng 121oC thời gian 15 phút Muối kẽm sulphat chuẩn bị tiệt trùng bình riêng với hàm lượng dịch 150g/l Nhân giống: Các chủng nấm men có khả tích lũy kẽm cao lưu trữ nitơ lỏng ống thạch nghiêng hoạt hóa mơi trường YM lỏng Sau đó, chủng giống nhân ni mơi trường có chứa glucose 50g/l, cao nấm men 10g/l, pepton 5g/l, malt extract 3g/l, pH 4,5 chế độ lắc 150 rpm, nhiệt độ 30oC khoảng thời gian 24 Giống nên sử dụng sau kết thúc 24 nhân nuôi, mật độ giống cần đạt từ 109 CFU/ml Lên men: Chủng nấm men bổ sung vào môi trường lên men với tỉ lệ 8% (theo tỉ lệ thể tích với thể tích mơi trường) Nấm men nuôi điều kiện nhiệt độ 30oC, chế độ khuấy 200 vòng/phút Sau thời gian tiếp giống bổ sung dịch muối kẽm sulphat chuẩn bị cho tỷ lệ muối kẽm đạt 1,5g/l so với thể tích mơi trường Sau 12 giờ, bổ sung mơi trường dinh dưỡng với tốc độ tiếp dịch 20 l/giờ, trì nồng độ oxi hòa tan mức mg/l Tiếp tục nuôi cấy điều kiện đến 24 Ly tâm: Dịch lên men làm lạnh xuống nhiệt độ 10oC, để lắng Dịch men sau lắng mang ly tâm để thu sinh khối nấm men điều kiện 9000g Rửa sinh khối: Sinh khối nấm men (dạng sệt) hòa lại với nước khử ion theo tỷ lệ khối lượng là: Sinh khối: nước = 1:5 Bật chế 20 độ khuấy sau để lắng Sau cho ly tâm thu sinh khối loại nước Lặp lại trình rửa sinh khối lần Tự phân + thủy phân enzyme: Sinh khối nấm men pha với dung dịch đệm acetat với tỉ lệ: : (v/v), chỉnh pH 5,5 HCl 1M, bổ sung 5% (w/v) NaCl 5% (v/v) ethanol 95%, tự phân 24 nhiệt độ 50oC Dịch sau tự phân bổ sung thêm 0,4% enzyme Flavourzyme, thủy phân Ly tâm thu dịch chiết: Hỗn dịch sau thủy phân ly tâm thu dịch chiết, loại thành tế bào điều kiện 6000 vòng/phút thời gian 15 phút Thành tế bào rửa lần nước cất để thu hồi dịch chiết chứa kẽm bám dính vỏ tế bào Khử màu, mùi: Dịch chiết bổ sung thêm 3% than hoạt tính, làm nóng tới 80oC, giữ thời gian 90 phút Sau đó, than loại cách lọc qua máy lọc khung đến dịch sau lọc trong, không mùi, giá trị OD550 < 0,1 Cô đặc: Dịch thu sau khử màu, mùi mang cô đặc thiết bị cô quay chân không nhiệt độ 75oC, thời gian 120 phút đến dịch đạt 15oBx Sấy phun thu sản phẩm: Tiến hành sấy phun thu sản phẩm bột chiết nấm men giàu kẽm chế độ nhiệt đầu 95oC, tốc độ bơm dịch l/giờ, chất trợ sấy (maltodextrin) 15 % so với chất khô hòa tan 3.7 Kết thử nghiệm kiểm tra độc tính khả hấp thu phân bố kẽm thể chuột thí nghiệm Bột nấm men giàu kẽm (ZnY) thử nghiệm bước tiền khảo sát độc tính cấp chuột thí nghiệm dòng Bal b/c Kết cho thấy, chuột ăn uống, di chuyển bình thường khơng có chuột chết tất lô nghiên cứu Theo phân loại chất độc theo đường uống tổ chức WHO (WorldHealth Organization, 1993), 21 Tổ chức Hợp tác Phát triển kinh tế giới (Organization for Economic Cooperation and Development - OECD), GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) mẫu thử nghiệm không gây độc liều tối đa, không xác định giá trị LD50 có giá trị LD50 > 5000 mg/kg thể trọng theo đường uống coi khơng độc không phân loại (unclassified) N h vậ y, bột chiết nấm men giàu kẽm (ZnY) thí nghiệm thuộc nhóm khơng gây độc theo đường uống Tiếp đó, khả hấp thu phân bố kẽm thể chuột thí nghiệm kẽm dạng hữu - ZnY kẽm dạng vô ZnSO4 nghiên cứu đánh giá 100 ZnY Hàm lượng kẽm (µg/ml) 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 Hàm lượng kẽm (µg/g) ZnSO4 80 ZnY ZnSO4 60 40 20 1h 3h 6h 12h Xương Gan Thận Lách 24h Thời gian (h) Tim Mô thể (A) (B) Hình 3.9 Nồng độ kẽm huyết (A) mơ (B) chuột thí nghiệm sau uống ZnY, ZnSO4 liều mg/kgP Kết cho thấy, hàm lượng kẽm huyết đạt giá trị cao sau 3h uống bổ sung nguồn kẽm Tại thời điểm 3h, lô chuột bổ sung ZnY có nồng độ kẽm huyết đạt 3,56 ± 0,37 µg/ml lơ chuột uống ZnSO4 nồng độ kẽm huyết đạt 2,73 ± 0,31 µg/ml Chuột uống ZnY có hàm lượng kẽm huyết cao mô so với bổ sung ZnSO4 (p < 0,05) Kết 22 phù hợp với nghiên cứu Salgueiro cộng (2000) [134] Zhang cộng (2018) nghiên cứu khả hấp thu, phân bố, tiết sinh khả dụng kẽm sulphate, kẽm gluconate ZnY chuột thí nghiệm cho ZnY có khả hấp thu dự trữ thể tốt hai dạng kẽm lại [172] Có thể nhận thấy, hàm lượng kẽm tích lũy mơ xương, gan, thận, lách, tim chuột có bổ sung ZnY cao so với ZnSO4 Điều cho thấy khả hấp thu Zn sinh khả dụng kẽm hữu chuyển hóa nấm men (ZnY) cao so với muối kẽm vô (ZnSO4) Khi đánh giá sinh khả dụng nguồn muối kẽm từ nấm men, chelate kẽm sulphat, Vinson Bose (1981) cho ZnY dạng tồn kẽm có tính sinh khả dụng cao Đồng thời, nghiên cứu ZnY dạng tốt để bổ sung nguyên tố vi lượng cho thể [156] KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu, luận án đạt số kết luận sau:  Từ 121 chủng nấm tuyển chọn 02 chủng nấm men có khả tích lũy kẽm cao Sau định tên phương pháp sinh học phân tử, xác định tên loài chủng tuyển chọn S.cerevisiae A112 S.cerevisiae 4087  Dạng kẽm nấm men chủ yếu tồn dạng liên kết với hợp chất hữu Kẽm dạng hữu chiếm tỉ lệ cao sinh khối chủng S.cerevisiae A112 đạt giá trị 88,17 %  Đã xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho q trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm với hàm lượng 15mg/g mơi 23 trường có chứa 100 g/l glucose, g/l yeast extract, ZnSO4 bổ sung vào môi trường nuôi cấy nồng độ 1,5 g/l thời điểm 9h Sau lên men theo phương pháp gián đoạn, hàm lượng kẽm sinh khối đạt 15,56 ± 0,51 mg/g với lượng sinh khối 1,51 ± 0,09 g/100ml  Đã nghiên cứu nâng cao lượng sinh khối nấm men giàu kẽm phương pháp lên men có bổ sung mơi trường Kết hàm lượng kẽm trung bình sinh khối đạt17,32 ± 0,54 mg/g với lượng sinh khối lên tới 2,16 ± 0,10 g/100ml  Đã sử dụng phương pháp tự phân theo sau sử dụng enzyme Flavourzyme để thu hồi dịch chiết nấm men giàu kẽm Các điều kiện trình tự phân: pH=5,5, tự phân 50oC 24 giờ, bổ sung protease 0,4% Các điều kiện cho trình khử màu, mùi dịch thủy phân sau: nồng độ chất khơ dịch chiết 15%, than hoạt tính % 80oC, 90 phút Sấy phun thu hồi sản phẩm dạng bột chế độ 95oC, tốc độ bơm dịch l/h, bổ sung 15% maltodextrin  Đã xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm ứng dụng sản xuất quy mô thực nghiệm Viện Công nghiệp thực phẩm Kết tạo chế phẩm nấm men giàu kẽm với: hàm lượng kẽm 16,8 mg/g, đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm Đã tiến hành thử nghiệm độc tính chế phẩm động vật thí nghiệm cho độ an toàn cao Khả hấp thu sinh khả dụng kẽm hữu chuyển hóa nấm men cao so với muối kẽm vô KIẾN NGHỊ  Nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu phế phụ phẩm nông nghiệp rỉ đường thay nguồn cacbon, khô đậu tương thay nguồn nitơ để giảm chi phí sản xuất tăng tính cạnh tranh sản phẩm thị trường 24 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Trang, Lê Đức Mạnh, Nguyễn Thị Minh Khanh, Trịnh Thanh Hà, Lê Thị Thắm, Phạm Thu Trang, Lê Hồng Quang (2017) Sàng lọc chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả tích lũy kẽm cao, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 20(9): 50-53 Nguyễn Thị Trang, Lê Đức Mạnh, Nguyễn Thị Minh Khanh, Đỗ Thị Thảo, Nguyễn Thị Cúc, Đỗ Thị Phương, Nguyễn Thị Nga, Chu Đình Bính (2018) So sánh hấp thu, hoạt tính sinh học kẽm sulphat chiết xuất nấm men giàu kẽm chuột, Hội nghị khoa học cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2018, 1739-1743 Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Minh Khanh, Lê Hồng Quang, Lê Đức Mạnh, Lê Thị Thắm, Chu Đình Bính, Nguyễn Mạnh Hà, Vũ Thị Hồng Ân (2018) Tối ưu hóa điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, Tạp chí Sinh học, 40(2se): 144-148 Khanh N.T.M., Trang N.T., Manh L.D., and Quang L.H (2018) New Strain Saccharomyces cerevisiae A112 for the Production of Zinc-Fortified Biomass Food Processing: Techniques and Technology, 48 (4): 114–120 (In Russ.) Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Minh Khanh, Lê Hồng Quang, Lê Đức Mạnh, Nguyễn Kim Thoa, Chu Đình Bính (2018) Phân tích dạng tồn kẽm mẫu nấm men, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (Đang q trình in ấn) ... sảnxuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung thực Mục tiêu nghiên cứu  Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm. .. kẽm dạng vô [56] Việc nghiên cứu khoa học để tạo quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm bột nấm men giàu kẽm cần thiết Những nhu cầu thực tiễn nêu sở để đề tài: Nghiên cứu công nghệ sảnxuất bột. .. nấm men giàu kẽm  Nghiên cứu nâng cao hiệu lên men phương pháp lên men bổ sung môi trường  Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm Phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm