16.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT KHUẨN Một sản phẩm coi vơ trùng hồn tồn khơng chứa sinh vật sống Phương pháp tiệt trùng phương pháp làm cho sản phẩm trở thành vơ trùng Do khơng thể phá hủy tồn lơ sản phẩm sau tiệt trùng để kiểm tra nên độ vơ trùng sản phẩm vơ trùng đảm bảo cách áp dụng qui trình sản xuất thẩm định thích hợp Đối với qui trình tiệt trùng chọn phải tiến hành khảo sát để đảm bảo hiệu tiệt trùng tính tồn vẹn sản phẩm, bao gồm vật chứa bao gói bên ngồi, trước áp dụng vào thực tế Trong trình sản xuất phải tuân thủ qui trình tiệt trùng thẩm định Nếu có thay đổi lớn qui trình tiệt trùng, bao gồm thay đổi kích cỡ lơ, phải tái thẩm định qui trình Trong xây dựng qui trình sản xuất thuốc vô trùng phải tuân theo nguyên tắc thực hành tốt sản xuất GMP, cụ thể là: - sử dụng công nhân lành nghề trải qua q trình huấn luyện thích hợp, - thiết kế nhà xưởng phù hợp, - thiết kế máy móc, thiết bị sản xuất cho dễ vệ sinh tiệt trùng, - áp dụng biện pháp phòng ngừa thích hợp nhằm làm giảm số lượng vi sinh vật sản phẩm trước tiệt trùng, - thẩm định qui trình sản xuất cho tất công đoạn dây chuyền sản xuất có nguy nhiễm khuẩn cao, - thiết lập thực thi chương trình giám sát chất lượng mơi trường sản xuất qui trình kiểm tra q trình Các phương pháp mơ tả chủ yếu dùng để diệt loại bỏ vi khuẩn, nấm men nấm mốc khỏi sản phẩm cần tiệt trùng Đối với sản phẩm sinh học có nguồn gốc từ người hay động vật, trình thẩm định phải chứng minh khả loại bỏ hay làm bất hoạt virus qui trình tiệt trùng Nếu có thể, nên ưu tiên chọn phương pháp tiệt trùng sản phẩm bao bì cuối Nếu khơng thể sử dụng phương pháp khác, loại vi khuẩn phương pháp lọc qua màng lọc giữ lại vi khuẩn hay phương pháp sản xuất vô trùng Trong trường hợp, vật chứa nút đậy phải có khả trì tính vơ trùng sản phẩm hết hạn dùng Mức bảo đảm vô trùng Sự khử khuẩn tác nhân vật lý hóa học tuân theo qui luật số mũ, ln ln có khả vi sinh vật sống tồn sản phẩm sau tiệt trùng với xác suất thống kê định Mức bảo đảm vô trùng SAL (sterility assurance level) qui trình tiệt trùng cho xác xuất tồn đơn vị đóng gói khơng vơ trùng tồn lô sản phẩm sau tiệt trùng qui trình Ví dụ: SAL = 10-6 có nghĩa có khả có khơng nhiều vi sinh vật sống x 10 đơn vị đóng gói sản phẩm tiệt trùng Đối với qui trình tiệt trùng cho, SAL phụ thuộc số lượng vi sinh vật có sản phẩm trước tiệt trùng, sức đề kháng với tác nhân tiệt trùng mơi trường vi sinh vật tồn q trình xử lý Khi có thể, sử dụng mức bảo đảm vô trùng SAL để đánh giá hiệu tiệt trùng phương pháp mô tả chuyên luận SAL qui trình tiệt trùng thiết lập thẩm định qui trình Phương pháp điều kiện tiệt trùng Tiến hành tiệt trùng theo phương pháp giới thiệu Có thể cải tiến kết hợp phương pháp giới thiệu, nhiên phải tiến hành thẩm định phương pháp cải tiến để bảo đảm hiệu tiệt trùng phương pháp để đảm bảo tính tồn vẹn sản phẩm cần tiệt trùng, bao gồm bao bì sản phẩm Đối với phương pháp tiệt trùng, phải theo dõi thông số vận hành quan trọng suốt trình tiệt trùng lô sản phẩm nhằm đảm bảo thông số đo phù hợp với thông số kỹ thuật thiết lập trước q trình thẩm định phương pháp, kể trường hợp tiệt trùng điều kiện chuẩn Phương pháp tiệt trùng sản phẩm bao bì cuối Đối với phương pháp tiệt trùng sản phẩm bao bì cuối, điểm quan trọng cần phải ý phân bố không đồng tác nhân tiệt trùng buồng tiệt trùng Với sản phẩm cần tiệt trùng, có kiểu bao bì kích thước bao bì khác nhau, phải xác định vị trí mà tác nhân tiệt trùng khó ln chuyển đến buồng tiệt trùng (ví dụ, vị trí có nhiệt độ thấp nồi hấp) Tiệt trùng nhiệt ẩm Phương pháp tiệt trùng nhiệt ẩm tiến hành thiết bị chuyên dùng gọi nồi hấp, tác nhân tiệt trùng nước bão hòa áp suất cao Đây phương pháp ưu tiên chọn lựa, có thể, dung dịch nước Điều kiện chuẩn phương pháp tiệt trùng nhiệt ẩm đun nóng 121 oC 15 phút sản phẩm cần tiệt trùng dung dịch nước bao bì cuối Có thể tiến hành tiệt trùng điều kiện nhiệt độ thời gian khác với điều kiện chuẩn chứng minh hiệu chế độ tiệt trùng chọn Phải khống chế số lượng vi sinh vật sản phẩm trước tiệt trùng cách áp dụng qui trình sản xuất biện pháp phòng ngừa thích hợp để đạt mức bảo đảm vô trùng SAL = 10 -6 hay nhỏ Trong trình tiệt trùng, phải theo dõi ghi chép lại nhiệt độ áp suất bên nồi hấp Nhiệt độ thường theo dõi đầu dò nhiệt đặt phần nguội nồi hấp Thơng số vận hành chu trình tiệt trùng ghi lại dạng biểu đồ nhiệt độ - thời gian, hay cách thích hợp khác Nếu kiểm tra hiệu trình tiệt trùng phương pháp sinh học, dùng thị sinh học thích hợp theo phụ lục Chỉ thị sinh học dùng cho tiệt khuẩn Tiệt trùng nhiệt khô Tiệt trùng nhiệt khô thực tủ sấy có gắn thiết bị đối lưu khơng khí để đảm bảo phân phối nhiệt đồng toàn khoang tiệt trùng Điều kiện chuẩn phương pháp tiệt trùng nhiệt khô sấy nhiệt độ tối thiểu 160 oC Có thể tiến hành tiệt trùng điều kiện nhiệt độ thời gian khác với điều kiện chuẩn chứng minh hiệu chế độ tiệt trùng chọn Phải khống chế số lượng vi sinh vật sản phẩm trước tiệt trùng cách áp dụng qui trình sản xuất biện pháp phòng ngừa thích hợp để đạt mức bảo đảm vô trùng SAL = 10-6 hay nhỏ Trong trình tiệt trùng phải tiến hành theo dõi nhiệt độ bên tủ sấy Nhiệt độ thường đo đầu dò nhiệt đặt phần nguội tủ sấy Phải ghi chép lưu trữ thông số nhiệt độ chu trình tiệt trùng Nếu kiểm tra hiệu trình tiệt trùng phương pháp sinh học, dùng thị sinh học thích hợp theo phụ lục Chỉ thị sinh học dùng cho tiệt khuẩn Tiệt trùng khử chất gây sốt dụng cụ thủy tinh thường tiến hành nhiệt độ cao 220 o C Trong trường hợp này, thay thị sinh học nội độc tố vi khuẩn bền nhiệt Để kiểm tra trình tiệt trùng, cấy hay nhiều vật liệu cần tiệt trùng với 1000 đơn vị nội độc tố vi khuẩn Lượng nội độc tố lại sau sấy tiệt trùng phải khơng nhiều 1/1000 so với lượng nội độc tố ban đầu Xem phụ lục Thử nội độc tố vi khuẩn để biết thêm chi tiết phương pháp định lượng nội độc tố Tiệt trùng xạ ion hóa Phương pháp tiến hành cách cho sản phẩm bao bì cuối tiếp xúc với xạ ion hóa Hai nguồn xạ ion hóa thường dùng : tia γ phát từ nguồn phóng xạ thích hợp (ví dụ đồng vị phóng xạ Cobalt 60), chùm electron lượng cao gia tốc máy gia tốc electron Đối với phương pháp tiệt trùng xạ ion hóa, liều hấp thu chuẩn 25 kGy Có thể tiến hành tiệt trùng với liều hấp thu khác với liều hấp thu chuẩn chứng minh hiệu chế độ tiệt trùng chọn Phải khống chế số lượng vi sinh vật sản phẩm trước tiệt trùng cách áp dụng qui trình sản xuất biện pháp phòng ngừa thích hợp để đạt mức bảo đảm vơ trùng SAL = 10-6 hay nhỏ Trong trình tiệt trùng phải định kỳ đo xạ hấp thu sản phẩm cần tiệt trùng thiết bị đo liều thích hợp Thiết bị đo liều phải hiệu chỉnh với nguồn xạ chuẩn năm lần Nếu kiểm tra hiệu trình tiệt trùng phương pháp sinh học, dùng thị sinh học thích hợp theo phụ lục Chỉ thị sinh học dùng cho tiệt khuẩn Tiệt trùng chất khí Chất khí thường dùng phương pháp ethylen oxyd Đây loại khí dễ cháy, có khả gây đột biến để lại vết chất độc vật liệu đem tiệt trùng, nên chọn phương pháp chọn phương pháp khác Phải có biện pháp thích hợp để bảo đảm thẩm thấu khí ẩm vào bên vật liệu cần tiệt trùng làm giảm lượng ethylen oxyd sản phẩm phân hủy sản phẩm tiệt trùng xuống mức gây nguy hiểm sử dụng sản phẩm Khi có thể, nên theo dõi ghi chép nồng độ khí, độ ẩm tương đối, nhiệt độ thời gian tiệt trùng lô tiệt trùng Kiểm tra hiệu lô tiệt trùng thị sinh học thích hợp (xem phụ lục 16.2 Chỉ thị sinh học dùng cho tiệt khuẩn) Tiệt trùng phương pháp lọc Phương pháp lọc thường dùng để tiệt trùng dung dịch bền nhiệt, tiệt trùng bao bì cuối Nguyên tắc phương pháp dẫn dung dịch cần tiệt trùng qua vật liệu lọc có khả giữ vi khuẩn Vật liệu lọc thường dùng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm hay nhỏ hơn, có khả giữ lại 100% vi khuẩn Pseudomonas diminuta (ATCC 19146, NCIMB 11091, CIP 103020) điều kiện thí nghiệm thích hợp Kiểm tra khả giữ khuẩn màng lọc cách lọc qua màng lọc hỗn dịch vi khuẩn Pseudomonas diminuta môi trường nuôi cấy tryptone soya broth, hay mơi trường dinh dưỡng tương đương, có nồng độ thích hợp cho cm2 bề mặt màng lọc có 107 cfu tốc độ lọc lớn 30 Psi Ủ dịch lọc 32 oC điều kiện hiếu khí Phải khơng có vi khuẩn phát triển Qui trình sản xuất mơi trường sản xuất sản phẩm tiệt trùng phương pháp lọc phải thiết kế thích hợp để giảm thiểu tối đa nhiễm khuẩn Phải thường xuyên kiểm tra chất lượng mơi trường sản xuất chương trình giám sát chất lượng môi trường thẩm định Các máy móc, thiết bị, vật chứa nắp đậy phải tiệt trùng trước sử dụng phương pháp thích hợp Vị trí lọc tiệt trùng nên bố trí gần nơi đóng ống tốt thời điểm tiệt trùng nên bố trí gần thời điểm đóng ống tốt Tất thao tác sau lọc tiệt trùng phải thực điều kiện vô trùng Cần có biện pháp thích hợp để tránh hấp thu hoạt chất màng lọc, để tránh tạp chất từ màng lọc vào dịch lọc Trước lọc phải kiểm tra để đảm bảo màng lọc khơng bị rách q trình lắp ráp tiệt trùng hệ thống lọc, sau lọc xong phải kiểm tra tính tồn vẹn màng lọc phương pháp thích hợp, ví dụ phương pháp đo áp suất điểm sủi bọt (bubble-point test) hay phương pháp đo chênh áp suất trước sau qua màng lọc (pressure hold test) Vì hiệu trình lọc tiệt trùng phụ thuộc vào số lượng vi sinh vật sản phẩm trước lọc nên làm giảm số lượng vi sinh vật phương pháp khác, nên lọc trước dung dịch cần tiệt trùng qua tiền lọc có khả giữ khuẩn Sản xuất vơ trùng Trong q trình sản xuất vơ trùng, sản phẩm chờ đóng gói, vật chứa rỗng nắp đậy tiệt trùng riêng rẽ sau kết hợp với điều kiện vô trùng để thu sản phẩm cuối Bởi sản phẩm đóng gói khơng tiệt trùng bổ sung phương pháp khác nên q trình đóng gói phải tiến hành điều kiện mơi trường có chất lượng cao Trước phối hợp, thành phần sản phẩm cuối phải tiệt trùng riêng phương pháp thích hợp, ví dụ nhiệt khơ với vật chứa thủy tinh, nhiệt ẩm với nắp đậy nhựa phương pháp lọc dung dịch Để trì tính vơ trùng thành phần trình sản xuất phải ý đến yếu tố sau: - môi trường sản xuất, - người, - bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm hở, - qui trình tiệt trùng vật liệu bao gói qui trình vận chuyển chúng vào khu vực đóng gói, - thời gian lưu trữ tối đa sản phẩm chờ đóng gói trước đóng vào bao bì cuối Để đảm bảo tính vơ trùng sản phẩm cuối, qui trình tiệt trùng qui trình đóng gói phải thẩm định phương pháp thích hợp trước áp dụng thực tế Thẩm định qui trình đóng gói phải bao gồm thử nghiệm dùng môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật thay cho sản phẩm thật (media fill test) Phải lấy mẫu để kiểm tra độ vô trùng tất lô sản phẩm tiệt trùng phương pháp lọc và/hoặc sản xuất vô trùng trước xuất xưởng (Xem phụ lục Thử độ vô trùng để biết thêm chi tiết)