Đang tải... (xem toàn văn)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép với detector PDA được xây dựng cho định lượng đồng thời puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) trong rễ củ sắn dây. Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp định lượng đồng thời các isoflavonoid trong rễ củ sắn dây có thời gian phân tích nhanh, chính xác và đơn giản.
Tạp chí Dược liệu, tập 24, số 4/2019 (Trang 216 - 220) XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PUERARIN, DAIDZIN VÀ DAIDZEIN TRONG RỄ CỦ SẮN DÂY TRÊN HỆ THỐNG MÁY HPLC-PDA Phạm Quốc Tuấn1, Hà Thanh Hòa1, Hà Quang Lợi1, Nguyễn Quốc Tuấn1, Phương Thiện Thương2, Nguyễn Mai Nam1, Trần Quốc Hưng1, Lương Phong Văn1, Đinh Thị Quỳnh Anh1, Nguyễn Đức Hùng1,* Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ Dược, Cao đẳng Y Dược Phú Thọ; Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam - Hàn Quốc *Email: duchungnguyen1310@gmail.com (Nhận ngày 11 tháng năm 2019) Tóm tắt Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép với detector PDA xây dựng cho định lượng đồng thời puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) rễ củ sắn dây Điều kiện chiết xuất tối ưu dung môi ethanol 35%, siêu âm Các đường chuẩn khoảng nồng độ định lượng, chúng có hệ số tuyến tính cao (R2 > 0,999) Độ xác phương pháp phân tích ngày ngày có RSD không 3,7% 4,08% Kết nghiên cứu cho thấy, phương pháp định lượng đồng thời isoflavonoid rễ củ sắn dây có thời gian phân tích nhanh, xác đơn giản Từ khóa: Pueraria, Puerarin, Daidzein, Daidzin, HPLC-PDA Summary Development of an HPLC-PDA Method for Simultaneous Determination of Puerarin, Daidzin and Daidzein in Puerariae Radix A high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection method was developed for simultaneous quantification of puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) in Puerariae Radix As a result, the optimized extraction solvent was 35% ethanol with an ultrasonic extraction in one hour All calibration curves showed good linearity (R > 0.999) within the test ranges The intra-day and inter-day variations were less than 3.7% and 4.08%, respectively The current study has proposed a rapid, accurate and simple HPLC method which allows the simultaneous determination of three isoflavones in Puerariae Radix Keywords: Pueraria, Puerarin, Daidzein, Daidzin, HPLC-PDA Đặt vấn đề Trong y học cổ truyền vị thuốc cát (rễ củ sắn dây) sử dụng làm thuốc chữa sốt, cứng gáy, khát, sởi chưa mọc, lỵ tiêu chảy [1] Theo Dược điển Trung Quốc, sắn dây (Kudzu) có hai chuyên luận khác hai thứ loài Pueraria montana P thomsonii (P montana var thomsonii) P lobata (P montana var lobata) [2] Chuyên luận sắn dây Dược điển Việt Nam V rễ củ P thomsonii Benth [1] Thành phần hóa học rễ củ sắn dây chứa nhóm isoflavonoid, flavon, triterpenoid glycosid tinh dầu [3] Các thành phần isoflavonoid sắn dây puerarin, daidzin, daidzein chứng minh có tác dụng bảo vệ gan, điều trị bệnh tim mạch, tăng huyết áp, đái tháo đường, giảm độc ethanol [4] Các nghiên cứu cho thấy daidzein, genistein có tác dụng ức chế cạnh tranh với γ2-γ2ADH-isoenzym với ethanol ức chế không cạnh tranh với γ2-γ2-ADH isoenzym NAD+ [3] Các isoflavonoid sắn dây chứng minh có tác dụng giảm hấp thu rượu từ đường uống, giảm rõ rệt triệu chứng gây rượu động vật thí nghiệm Dược điển Trung Quốc quy định hàm lượng puerarin taxon P lobata từ 2,4% P thomsonii 0,3% trở lên [2] Dược điển Việt Nam V, định tính puerarin dựa phương pháp sắc ký lớp mỏng [1] Do đó, xây dựng phương pháp định lượng đồng thời puerarin, daidzin daidzein rễ củ sắn dây hệ thống máy HPLC-PDA có vai trò quan trọng góp phần kiểm sốt chất lượng dược liệu cát lưu hành thị trường Việt Nam Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu Đối tượng: Mẫu rễ củ phơi sấy khô sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.) (SD1) thu hái Vườn Thực vật - Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ, tháng 12 năm 2017 Mẫu tiêu (CDYDPT/TV/SD01/2017) xác định TS Phạm Quốc Tuấn, lưu Phòng lưu mẫu, Bộ mơn Dược liệu - Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ Hóa chất: Các dung môi sử dụng gồm: methanol (MeOH), acetonitril (MeCN), acid formic, ethanol (EtOH) 96%, nước cất Chất chuẩn đối chiếu gồm puerarin (1), daidzin (2) daidzein (3) có độ tinh khiết ≥ 98% theo HPLC mua từ hãng Sigma-Aldrich Thiết bị HPLC: Máy HPLC CBM-20A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Nhật) ghép với detector Diode Array SPD-M20A, cột SupelcosilTM (250 mm × 4,6 mm, μm) 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Tối ưu hóa điều kiện sắc ký: Dựa khảo sát độ hấp thụ UV chất phân tích, hệ dung môi pha động, nồng độ acid formic, tốc độ dòng cho chương trình sắc ký - Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất: Khảo sát hệ dung mơi chiết gồm hỗn hợp EtOH-H2O; MeOH-H2O, phương pháp chiết thời gian chiết - Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Các dung dịch chất chuẩn gốc 1, 2, nồng độ 1000 µg/mL pha EtOH 35%, từ dung dịch pha lỗng thành dung dịch có nồng độ phù hợp Dung dịch chất chuẩn đựng lọ thủy tinh, đóng kín, dán màng seal, bảo quản ºC tủ lạnh Đường chuẩn xây dựng dựa tương quan nồng độ diện tích pic chất phân tích 1, - Thẩm định phương pháp phân tích: Phương pháp phân tích thẩm định theo yêu cầu chung ICH (International Conference on Harmonisation) gồm yêu cầu sau: tính tương thích hệ thống, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ xác, độ [5] 2.3 Áp dụng phương pháp thẩm định vào mẫu thu hái địa bàn 2.4 Xử lý số liệu phân tích Các thí nghiệm thực ba lần, kết lấy giá trị trung bình ( ) Các số liệu thống kê tính phần mềm GraphPad Prism Kết Bàn luận 3.1 Tối ưu điều kiện sắc ký Dựa phổ hấp thụ UV, chất đối chiếu 1, 2, có cực đại hấp thụ bước sóng 254, 250 258 nm Do đó, bước sóng 254 nm lựa chọn cho định lượng mẫu phân tích 1, Các hệ dung môi pha động MeCN-H2O MeOH-H2O khảo sát khả tách hệ thống HPLC Kết cho thấy, hệ dung môi MeOH-H2O tách tốt hơn, giá thành rẻ nên lựa chọn Cuối cùng, pha động MeOH (A)H2O (B) chứa 0,05% acid formic theo chương trình gradient (0 - 20 phút: 27% A; 20 - 25 phút: 27% 50% A), kết sắc ký đồ cho thấy chất phân tích tách khỏi hồn tồn, thời gian ngắn, khơng có pic chồng lấp sử dụng cho phương pháp định lượng Các chất đối chiếu xác định mẫu dựa theo thời gian lưu, phổ hấp thụ UV xác nhận thêm chất chuẩn vào mẫu cho chất Điều kiện tối ưu gồm có: detector UV đo bước sóng 254 nm Hệ dung mơi pha động MeOH (A) H2O chứa 0,05% acid formic (B) chạy theo chương trình gradient (0 - 20 phút: 27% A; 20 - 25 phút: 27% - 50% A), thể tích tiêm mẫu 10 µL, tốc độ dòng mL/phút 3.2 Tối ưu điều kiện chiết xuất Mẫu sắn dây (hàm ẩm 8,7%) xay mịn rây qua rây 200 µm đảm bảo đồng Cân 0,3 g bột trên, thêm 50 mL dung mơi chiết xuất thí nghiệm sau: dung môi gồm 95%, 75%, 50%, 25% EtOH 100%, 75%, 50%, 25%, 0% MeOH, sau siêu âm 30 phút Kết cho thấy khoảng nồng độ 25% - 50% EtOH có hiệu suất chiết cao Tiếp tục chiết mẫu EtOH nồng độ 25, 30, 35, 40, 45, 50%, sắc ký đồ nồng độ 35% cho diện tích pic lớn nhất, nên chọn làm dung môi chiết xuất Khảo sát phương pháp chiết siêu âm so sánh với chiết nóng hồi lưu mẫu thời gian 30 phút, kết diện tích pic chất chuẩn khác không đáng kể Phương pháp siêu âm lựa chọn để chiết mẫu Tiếp tục khảo sát thời gian chiết 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút Tại thời điểm 60 phút siêu âm, diện tích pic chúng khơng tăng, thời gian phù hợp để chiết xuất 3.3 Thẩm định phương pháp 3.3.1 Tính tương thích hệ thống, chọn lọc, đặc hiệu Hỗn hợp mẫu chuẩn 1, 2, nồng độ 100 µg/mL phân tích lần liên tiếp với chạy sắc ký lần, kết cho thấy diện tích pic chất chuẩn thay đổi không đáng kể, nên hệ thống phù hợp để phân tích 1, Bảng Kết khảo sát tính tương thích hệ thống 1, Chất phâ n tích Thời gian lưu (phút) Diện tích pic tR RSD (%) S 5,85 ± 0,03 0,51 % 4838431 ± 34179 7,68 ± 0,01 0,13 % 2994198 ± 10286 13, 92 ± 0,04 0,28 % 2939041 ± 20177 RSD (%) 0,7% 0,34% 0,68% Các kết thời gian lưu diện tích pic chất chuẩn 1, 2, nồng độ 100 µg/mL cho giá trị tin cậy, với giá trị RSD thấp (< 2%) (Bảng 1) Do đó, phương pháp phân tích tương thích với hệ thống Phân tích mẫu chuẩn 1, 2, 3, mẫu dược liệu mẫu trắng điều kiện sắc ký chọn Trên sắc ký đồ pic chất chuẩn tương ứng với mẫu dược liệu, đồng thời không xuất pic mẫu trắng Trên sắc ký đồ, pic 1, 2, tách hoàn tồn, cân đối, sắc nét, độ rộng chân píc nhỏ Như vậy, phương pháp phân tích lựa chọn có tính đặc hiệu chọn lọc 3.3.2 Khoảng tuyến tính, LOD LOQ Khoảng tuyến tính phương pháp xây dựng nồng độ từ 250 µg/mL tới 1,95 µg/mL Các giá trị LOD LOQ 1, 2, xác định nồng độ tín hiệu chất phân tích tín hiệu (S/N) 10 (S/N) Kết phân tích Bảng Bảng Các tham số phương trình tuyến tính, LOD, LOQ chất 1, Nồng độ Độ dốc Hệ số chặn LOD LOQ (μg/mL) (μg/mL) Hệ số tương quan (R2) Chất chuẩn (μg/mL) (a) (b) 1,95-250 29.712 - 68.767 0,9994 0,430 1,435 1,95-250 30.612 - 53.681 0,9994 0,080 0,267 1,95-250 49.616 - 95.833 0,9997 0,060 0,200 Kết khảo sát cho thấy, khoảng nồng độ (250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,5125; 3,90; 1,95 µg/mL, mối tương quan diện tích pic nồng độ chất chuẩn 1, 2, tuyến tính với R2 từ 0,9994 - 0,9997 (Bảng 2) Hình Sắc ký đồ hỗn hợp chất chuẩn (A): puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) SD1 (B) 3.3.3 Độ đúng, độ xác Độ độ xác xác định phân tích mẫu độc lập nồng độ khác (Bảng 3) Bảng Kết độ độ xác Chất Chuẩn Nồng độ Trong ngày (n=6) Nồng độ Các ngày (n=6) phâ n tích thêm vào mẫu (μg/mL) Nồng độ thu SD (μg/mL) Độ (%) Độ xác mẫu (μg/mL) RSD% Nồng độ thu SD (μg/mL) Độ (%) Độ xác RSD% 88,8 90,8 0,07 100,1 3,7 88,3 28,4 0,05 100,1 1,72 50 88,8 138,1 1,8 98,6 3,5 88,3 77,1 0,14 98,2 0,71 100 88,8 187,8 1,79 99,0 1,7 88,3 227,1 0,37 100,1 0,49 16,7 18,7 0,04 99,2 2,0 16,80 18,7 0,1 98,6 4,08 50 16,7 66,6 1,3 99,7 2,6 16,80 66,4 1,2 99,4 0,32 100 16,7 115,9 2,1 98,5 2,1 16,80 117,3 2,0 100,6 0,49 24,5 26,5 0,1 101,1 2,6 24,5 26,5 0,31 101,5 2,3 50 24,5 74,4 0,9 99,8 1,7 24,5 73,0 0,10 97,0 3,1 100 24,5 125,6 2,6 98,8 2,2 24,5 125,9 0,30 101,4 1,0 Kết phân tích cho thấy độ 1, 2, mẫu phân tích ngày từ 98,6 - 101,1% ngày liên tiếp từ 97,0 - 101,5% Đối với độ xác 1,7 - 3,7% mẫu phân tích ngày ngày liên tiếp từ 0,32 - 4,08% Kết cho thấy phương pháp phân tích có độ xác cao 3.4 Áp dụng phân tích mẫu sắn dây thu hái địa bàn tỉnh Phú Thọ Năm mẫu rễ sắn dây trồng trọt (SD1-SD5) thu hái địa điểm khác tỉnh Phú Thọ khảo sát đồng thời hàm lượng 1, 2, dựa vào điều kiện nghiên cứu cho kết Bảng Bảng Khảo sát hàm lượng 1, 2, mẫu sắn dây SD2 SD3 SD4 (% kl/kl) (% kl/kl) (% kl/kl) (% kl/kl) (% kl/kl) 1,48 0,41 0,11 0,10 1,69 0,28 0,11 0,06 0,07 0,12 0,41 0,09 0,08 0,09 0,08 SD1 Chất SD5 SD2 - SD5 thu hái huyện Cẩm Khê Phú Thọ Từ Bảng cho thấy, mẫu SD1, SD2 SD5 có hàm lượng puerarin lớn 0,3%, đạt yêu cầu theo Dược điển Trung Quốc chuyên luận P thomsonii Tuy nhiên, mẫu SD3 SD4 có hàm lượng puerarin thấp 0,10 - 0,11% Trong y học cổ truyền Trung Quốc, dược liệu cát (Puerariae Radix) gồm Puerariae lobatae Radix Puerariae thomsonii Radix chia hai chuyên luận từ năm 2005 hàm lượng puerarin khác đáng kể [2] Các nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa số tác dụng dược lý hai taxon tương đối khác [6] Dựa hình thái học thực vật, hai taxon giống nhau, phân biệt dựa kích thước phận hoa, [7] Hàm lượng hoạt chất có tác dụng sinh học isoflavonoid chúng khác nhiều Để phân biệt dược liệu Puerariae lobatae Radix Puerariae thomsonii Radix, nghiên cứu đặc điểm khác hình thái học, đặc điểm hiển vi thành phần hóa học chúngtrên TLC, HPLC [7], [8],[9] Kết nghiên cứu Du G cs [10], phân biệt hai taxon dựa thành phần hóa học, cho thấy P thomsonii có hàm lượng puerarin từ 0,37% - 0,698%, P lobata từ 2,92% - 6,13% Trong nghiên cứu này, mẫu thu hái có hàm lượng puerarin từ 0,1 - 1,69% phù hợp với cơng trình nghiên cứu phân biệt hai dược liệu Kết luận Trong nghiên cứu này, khảo sát, lựa chọn các điều kiện chiết xuất isoflavonoid rễ củ sắn dây với hiệu suất cao, an tồn với dung mơi EtOH 35%, phương pháp siêu âm với thời gian 60 phút Đồng thời xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) đơn giản, thời gian ngắn xác Phương pháp thẩm định với giá trị độ từ 97,0 - 101,5% độ xác 0,32 - 4,08% Phương pháp góp phần tiêu chuẩn hóa mặt định lượng chất dược liệu cát Tài liệu tham khảo Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Tập 2, Nhà xuất Y học, 1310-1311 Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2010), Chinese Pharmacopoeia Com-mission, Vol People’s Medical Publishing House, Beijing, China, 313-321 Zhang Z., Lam T N., Zuo Z (2013), Radix Puerariae: An overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use, The Journal of Clinical Pharmacology, 53(8), 787-811 Wong K H., Li G Q., Li K M., Razmovski N V., Chan K (2011), Kudzu root: Traditional uses and potential medicinal benefits in diabetes and cardiovascular diseases, Journal of Ethnopharmacology, 134(3), 584-607 ICH (1995), Validationofanalyticalprocedures: Text and methodology ICH guidelines topic Q2 (R1), London, UK Wong K H., Razmovski N V., Li K M., Li G Q., Chan K (2015), Comparing morphological, chemical and anti-diabetic characteristics of Puerariae lobatae Radix and Puerariae thomsonii Radix, Journal of Ethnopharmacology, 164, 53-63 Zhengyi W., Reven P H, Deyuan H (2010), Flora of China, Vol 10, Science Press (Beijing) and Missouri Botanical Garden Press (St Louis), 244-248 Jiang R W., Lau K M., Lam H M., Yam W S., Leung L K., Choi K L., Waye M M., Mak T C., Woo K S., Fung K P (2005), A comparative study on aqueous root extracts of Pueraria thomsonii and Pueraria lobata by antioxidant assay and HPLC fingerprint analysis, Journal of Ethnopharmacology, 96(1), 133-138 Zhang C L., Ding X P., Hu Z F., Wang X T., Chen L L., Qi J., Yu B Y (2011), Comparative study of Puerariae lobatae and Puerariae thomsonii by HPLC-diode array detection-flow injectionchemiluminescence coupled with HPLC-electrospray ionization-MS", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 59(5), 541-545 10 Du G., Zhao H Y., Zhang Q W., Li G H., Yang F Q., Wang Y., Li Y C, Wang Y T (2010), A rapid method for simultaneous determination of 14 phenolic compounds in Radix Puerariae using microwave-assisted extraction and ultra high performance liquid chromatography coupled with diode array detection and time-of-flight mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1217(5), 705-714 ... kiện chiết xuất isoflavonoid rễ củ sắn dây với hiệu suất cao, an tồn với dung mơi EtOH 35%, phương pháp siêu âm với thời gian 60 phút Đồng thời xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời... cao 3.4 Áp dụng phân tích mẫu sắn dây thu hái địa bàn tỉnh Phú Thọ Năm mẫu rễ sắn dây trồng trọt (SD1-SD5) thu hái địa điểm khác tỉnh Phú Thọ khảo sát đồng thời hàm lượng 1, 2, dựa vào điều kiện... NAD+ [3] Các isoflavonoid sắn dây chứng minh có tác dụng giảm hấp thu rượu từ đường uống, giảm rõ rệt triệu chứng gây rượu động vật thí nghiệm Dược điển Trung Quốc quy định hàm lượng puerarin