TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật HÀ NỘI - 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học TS CAO BÁ CƯỜNG HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo Cao Bá Cường, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo khoa Sinh KTNN thầy cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho em trình làm thực nghiệm để em hồn thành khóa luận Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Do lần đầu em tham gia nghiên cứu khoa học, kiến thức hạn chế nên khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy bạn để khóa luận tốt nghiệp em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Hoàng Thị Quỳnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài tơi thực hướng dẫn TS Cao Bá Cường Tất số liệu thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, khơng có số liệu chép hay bịa đặt, không trùng với kết công bố Những trích dẫn khóa luận lấy từ cơng bố thức có ghi rõ ràng Nếu sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Hoàng Thị Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vật liệu cellulose (VLC) 1.1.1 Vi khuẩn tổng hợp lên VLC 1.1.2 Môi trường nuôi cấy G Xylinus 1.1.3 Cấu trúc VLC 1.1.4 Tính chất VLC 1.1.5 Ứng dụng VLC 1.2 Tình hình nghiên cứu VLC 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 Tổng quan NS 1.3.1 Công thức cấu tạo 1.3.2 Tính chất lí hóa 1.3.3 Dược lý học dược động học 1.3.4 Chỉ định chống định 1.4 Tình hình nghiên cứu NS 10 1.4.1 Trên giới 10 1.4.2 Tại Việt Nam 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Vật liệu nghiên cứu 11 2.1.1.Chủng vi khuẩn 11 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 11 2.1.3 Trang thiết bị 11 2.2 Phương pháp nghiên cứu 11 2.2.1 Chuẩn bị VLC 11 2.2.2 Chế tạo VLC nạp NS 13 2.2.3 Phương pháp xử lí thống kê 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Thu VLC tinh chế màng 16 3.1.1 Thu VLC từ môi trường lên men 16 3.1.2 Tạo VLC tinh khiết 16 3.1.3 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết củaVLC 17 3.2 Phương trình đường chuẩn NS PBS (pH = 7,4) 18 3.3 Xác định lượng thuốc NS nạp vào VLC 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VLC Vật liệu cellulose G.xylinus Gluconacetobacter xylinus NS Neomycin sulfate OD PBS Mật độ quang phổ Phosphate buffered saline S.fradiae Streptomyces fradiae DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng nước dừa già 100g [9] Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men thu VLC 12 Bảng 2.2 Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 13 Bảng 3.1 Mật độ quang dung dịch Neomycin sufate nồng độ (n = 3) 18 Bảng 3.2 Giá trị OD hấp thụ thuốc NS VLC (n = 3) 19 Bảng 3.3 Khối lượng, hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC(n=3) 20 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học VLC Hình 1.2 Cấu trúc VLC (Yamanaka et al, 2000) Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo Neomycin sunfate [27] Hình 3.1 VLC ni cấy ngày 16 Hình 3.2.VLC thơ sau thu 16 Hình 3.3 VLC 0,5 cm tinh chế 17 Hình 3.4 Thí nghiệm kiểm tra độ tinh khiết VLC 17 Hình 3.5 Phương trình đường chuẩn thuốc NS 18 Hình 3.6 VLC hấp thụ thuốc NS 19 Hình 3.7 Khối lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC( 0,3cm) VLC(0,5cm) giờ, 1,5 giờ, 21 Hình 3.8 Hiệu suất hấp thụ thuốc NS VLC(0,3cm) VLC(0,5cm) giờ, 1,5 giờ, 21 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu VLC tinh chế màng 3.1.1 Thu VLC từ môi trường lên men G xylinum cho vào môi trường nước dừa già sử dụng chất dinh dưỡng nước dừa già để tổng hợp nên Cellulose VLC dày lên dần đến môi trường hết chất dinh dưỡng Thời gian nuôi cấy khác nhau, ta thu VLC có độ dày khác Muốn thu VLC (0,3 cm) sau ni cấy tĩnh G xylinum ngày ta tiến hành thu màng Muốn thu VLC (0,5 cm ) sau nuôi cấy tĩnh G xylinum ngày Hình 3.1 VLC ni cấy ngày VLC thô sau lấy khỏi môi trường ni cấy có màu trắng đục, dẻo dai, đàn hồi tốt, khả chịu lực cao Hình 3.2 VLC thô sau thu 3.1.2 Tạo VLC tinh khiết VLC thô tinh chế qua bước: 19 Bước 1: Tách VLC thô khỏi môi trường nuôi cấy, ép bỏ bớt nước Bước 2: Ngâm VLC 48 NaOH 3%, rửa ép Bước 3: Ngâm tiếp HCl 3% 48 giờ, sau bỏ rửa ép loại bỏ nước Bước 4: Ngâm VLC 48 nước, sau bỏ kiểm tra tạp chất Bước 5: Thu VLC tinh chế Hình 3.3 VLC 0,5 cm tinh chế 3.1.3 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết củaVLC Sau kiểm tra độ tinh khiết màng, không thấy xuất kết tủa màu nâu dung dịch mẫu thử Chứng tỏ VLC khơng có Glucose Kết thể hình 3.4 Hình 3.4 Thí nghiệm kiểm tra độ tinh khiết VLC 20 3.2 Phương trình đường chuẩn NS PBS (pH = 7,4) Giá trị OD NS bước sóng 277 nm trình bày bảng 3.2 Bảng 3.1 Mật độ quang dung dịch Neomycin sufate nồng độ (n = 3) Nồng độ (mg/ml) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Giá trị OD 0,0049± 0,013± 0,021± 0,029± 0,037± 0,044± trung bình 0,0001 0,001 0,0015 0,001 0,002 0,0012 Đo OD nồng độ NS khác máy quang phổ UV – 2450 sau xử lí phần mềm Excel cho kết phương trình đường chuẩn NS là: Phương trình đường chuẩn: y = 0,1574x – 0,0027 (R = 0, 9995) Trong đó: y: Mật độ quang OD (Abs 277nm) x: Nồng độ % NS (mg/ml) R : Hệ số tương quan Phương trình đường chuẩn thuốc NS trình bày hình 3.5 21 Mật độ quang OD (Abs 277nm) OD277nm 0.05 0.045 0.04 0.035 0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 y = 0.1574x - 0.0027 R² = 0.9995 OD277nm Linear (OD277nm) 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ thuốc Neomycin sunfate (mg/ml) Hình 3.5 Phương trình đường chuẩn thuốc NS 22 3.3 Xác định lượng thuốc NS nạp vào VLC VLC sau tinh chế ta lấy giấy thấm bỏ 60% nước Chuẩn bị bình 250 ml, bình cho NS (2 mg/ml) tiếp tục cho dung dịch đệm PBS (pH= 7,4) đến vạch 100 ml Cho màng vào dung dịch vừa pha, rung động 180 vòng 40 C giờ, 1,5 giờ, đảm bảo cho màng hấp thụ tối đa VLCđang hấp thụ thuốc thể hình 3.6 Hình 3.6 VLC hấp thụ thuốc NS VLC sau cho vào dung dịch đệm PBS có chứa thuốc NS (2 mg/ml) lắc khoảng thời gian giờ, 1,5 giờ, lấy dung dịch đo quang phổ UV - 2450 để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng Mỗi mẫu đo OD lần, để lấy trung bình mẫu, sử dụng phần mềm Excel để phân tích thống kê số liệu, phân tích phương sai xác định khoảng tin cậy Bảng 3.2 Giá trị OD hấp thụ thuốc NS VLC (n = 3) Độ dày màng 0,3 cm 0,5 cm Thời gian hấp thụ thuốc Giá trị OD 0.0342 ± 0.0002 1,5 0.0316 ± 0.0004 0.0312 ± 0.0002 0.0396 ± 0.0032 1,5 0.0372 ± 0.0001 0.037 ± 0.0001 Kết bảng 3.2 cho thấy sau ngâm màng giá trị OD đo gần khơng giảm, chứng tỏ lượng thuốc hấp thụ vào màng đạt cực đại Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng hiệu suất thuốc hấp thụ vào màng thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Khối lượng, hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC(n=3) Độ dày Thời gian màng (cm) nuôi cấy (ngày) 0,3 0,5 Thời gian m2 (mg) mht(mg/cm ) EE (%) hấp thụ(giờ) 0,234 ± 0,0011 1,766 ± 0,0011 88,29 ± 0,0538 1,5 0,218 ± 0,0009 1,782 ± 0,0009 89,1 ± 0,046 0,215 ± 0,001 1,785 ± 0.001 89,23 ± 0,045092 0,257 ± 0,0008 1,743 ± 0,0008 87,15 ± 0,0416 1,5 0,254 ± 0,00052 1,746 ± 0,0005 87,31± 0,0261 0,253 ± 0,000973 1,747 ± 0,000973 87,37 ± 0,0465 khối lượng thuốc hấp thuốc hấp thụ (mg) 1.766 1.743 1.782 1.746 1.785 1.747 1.5 VLC 0,3 VLC 0,5 0.5 1.5 giờ Thời gian hấp thụ thuốc Hình 3.7 Khối lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC( 0,3cm) VLC(0,5cm) giờ, 1,5 giờ, Hiệu suất hấp thụ thuốc (%) 100 88.29 87.15 89 87.31 89.24 87.37 80 60 VLC 0,3 40 VLC 0,5 20 1,5 giờ Thời gian hấp thụ thuốc VLC Hình 3.8 Hiệu suất hấp thụ thuốc NS VLC(0,3cm) VLC(0,5cm) giờ, 1,5 giờ, Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.3, hình 3.7 hình 3.8 cho thấy: Hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC tương đối lớn chiếm 87% lượng thuốc ban đầu đem hấp thu Cùng độ dày màng, thời gian hấp thụ thuốc khác khối lượng thuốc hiệu suất hấp thụ thuốc vào màng khác nhau: - VLC (0,3 cm): Khi cho VLC hấp thu thuốc giờ, 1,5 giờ, khối lượng thuốc hấp thụ vào VLC là: 1,766 mg; 1,782 mg; 1,785 mg Hiệu suất hấp thụ thuốc vào VLC là: 88,29%; 89,1%; 89,23% - VLC (0,5 cm): Khi cho VLC hấp thu thuốc giờ, 1,5 giờ, khối lượng thuốc hấp thụ vào VLC là: 1,743 mg; 1,746 mg; 1,747 mg Hiệu suất hấp thụ thuốc vào VLC là: 87.15%; 87,31%; 87,37% Cùng độ dày màng, cho VLC hấp thụ thuốc NS khối lượng thuốc hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC thấp Khối lượng thuốc hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC cao cho VLC hấp thụ thuốc Trong khoảng thời gian để VLC hấp thụ thuốc, độ dày VLC có ảnh hưởng đến khối lượng hiệu suất thuốc NS hấp thụ vào VLC: - - VLC hấp thụ thuốc giờ, khối lượng hiệu suất thuốc nạp vào VLC ( 0,3cm), VLC (0,5cm) là: 1,766mg; 1,743mg; 88,29%; 87,15% Khi cho VLC hấp thụ thuốc 1,5 giờ, khối lượng hiệu suất thuốc nạp vào VLC là: 1,782mg; 1,746mg; 89,1%; 87, 31% - Khi cho VLC hấp thụ thuốc giờ, khối lượng hiệu suất thuốc nạp vào VLC là: 1,785mg; 1,747mg; 89,23%; 87,37% Như vậy, thời gian hấp thụ thuốc VLC (0,3cm) hấp thụ thuốc cao VLC (0,5cm) Kết thấy tương tự nghiên cứu tác giả Bùi Thị Huyền Trang [3], Hoàng Xuân Thủy [6] KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau hoàn thành xong khóa luận, chúng tơi thu kết sau: - Nuôi cấy thu VLC từ G xylinum môi trường nước dừa già - Xử lý, thu VLC tinh khiết với độ dày 0,3 cm 0,5 cm - VLC ( 0,3 cm) hấp thụ thuốc cao VLC (0,5 cm) giờ, 1,5 giờ, - Sự hấp thụ thuốc NS VLC đạt hiệu suất nạp thuốc cao 89,23% với điều kiện: độ dày màng 0,3 cm, chế độ lắc 180 vòng, thời gian hấp thụ thuốc 120 phút 40 c - Sự hấp thụ thuốc NS VLC đạt hiệu suất nạp thuốc thấp 87,15% với điều kiện: độ dày màng 0,5 cm, chế độ lắc 180 vòng, thời gian hấp thụ thuốc 60 phút 40 c Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ thuốc NS VLC từ chủng G xylinus, mơi trường khác như: nước mía, rỉ đường,… Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ loại thuốc khác VLC nhằm tăng tác dụng loại thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2007), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nxb Y học Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, trang 450- 452 Bùi Thị Huyền Trang (2017), “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc famotidin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già” Đinh Thị Kim Nhung (2012), Nghiên cứu thu nhận màng cellulose từ vi khuẩn Acetobacter, ứng dụng trị bỏng, đề tài trọng điểm cấp Bộ giai đoạn 2010 – 2012 Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học Hoàng Xuân Thủy (2018), “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc captopril màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già” Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng, Tạp chí Dược học, 361, 18 – 20 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành Hóa sinh học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Thanh (Chủ nhiệm) (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”, Đề tài KH&CN cấp Bộ, Bộ Y tế 10.Nguyễn Xuân Thành, Triệu Nguyên Trung, Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy, Phùng Thị Kim Huệ, (2018) “Tối ưu hóa hiệu suất nạp thuốc famotidin vật liệu cellulose vi khuẩn lên men từ dịch trà xanh theo phương pháp đáp ứng bề mặt mơ hình Box-Behnken”, Tạp chí dược học (501), trang Công nghệ (50), trang 453-462 11.Phạm Tiệp Vũ Ngọc Thúy (2009), Thuốc biệt dược cách sử dụng, NXB Y Hà Nội, trang 639 12 Phan Thị Thu Hồng cộng (2015), “Sử dụng cellulose tổng hợp từ vi khuẩn Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh học nhựa polyvinyl alcohol”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18 (4), trang 114-124 13 Alguacil J et al (2015), “Binding thermodynamics of paromomycin, neomycin, neomycin-dinucleotide and - diPNA conjugates to bacterial and human rRNA”, J Mol Recognit 14 Almeida I.F et al (2014), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin compatibility study”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 86(3), 332-336 15 Amita H Patel L and Riddhi M Dave (2015), “Formulation anh evaluation of sustained release in situ ophthalmic gel of neomycin sulphate”, Bulletin of Pharmaceutical Research ;5(1):1-5 16 Armando JD et al (2014),”Do bacterial cellulose membranes have potential in drug-delivery systems”, Expert Opin 17 Blanchard C et al (2015), “Neomycin Sulfate Improves the Antimicrobial Activity of Mupirocin-based Antibacterial Ointments”, Antimicrob Agents Chemother, pii: AAC,02083-15 18 Brown R.M (1999), Pure Appl Chem 71 19 Bworm E (2007), Bacterial cellulose Thermoplastic polymer namocomposites, Master of sciencein chaemical engineering, washington state university 20 Czaja W et al (2006), “Microbial cellulose – the natural power to heal wounds”, Biomaterials, 27, 145–151 21 Czaja W., Young D.J., Kawecki M., Browm R.M (2007) “The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications” Biomacromolecules, 8:1–12 22 Fontana J.D., et al (1990), “Acetobacter cellulose pellicle as a temporary skin substitute”, Appl Biochem Biotechnol, 24–25:253–264 23 Fukuda M, et al (2008), “Cimetidine inhibits salivary gland tumor cell adhesion to neural cells and induces apoptosis by blocking NCAM expression”, Cancer, 10(2407), – 376 24 Hestrin, S.; Schramm, M (1954) "Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum: II Preparation of freeze – dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose" Biochem J 58 (2): 345–352 25 Jong S.C et al (2015), “Novel neomycin sulfate-loaded hydrogel dressing with enhanced physical dressing properties and wound-curing effect”, Drug Deliv 26 Klemm D et al (2009), “Nanocellulose materials – different cellulose, different functionality”, Macromol Symp, 280, 60–71 27 Mohd C., et al - Bacterial Cellulose Film Coating as Drug Delivery System 28 Muhammad MA et al (2014), “A review of bacterial cellulose-based drug delivery systems: their biochemistry, current approaches and future prospects”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 66, pp 1047– 1061 29.Nguyen TX et al (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 – 7159 30 P.A Harris, IM Leigh and HA Navsaria (1998), “The future for cultured Skin Replacements Buns”, 24 (7), 453 – 457 31 Pedersoli WM et al (1994), “Disposition and bioavailability of neomycin in Holstein calves”, J Vet Pharmacol Ther 17(1),5-11 32.Selman A., Waksman (1949), "Neomycin-production and antibiotic properties" Journal of Clinical Investigation 28 (5): 934 33 Selman A., Waksman (1949), "Neomycin-production and antibiotic properties" Journal of Clinical Investigation 28 (5): 934 34 Wei B et al (2011), “ Preparation and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry films with antibacterial properties”, Carbohydr Polym , 84, 533–538 ... cellulose tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy mơi trường nước dừa già Mục đích nghiên cứu Tạo VLC từ môi trường nước dừa già để hấp thụ thuốc NS, nhằm tăng khả hấp thụ thuốc vào VLC tối đa, từ. ..TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY... điểm thuốc dạng thông thường điều trị bệnh viêm da Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Khả hấp thụ thuốc NS VLC tạo từ G xylinus lên men từ môi trường nước dừa già - Phạm vi nghiên