BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -* - HỒNG THỊ BÍCH NGỌC XÁC ĐỊNH CÁC NHÓM ESCHERICHIA COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TẠI HÀ NỘI Chuyên ngành: Vi khuẩn học Mã số : 68 72 68 01 ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU SINH Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Thu Hà GS TS Phùng Đắc Cam HÀ NỘI – 2012 CÁC CHỮ VIẾT TẮT AA : Aggregative adherence ADN : Acid Deoxyribo nucleic A/E : Attaching/effacing AAF : Aggregative adherence Fimbriae BHI : Broth Heart Infusion CDC : Centers for Disease Control and Prevention CFA : Colonization factor antigen DEC : Diarrhea Escherichia coli EAEC : Enteroaggregative E.coli EHEC : Enterohemorrhagic E.coli EIEC : Enteroinvasive E.coli EPEC : Enteropathogenic E.coli ETEC : Enterotoxigenic E.coli DAEC : Diffusely adherent E.coli ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay KIA : Kliger iron agar LDC : Lysine decarboxylase LT : Heat-Labile-Toxin LTa : Heat-Labile-Toxin a LTb : Heat-Labile-Toxin b MLVA : Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis PCR : Polymerase chain reaction PFG : Pulse-field gel electrophoresis ST : Heat-Stable-Toxin VT :Verocytotoxin XLD : Xylose lysine desoxycholate MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tiêu chảy E.coli 1.1.1 Bệnh tiêu chảy 1.1.2 Escherichia coli 1.2 Các phương pháp chẩn đoán E.coli PHẦN II 14 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 15 2.2 Vật liệu 15 2.2.1 Vật liệu cho vận chuyển, nuôi cấy xác định vi khuẩn 15 2.2.2 Vật liệu cho PCR đa mồi chẩn đoán E.coli 16 2.3 Phương pháp kỹ thuật nghiên cứu .18 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu 19 2.4 Xử lý số liệu 24 2.5 Y đức .24 PHẦN III 25 DỰ KIẾN KẾT QUẢ 25 3.1 Xác định tỷ lệ loại E.coli trẻ tiêu chảy không tiêu chảy 25 3.2 Đánh giá mối liên quan gien độc lực E.coli nhóm trẻ tiêu chảy khơng tiêu chảy 26 3.3 Đánh giá mối liên quan loại E.coli gây tiêu chảy triệu chứng lâm sàng27 PHẦN IV 29 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 29 PHẦN V 30 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Tiêu chảy bệnh phổ biến toàn cầu đặc biệt nước phát triển có Việt Nam Theo tổ chức y tế giới bệnh tiêu chảy chiếm khoảng 30% trường hợp tử vong trẻ tuổi Tại Việt Nam theo số nghiên cứu trẻ tiêu chảy trung bình 3,2 lần/năm Bệnh tiêu chảy gánh nặng y tế, kinh tế cho xã hội, cho gia đình bệnh nhân [1] Escherichia coli (E.coli) nguyên phổ biến viêm dày ruột, chiếm tới 20-30% nguyên xác định gây tiêu chảy [5] E.coli có loại: E.coli gây bệnh tiêu chảy (Diarrhea Escherichia coli: DEC) E.coli không gây tiêu chảy Việc xác định loại E.coli gây tiêu chảy dựa vào ngưng kết với kháng huyết thanh, thử nghiệm động vật thí nghiệm, ni cấy tế bào, kỹ thuật thường thời gian, phức tạp độ nhạy độ đặc hiệu không cao Phương pháp sinh học phân tử khuếch đại gien PCR (polymerase chain reaction), điện di trường xung điện (pulse-field gel electrophoresis - PFGE) hay phương pháp phân tích trình tự lặp locus đa hình (MLVAmultiple-locus variable-number tandem repeat analysis) trở thành kỹ thuật phổ biến đáng tin cậy để xác định nguồn gốc dịch, mối liên quan dịch tễ học phân tử Hiện tại, kỹ thuật áp dụng nước phát triển Tuy nhiên, Việt Nam nhóm kỹ thuật chưa phát triển rộng rãi, đồng thời chưa có nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá mức độ khác gen chủng E.coli gây bệnh không gây bệnh Do tiến hành nghiên cứu đề tài với mục đích nghiên cứu chủng DEC trẻ em Việt Nam phương pháp sinh học phân tử để: - Xác định tỷ lệ loại E.coli nhóm trẻ tiêu chảy khơng tiêu chảy tuổi Hà Nội - Đánh giá mối liên quan gien độc lực E.coli nhóm trẻ tiêu chảy không tiêu chảy tuổi kỹ thuật PFGE MLVA - Đánh giá mối liên quan loại E.coli gây tiêu chảy triệu chứng lâm sàng PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tiêu chảy E.coli 1.1.1 Bệnh tiêu chảy Tiêu chảy vấn đề y tế toàn cầu, nguyên hàng đầu gây bệnh tật tử vong cho trẻ em nước phát triển, ước tính trẻ tuổi tiêu chảy 3,2 lần/năm năm đầu đời có 4,9/1000 trẻ tử vong tiêu chảy [42] Tiêu chảy tình trạng trẻ từ lần trở lên 24 giờ, phân lỏng, thay đổi tính chất bình thường phân, kèm theo triệu chứng sốt, nôn, đau bụng [11] Tiêu chảy cấp tiêu chảy 14 ngày, tiêu chảy 14 ngày tiêu chảy kéo dài, tiêu chảy 30 ngày tiêu chảy mãn [1], [27] Căn nguyên gây tiêu chảy chủ yếu virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, khoảng 60% trường hợp tiêu chảy cấp xác định nguyên gây tiêu chảy [7], [33] Các tác nhân gây tiêu chảy thường lây truyền qua thức ăn nước uống nhiễm tác nhân gây bệnh, qua đường phân - miệng, bàn tay bẩn tiếp xúc trực tiếp với phân có chứa tác nhân gây bệnh Do hạn chế tình trạng lây nhiễm rửa tay trước ăn, sau vệ sinh, ăn chin, uống sôi giảm đáng kể tình trạng lây nhiễm Những yếu tố làm tăng nguy tiêu chảy trẻ trẻ nuôi hoàn toàn sữa bột, trẻ suy dinh dưỡng… Việc thực chương trình kiểm sốt khống chế tiêu chảy tổ chức y tế giới (WHO) bao gồm tăng cường cho trẻ bú sữa mẹ, điều trị tiêu chảy cho trẻ bù nước điện giải, giai đoạn sớm cho trẻ uống ORESOL, truyền thông giáo dục sức khỏe làm giảm tỷ lệ mắc tiêu chảy Điều trị tiêu chảy tùy thuộc nguyên gây bệnh Tiêu chảy E.coli bồi phụ nước điện giải (uống ORESOL, truyền dịch) dùng kháng sinh diệt vi khuẩn [6] Tiêu chảy E.coli chiếm khoảng 20%-30% trường hợp tiêu chảy [5], [47], [3] Dựa vào tính chất gây bệnh chia E.coli gây tiêu chảy thành nhóm chính: Enteropathogenic E.coli (EPEC): E.coli gây bệnh đường ruột Enterotoxigenic E.coli (ETEC): E.coli sinh độc tố ruột Enterohemorrhagic E.coli (EHEC): E.coli gây xuất huyết ruột Enteroinvasive E.coli (EIEC): E.coli xâm nhập ruột Enteroaggregative E.coli (EAEC): E.coli bám dính kết tập ruột Diffusely adherent E.coli (DAEC): E.coli gây bám dính phân tán Hình 1: Các loại E.coli gây tiêu chảy Nguồn tài liệu http://cmr.asm.org/content/11/1/142.full Tại Tanzania DEC nguyên phổ biến gây tiêu chảy chiếm 22,9% trẻ tuổi [48] Tương tự, tỉ lệ Iraq 25,9% [8] Đặc biệt Ấn Độ chiếm tới 43%, ETEC chiếm 37,21% [36] Nghiên cứu Thụy Sĩ cho thấy, bệnh tiêu chảy DEC, EHEC chiếm tới 60% trẻ 16 tuổi [59] Tại Brazil tiêu chảy cấp EPEC điển hình chiếm 6%, EPEC khơng điển hình 6%, EAEC 4,7%, EIEC 2% [10] Tại Tây Ban Nha nghiên cứu tiến hành người du lịch bị tiêu chảy ETEC chiếm tới 15.7%, EAEC chiếm 13.4% DAEC chiếm 9.14% [62].Theo Đỗ Thu Hương cộng sự, Việt Nam, trẻ tuổi tiêu chảy DEC chiếm 24,9% [3] Tương tự, Nguyễn Vũ Trung cộng tỉ lệ DEC chiếm 29,04%, EAEC chiếm 18,71%, EPEC 5,8%, EHEC chiếm 1,94%, EIEC 1,94%, ETEC 0,62% [5] 1.1.2 Escherichia coli Escherichia Escherich phát vào năm 1885 Giống Escherichia gồm nhiều lồi , E coli loại điển hình có vai trò quan trọng [2] E.coli trực khuẩn Gram âm, di động, số có vỏ, lên men đường Glucose, Lactose sinh (trừ số chủng EIEC), lên men đường Sorbitol (trừ đa số EHEC), sinh Indol, khơng sinh H2S, khơng có enzyme Urease, không sử dụng citrat môi trường simmons, khử Cacboxyl môi trường Lysine decacboxylase … [30] Nuôi cấy dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp 370C [1], [2] Sau 24 nuôi cấy khuẩn lạc dạng S (Smooth), gặp dạng M (Mucous) R (Rough) Tại đường tiêu hóa E.coli có loại E.coli gây tiêu chảy (DEC) E.coli thuộc hệ vi khuẩn bình thường đường tiêu hóa E.coli gây bệnh nhiều nơi thể nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết… 1.2 Các phương pháp chẩn đốn E.coli Thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học Dựa vào tính chất để xác định E.coli, phương pháp không phân biệt E.coli gây bệnh E.coli hệ vi sinh vật bình thường Chẩn đốn DEC định typ huyết Vào năm 1944 Kauffman đề xuất phân loại E.coli dựa loại kháng nguyên Kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar), kháng nguyên vỏ K (Capsular) Có 170 kháng nguyên O, loại xác định nhóm kháng nguyên, có 60 kháng nguyên H 80 kháng nguyên K [57], [63], [26] Sự kết hợp kháng nguyên O H tạo typ huyết đặc hiệu [30] Các typ huyết có mối liên hệ với DEC nhiên loại DEC có nhiều nhóm huyết thanh, nhóm huyết có nhiều loại DEC [40] EPEC nhóm chẩn đoán huyết học, theo tổ chức y tế giới (1987) thống có 12 nhóm huyết EPEC gây bệnh người: O26, O55, O86, O111, O114, O119, O124, O125, O126, O127, O128, O142 [26], [40], [19] ETEC gồm nhóm chủ yếu: O6, O8, O15, O25, O27, O63, O78, O115, O148, O153, O159, o167 EIEC gồm nhóm phổ biến O28ac, O112ac, O124, O136, O143, O144, O152, O164 [26] Nhóm EHEC gây bệnh chủ yếu O157H7 [32] Chẩn đoán DEC dựa vào kháng huyết thực đơn giản, nhiên giá thành đắt phòng thí nghiệm có đủ týp huyết để chẩn đốn độ nhạy, độ đặc hiệu khơng cao Chẩn đốn DEC dựa vào phản ứng miễn dịch Phản ứng ELISA, latex, miễn dịch huỳnh quang để phát kháng nguyên O, kháng nguyên H EHEC O 157H7 Phát độc tố ruột ST ETEC qua miễn dịch phóng xạ [24], ELISA [56] Chẩn đốn DEC dựa đặc điểm độc lực ETEC phát dựa yếu tố độc tố ruột LT (heat-labile), ST (heat-stable) [41] thử nghiệm thỏ [21] Phát độc tố LT nuôi cấy vào chuột Hamster [15] LT gồm LT1, LT2 loại phản ứng chéo LT1 gây bệnh người động vật, LT2 gây bệnh hầu hết động vật Phát EAEC nuôi cấy tế bào HEp-2 coi tiêu chuẩn vàng chẩn đoán EAEC [1], [58], kỹ thuật mô tả lần vào năm 1979 Cravioto cộng EAEC có khả bám vào tế bào HEp-2 yếu tố bám dính AA(Aggregative Adherence) [49], [50] EIEC: Phát thử nghiệm Sereny gây viêm kết giác mạc chuột lang, xâm nhập vào tế bào biểu mô lan tràn từ tế bào sang tế bào khác [50] Phương pháp chẩn đoán DEC dựa vào độc lực đòi hỏi nhân viên phòng thí nghiệm có kinh nghiệm không đặc hiệu 100% Phát sinh học phân tử Phương pháp phân biệt DEC E.coli thuộc hệ vi khuẩn bình thường DEC vi khuẩn phát phương pháp DNA đầu dò phát độc tố chịu nhiệt (ST) không chịu nhiệt (LT) ETEC [28] PCR phát EPEC EPEC bám dính vào bề mặt tế bào ruột hủy hoại tổ chức chỗ EPEC có yếu tố A (attaching) yếu tố E (effacing) tác dụng làm cho vi khuẩn bám dính phá hủy nhung mao ruột, yếu tố phát nuôi cấy vào tế bào thực nghiệm vi khuẩn phát triển thể người gây tổn thương tương tự [45], [22] 27 Bảng 3.7 Phân bố gen aggR, astA, aap chủng EAEC Trẻ tiêu chảy n % Trẻ không tiêu chảy n % gen aggR gen aap gen astA gen aggR + aap gen aggR + astA gen Aap + astA gen aggR + aap +astA Không có gen Bảng 3.8 Phân bố gen afaBC chủng DAEC Trẻ tiêu chảy n % Trẻ không tiêu chảy n % gen afaBC Bảng 3.9 So sánh gen độc lực DEC trẻ tiêu chảy không tiêu chảy dựa PFGE Bảng 3.10 So sánh gen độc lực DEC trẻ tiêu chảy không tiêu chảy dựa MLVA 3.3 Đánh giá mối liên quan loại E.coli gây tiêu chảy triệu chứng lâm sàng Bảng 3.11 Mối liên quan DEC với triệu chứng lâm sàng (sốt, nơn, tình trạng nước) EPEC ETEC EHEC EIEC EAEC DAEC 28 Sốt Nôn Mất nước Bảng 3.12 Mối liên quan DEC với tính chất phân EPEC Lỏng Nhày Máu Khác ETEC EHEC EIEC EAEC DAEC 29 PHẦN IV DỰ KIẾN BÀN LUẬN Bàn luận theo mục tiêu kết nghiên cứu, so sánh với nghiên cứu nước (Theo phương pháp nghiên cứu, địa điểm, theo lứa tuổi, tháng năm, ….) 30 PHẦN V DỰ KIẾN KẾT LUẬN Kết luận theo mục tiêu kết nghiên cứu - Các loại DEC thường gặp - Mối liên quan DEC với triệu chứng lâm sàng - Sự khác gen DEC trẻ tiêu chảy trẻ không tiêu chảy KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU VÀ TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI STT Các nội dung công việc chủ yếu Chuẩn bị đề cương Thơng qua đề cương Chuẩn bị hóa chất sinh phẩm, Thời gian Đến 10/2011 10/2011 10/2011-12/2011 Thu thập mẫu phân, xác định E.coli mẫu phân Xác định loại E.coli PCR đa mồi 1/2012-1/2013 Xác định khác gen DEC trẻ tiêu chảy không tiêu chảy PFGE MLVA Phân tích số liệu, viết luận án Bảo vệ luận án cấp sơ sở 2013-2014 8/2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phùng Đắc Cam (2003), "Bệnh tiêu chảy", Nhà xuất y học, tr Đinh Hữu Dung (2003), "Họ vi khuẩn đường ruột", Vi sinh y học, tr 188-191 Hương Đỗ Thị Thu Hương, Nguyễn Vũ Trung, Lê Văn Phủng (2007), "Ứng dụng kỹ thuật PCR định danh E.coli gây tiêu chảy trẻ em tuổi", Y Học TP Hồ Chí Minh, 11(1) Lê Văn Phủng (1998), "Cấy phân tìm Escherichia coli, salmonella Shigella", Thực tập Vi sinh vật y học, tr 34 - 41 Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng (1994), "Phát triển ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ phân", http://www.ctu.edu.vn/workshop/hnkh-y11/hue/levanphung.htm Tường Chu Văn Tường (1994), "Ỉa chảy cấp, ỉa chảy kéo dài", Cẩm nang điều trị nhi khoa, tr 149-156 Tiếng Anh Albert MJ, et al (1999), "Case-control study of enteropathogens associated with childhood diarrhea in Dhaka, Bangladesh", J Clin Microbiol, 37 (11), pp 3458-3463 Alrifai SB., et al (2009), "Prevalence and etiology of nosocomial diarrhoea in children < years in Tikrit teaching hospital", East Mediterr Health J, 15 (5), pp 1111-1118 Anna C Noller., et al (2003), "Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Analysis Distinguishes Outbreak and Sporadic Escherichia coli O157:H7 Isolates" J Clin Microbiol, 41 (12), pp 5389–5397 10 Aranda KR., Fagundes-Neto U., and S IC (2004), "Evaluation of multiplex PCRs for diagnosis of infection with diarrheagenic Escherichia coli and Shigella spp", J Clin Microbiol, pp 5849-5853 11 Baqui AH., et al (1992), "Enteropathogens associated with acute and persistent diarrhea in Bangladeshi children less than years of age", J infect Dis, 166 (4), pp 792-796 12 Benson G (1999), "Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences", Oxford University Press, 27 (2), pp 573-580 13 Christine Jallat., et al (1993), "Escherichia coli strains involved in Diarrhea in France: high Prevalence and Heterogeneity of diffusely Adhering Strains" Journal of clinical microbiology , pp 2031-2037 14 Cravioto A., et al (1991), "Association of Escherichia coli HEp-2 adherence patterns with type and duration of diarrhoea", Lancet, 337 (8736), pp 262-264 15 Cryan B (1990), "Comparison of three assay systems for detection of enterotoxigenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin" J Clin Microbiol, 28, pp 792-794 16 Cynthial sears and Kaper J.B (1996), "Enteric Bacterial Toxins: Mechanisms of Action and Linkage to Intestinal Secretion" Microbiological reviews, 60 (1), pp 167-215 17 David B., Huang., et al (2006), "A review of an emerging enteric pathogen: enteroaggregative Escherichia coli", Journal of Medical Microbiology, 55, pp 1301-1331 18 Du Toit, T.C.V R., and P.D.v (1993) "Helden, Empirical evaluation of conditions influencing the polymerase chain reaction: enterotoxigenic Escherichia coli as a test case", Eur J Clin Chem, 31, pp 225-231 19 Erwin Neter, et al (1995), "Demonstration of antibodies against enteropathogenic Escherichia coli in sera of children of various ages Pediatrics", 16, pp 801-808 20 Esin Basi and Baci H (2001), "Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology", Turk J Bio, 25, pp 405-418 21 Evans., et al (1973), "Differences in the response of rabbit small intestine to heat-labile and heat-stable enterotoxins of Escherichia coli", Infect Immun, pp 7873-7880 22 Finlay BB., et al (1992), "Cytoskeletal composition of attaching and effacing lesions associated with enteropathogenic Escherichia coli adherence to HeLa cells", Infect Immun, 60(6), pp 2541-2543 23 Gautom R.K (1997), "Rapid Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocol for Typing of Escherichia coli O157:H7 and Other Gram-Negative Organisms in Day", Journal of Clinical Microbiology, pp 2977-2980 24 Giannella R.A., Drake K W., and Luttrell M.(1981), "Development of a radioimmunoassay for Escherichia coli heat-stable enterotoxin", Infect Immun, 33, pp 186-192 25 Girón JA., et al (1993), "Distribution of the bundle-forming pilus structural gene (bfpA) among enteropathogenic Escherichia coli", J Infect Dis, 168 (4), pp 1037-1041 26 Gross R J., and Rowe B (1985), "Escherichia coli diarrhoea", J Hyg, 95, pp 531-550 27 Guerrant RL., et al (2001), "Practice guidelines for the management of infectious diarrhea", Clin Infect Dis, 32 (3), pp 331-351 28 Hanna bialkowska., and Hobrzansk (1987), "Detection of Enterotoxigenic Escherichia coli by Dot Blot Hybridization with Biotinylated DNA Probes", Journal of clinical microibiology, 25 (2), pp 338-343 29 Huang D.B., et al (2006), "Enteraggregative Escherichia coli is a cause of acute diarrheal illnes: a meta-analysis", Clin infect Dis, 43, pp 556-563 30 James P Nataro and Kape J.B (1998), "Diarrheagenic Escherichia coli", Clinical Microbiology Reviews, 11 (1), pp 142-201 31 Jerse A.E Yu., and Kaper J.B (1990) "A genetic locus of enteropathogenic Escherichia coli necessary for the production of attaching and effacing lesions on tissue culture cells", Proc Natl Acad Sci USA, 87, pp 7839-7843 32 Jure MA., et al (1998), "Association between hemolytic uremic syndrome and verotoxin-producing strains of E coli", Rev Latinoam Microbiol, 40 (1-2), pp 1-8 33 Kang G., et al (2001), "Epidemiological and laboratory investigations of outbreaks of diarrhoea in rural South India: implications for control of disease", Epidemiol Infect, 127 (1), pp 107-112 34 Käppeli U., et al (2011), "Human infections with non-O157 Shiga toxinproducing Escherichia coli", Emerg Infect Dis, 17 (2), pp 180-185 35 Lang A.L., et al.(1994), "Multiplex PCR for detection of the heat-labile toxin gene and Shiga-like toxin I and II genes in Escherichia coli isolated from natural waters", Environ Microbiol, 60, pp 3145-3149 36 Lanjewar M., De AS., and M M (2010), "Diarrheagenic E coli in hospitalized patients: special reference to Shiga-like toxin producing Escherichia coli, Indian J Pathol Microbiol, 53 (1), pp 75-78 37 Le Bouguenec C., Archambaud M., and L.A (1992), "Rapid and specific detection of the pap, afa, and sfa adhesin-encoding operons in uropathogenic Escherichia coli strains by polymerase chain reaction", Journal of Clinnical Microbiology, 30 (5), pp 1189-1193 38 Le Bouguenec C., et al (2001), "Characterization of AfaE adhesions produced by extraintestinal and intestinal human Escherichia coli isolates: PCR assay for detection of afaI adhesions that or not recognize Dr blood group antigens", J Clin Microbiol, 39, pp 1738–1745 39 Lei Lu and Walke W.A (2001), "Pathologic and physiologic interactions of bacteria with the gastrointestinal epithelium1,2,3", American Journal of Clinical Nutrition, 73 (6), pp 1124-1130 40 Leila C Campos., Marcia R Franzolin., and Trabulsi L.R (2004), "Diarrheagenic Escherichia coli Categories among the Traditional Enteropathogenic E coli O Serogroups - A Revie", Mem Inst Oswaldo Cruz, 99 (6), pp 545-552 41 Levine M.M (1987), "Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent", J Infect Dis, 155, pp 377-389 42 Margaret Kosek., Caryn Bern., and Guerrant R.L (2003), "The global burden of diarrhoeal disease, as estimated from studies published between 1992 and 2000", Bulletin of the World Health Organization 81 (3), pp 197-204 43 Mellmann A., et al (2008), "Recycling of Shiga toxin genes in sorbitol-fermenting enterohemorrhagic Escherichia coli O157:NM", Appl Environ Microbiol, 74 (1), pp 67-72 44 Mohammad Isfaqul characterization of Hussain., et al enteroaggregative, (2010), "Isolation enterotoxigenic, and diffusely adherent Escherichia coli and Salmonella Worthington from human diarrhoeic faecal samples in Kashmir and Secunderabad, India", World J Microbiol Biotechnol, 26, pp 1883-1889 45 Moon H W., et al (1983), "Attaching and effacing activities of rabbit and human enteropathogenic Escherichia coli in pig and rabbit intestines", Infect Immun, 41 (3), pp 1340-1351 46 Morgan G.M., et al (1988), "First recognized community outbreak of haemorrhagic colitis due to verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 in the UK", Epidemiol Infect, 101, pp 83-91 47 Moyenuddin M., Rahman KM., and S DA (1987), "The aetiology of diarrhoea in children at an urban hospital in Bangladesh", Trans R Soc Trop Med Hyg, 81(2), pp 299-302 48 Moyo SJ., et al (2011), "Age specific aetiological agents of diarrhoea in hospitalized children aged less than five years in Dar es Salaam, Tanzania", BMC Pediatr, 23, pp 11-19 49 Nataro J.P., and Kaper J.P (1998), "Diarrheagenic Escherichia coli", Cli Microbiol Rev, 11 (1), pp 142-201 50 Nataro J.P., Steiner T., and Guerrant R.L (1998), "Enteroaggregative Escherichia coli", Emerg Infect Dis, 4, pp 251-261 51 Nataro JP., et al (1994), "AggR, a transcriptional activator of aggregative adherence fimbria I expression in enteroaggregative Escherichia coli", J Bacteriol, 176 (15), pp 4691-4699 52 Nazmul M (2007), "Molecular characterization of verotoxin gene in enteropathogenic Escherichia coli isolated from Miri Hospital, Sarawak, Malaysia", Biomedical Research, 19 (1), pp 9-12 53 Nguyen Vu Trung., et al (2005), "Detection and characterization of Diarrheagenic Escherichia coli from young children in hanoi, vietnam", Journal of clinical microibiology, pp 755-760 54 Peter K Fagan., et al (1999), "Detection of Shiga-Like Toxin (stx1 and stx2), Intimin (eaeA), and Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Hemolysin (EHEC hlyA) Genes in Animal Feces by Multiplex PCR", Appl Environ Microbiol, 65 (2), pp 868-872 55 Rivera FP., et al (2010), "Genotypic and phenotypic characterization of enterotoxigenic Escherichia coli strains isolated from Peruvian children", J Clin Microbiol, 48 (9), pp 3198-3203 56 Robert G Urban., et al (1990), "High-level production of Escherichia coli STb heat-stable enterotoxin and quantification by a direct enzymelinked immunosorbent assay", Journal of clinical microbiology, 28 (11), pp 2383-2388 57 Robins-Browne RM., and H EL (2002), "Escherichia coli as a cause of diarrhea", J Gastroenterol Hepatol, 17 (4), pp 467-475 58 Scaletsky IC., et al (2009), "Evidence of pathogenic subgroups among atypical enteropathogenic Escherichia coli strains", J Clin Microbiol, 47 (11), pp 3756-3759 59 Schifferli A., et al (2010), "Hemolytic-uremic syndrome in Switzerland: a nationwide surveillance 1997-2003", Eur J Pediatr, 169 (5), p 591 60 Sethabutr O., et al.(1994), "Detection of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli by PCR in the stools of patients with dysentery in Thailand", J Diarrhoeal Dis Res, 12 (4), pp 265-269 61 Stacy-Phipps, S., Mecca J J., and Weiss J.B (1995), "Multiplex PCR assay and simple preparation method for stool specimens detect enterotoxigenic Escherichia coli DNA during the course of infection", J Clin Microbiol, 33, pp 1054-1059 62 Vagas M., et al (1998), "Prevalence of diarrheagenic Escherichia Coli strains detected by PCR in patients with travelers, diarrhea", Clin Microbiol Infect, 4, pp 682-688 63 Whitfield C., and R IS (1999), "Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli", Mol Microbiol, 31 (5), pp 1307-1319 64 WHO, Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) 65 Yamamoto T., and E P (1996), "Detection of the enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin gene sequences in enterotoxigenic E coli strains pathogenic for humans", ifect Immun, 64 (4), pp 1441-1445 66 Yoshitoshi Ogura., et al (2007), "TccP2 of O157:H7 and Non-O157 Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC): Challenging the Dogma of EHEC-Induced Actin Polymerization", Infection and Immunity, 75 (2), pp 604-612 PHỤ LỤC Bộ câu hỏi để thu thập thơng tin từ trẻ 1.Hành chính: Họ tên bệnh nhân………………………………………………………… Mã số bệnh nhân……………………mã bệnh án……………………… Giới tính □Nam □Nữ Ngày sinh: ……………………………………………… □Khơng rõ Địa chỉ: ………………………………………………………………… Ngày vào viện: ………………………………………………………… 6.Trình độ học vấn mẹ trẻ □Tiểu học □THCS □THPT □ĐH ĐH □Khác II Tiền sử thông tin điều trị Ngày bắt đầu tiêu chảy ……………………… Số lần tiêu chảy nhiều 24h………………………………… Tính chất phân □Tồn nước □Nhày □Máu □Khác 10 Ngày ngừng tiêu chảy ………………………………………………… 11 Nhiệt độ ……………oC (Cao q trình bệnh) 12 □Có nôn □Không nôn 13 Mức độ nước (theo TC YTTG) □Không □Nhẹ □Nặng 14 Ngày viện: ………………………………………………………… 15 Tình trạng bệnh nhân viện: □ Sống (ngày mất:………………………………) □ Không rõ □ Chết III.Xét nghiệm phân 16 Mã số mẫu phân …………………………… 17 Ngày lấy mẫu…………………………………………………… 18 Tính chất phân □Tồn nước □Nhày □Máu □Khác Xác nhận người điều tra (ký ghi rõ họ tên) ... phương pháp sinh học phân tử để: - Xác định tỷ lệ loại E .coli nhóm trẻ tiêu chảy khơng tiêu chảy tuổi Hà Nội - Đánh giá mối liên quan gien độc lực E .coli nhóm trẻ tiêu chảy khơng tiêu chảy tuổi kỹ... nhân tiêu chảy + Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn + Phương pháp xác định vi khuẩn tính chất sinh vật hóa học - Phương pháp PCR xác định loại E .coli gây tiêu chảy + Phương khám, E .coli nhập... để bảo vệ trẻ khỏi mắc tiêu chảy cấp E .coli 25 PHẦN III DỰ KIẾN KẾT QUẢ 3.1 Xác định tỷ lệ loại E .coli trẻ tiêu chảy không tiêu chảy Bảng 3.1 Sự phân bố loại E .coli Các loại E .coli Nhóm bệnh