XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÙNG SIÊU BIẾN I Ở NGƯỜI VIỆT NAM Trần Mỹ Linh, Vũ Thị Thư, Phan Minh Tuấn, Lê Quang Huấn, Lê Trần Bình Viện Công nghệ sinh học GIỚI THIỆU ADN của hệ gen ty thể ở người có 16 569 cặp bazơ với 2 vùng chính: vùng mã hoá và vùng điều khiển (Anderson, 1981). Vùng mã hoá mang thông tin di truyền cho các phân tử sinh học khác nhau tham gia vào quá trình tạo năng lượng của tế bào (13 gen mã hoá cho các phân tử protein, 22 gen mã hoá cho tRNAs và 2 gen mã hoá cho rRNA), vùng điều khiển chịu trách nhiệm điều khiển phân tử mtADN (Parsons et al, 1997; Hagelberg et al. 1987; Lee et al. 1999). Trong vùng điều khiển lại chứa 2 vùng biến đổi có sự khác nhau rất lớn trong quần thể (Greenberg et al. 1983), chúng được gọi là vùng siêu biến I (342 cặp bazơ) và vùng siêu biến II (268 cặp bazơ). ADN có tính bảo thủ cao trong các thế hệ do chúng được cấu tạo dạng mạch vòng nên ít chịu sự tác động của các tác nhân gây đột biến, hơn nữa không có hiện tượng tái tổ hợp như ADN nhân vì chúng chỉ có một bản sao từ mẹ (Case and Wallace 1981; Giles et al. 1980). Mặt khác, ADN ty thể lại có sự đa hình cao nhờ sự có mặt của 2 vùng siêu biến (Budowle et al. 1999, Kalmar at al. 2000). Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin của hệ gen ty thể không chỉ giúp ta xác định mối quan hệ huyết thống mà còn giúp ta xác định đặc trưng di truyền ngoài nhân của mỗi dân tộc, mỗi bộ tộc ở các vùng địa lý khác nhau. Đặc trưng di truyền này có sự liên quan như thế nào tới tần suất xuất hiện các bệnh hiểm nghèo (như các bệnh ung thư , các bệnh về gen .) của các dân tộc đã và đang được các nhà nghiên cứu quan tâm nhằm xác định mối liên quan trực tiếp của chúng, giúp cho việc phòng ngừa và điều trị có hiệu quả các căn bệnh nan y. Hiện nay, chúng ta chưa có nghiên cứu nào về hệ gen ty thể của các dân tộc sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam. Chính vì vậy, để góp phần xây dựng hướng nghiên cứu mới, trong bài này chúng tôi trình bày những kết quả đầu tiên trong việc xây dựng phương pháp nghiên cứu vùng siêu biến I trong ADN ty thể của người Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu ADN ty thể được tách chiết từ các mẫu tóc, máu của người khoẻ mạnh. Cặp mồi nhân đoạn gen vùng siêu biến I trong D-loop: LOOP460F: 5’- CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3’, LOOP460R: 5’-CAC GGAGGATGGTGGTCAAG-3’ đặt của hãng Pharmacia Biotech. Vector pCR  2.1, của hãng Invitrogen. Các enzim hạn chế EcoR I, enzim T4 ligaza của hãng New England Biolabs, các hoá chất khác sử dụng trong thí nghiệm đều là những hoá chất tinh khiết của các hãng Sigma và Merck. Phương pháp tách chiết ADN từ các mẫu máu ADN thu được từ các mẫu máu đã chống đông bằng EDTA theo quy trình dưới đây có độ tinh sạch cao và có thể sử dụng cho các thí nghiệm về sinh học phân tử như PCR, cắt enzym hạn chế . 1. Mẫu máu (1ml) máu trộn đều với đệm SSC (0,8 ml), ly tâm 12 000 vòng/phút thời gian 1 phút. Loại bỏ dịch ly tâm. 2. Thêm 1ml đệm SSC, vortex, sau đó ly tâm như trên và loại bỏ hoàn toàn dịch ly tâm. 3. Thêm 375 µl 0,2M NaOAc, vortex, sau đó thêm 25µl SDS 10% và 5 µl proteinase K (20mg/ml H 2 O), vortex, ủ 1 giờ ở 55 0 C. 4. Thêm 120 µl phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), vortex, ly tâm 2 phút, tốc độ 12 000 vòng/phút. Hút lớp nước phía trên vào ống mới, thêm 1ml cồn 100% lạnh, ủ ở –20 0 C, 15 phút. 5. Ly tâm 2 phút, tốc độ 12 000 vòng/phút, làm khô mẫu 5 phút. 6. Thêm 180 µl TE, vortex và ủ 55 0 C trong 10 phút. Sau đó thêm 20 µl 2M Sodium acetate, trộn đều, thêm 500 µl ethanol 100% lạnh, ly tâm 12000 vòng/phút thời gian10 phút. 7. Loại bỏ dịch ly tâm, rửa chất tủa với 1ml cồn 80%, ly tâm 1 phút với tốc độ 12 000 vòng/phút. 8. Hoà mẫu ADN thu được trong 200 µl TE, ủ qua đêm ở 55 0 C. Sau đó bảo quản ở –20 0 C. Phương pháp tách chiết ADN từ các mẫu tóc 1. Các sợi tóc được rửa sạch bằng cồn sau đó bằng nước cất. 2. Cắt ngắn các sợi tóc, ủ với đệm chiết qua đêm ở 56 0 C (Đệm chiết gồm 10 mM Tris, 100 mM NaCl, 39 mM DTT, 10 mM EDTA and 2% SDS, proteinase K, 10µg/ml). 3. Chiết 1 lần với phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), 2 lần với chloroform. 4. Dịch chiết chứa ADN được cô đặc trong ống Microcon-100 (Amicon). Nhân đoạn gen vùng siêu biến và xác định trình tự Nhân đoạn gen vùng siêu biến được tiến hành với cặp mồi LOOP460F/ LOOP460R và chu trình nhiệt như sau: 94 0 C-3 phút và 35 chu kỳ ( 94 0 C-30 giây, 56 0 C-1 phút, 68 0 C-1 phút 30 giây), ổn định 8 phút ở 72 0 C và kết thúc ở 4 0 C. Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector pCR  2.1, sau đó plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α. Các kỹ thuật tách chiết ADN plasmid và ADN tái tổ hợp được tiến hành theo Sambrook và cộng sự [10]. Trình tự đoạn gen vùng siêu biến I được Công ty “BIOSERVICE UNIT”, Bangkok, Thailand xác định theo phương pháp của Sanger. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu tóc và máu ADN tổng số từ các mẫu máu và mẫu tóc của người được tách theo phương pháp như đã trình bầy ở phần phương pháp có độ tinh sạch cao khi kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 1). Hình 1: Điện di đồ các mẫu ADN trên gel agarose 0,8% Kênh 1: Mẫu ADN tách từ tóc. Kênh 2: Mẫu ADN tách từ máu Để phân lập và tách dòng đoạn gen vùng siêu biến I chúng tôi đã thiết kết cặp mồi dựa trên trình tự gen ty thể đã được công bố trong Ngân hàng gen quốc tế. Thành phần phản ứng PCR ngoài các thành phần cơ bản như ADN khuôn, cặp mồi LOOP460F/ LOOP460R, Taq ADN-polymeraza, dNTP còn có muối MgCl2 và chu trình nhiệt như sau: 94 0 C-3 phút và 35 chu kỳ ( 94 0 C-30 giây, 56 0 C-1 phút, 68 0 C-1 phút 30 giây), ổn định 8 phút ở 72 0 C và kết thúc ở 4 0 C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1 %. Kết quả được trình bầy trên hình 2. Hình 2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% Kênh 1: Chỉ thị phân tử ADN Kênh2: Sản phẩm PCR từ mẫu tóc Kênh3: Sản phẩm PCR từ mẫu máu Tách dòng đoạn gen vùng siêu biến I Sản phẩm PCR không cần phải qua một bước tinh chế nào mà được sử dụng trực tiếp cho phản ứng gắn với vector tách dòng: trộn sản phẩm PCR (1µl) với vectơ pCR  2.1 (1µl), ủ qua đêm ở 14 0 C để sản phẩm PCR gắn vào vector. Sau đó được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α. Nhờ bộ máy tổng hợp của tế bào vi khuẩn, plasmit được tạo ra với một số lượng lớn các bản sao. Sau khi biến nạp, các tế bào vi khuẩn E. coli chứa vectơ tái tổ hợp được cấy trải trên môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin, IPTG, X-gal. Trong môi trường chọn lọc này, theo lý thuyết thì các khuẩn lạc E. coli mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi đó các khuẩn lạc mang vector pCR  2.1 gốc (không đính thêm đoạn ADN ngoại lai) sẽ có màu xanh. Các khuẩn lạc biến nạp đã chọn được nuôi qua đêm để tách ADN plasmit, kết quả tách chiết ADN plasmit được trình bầy trên hình 3. Hình 3: Kết quả tách ADN plasmit các khuẩn lạc biến nạp Kênh 1: Mẫu ADN plasmit đã được xử lý RNase Kênh 2-5: : Mẫu ADN plasmit chưa xử lý RNase Để khẳng định kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector chúng tôi đã cắt kiểm tra ADN plasmit với enzym cắt hạn chế EcoR I. Kết quả phản ứng cắt với enzym hạn chế được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (hình 4). Hình 4: Kết quả kiểm tra phản ứng cắt ADN plasmit với enzym hạn chế EcoR I trên gel agarose 0,8% Kênh 1: ADN plasmit chưa cắt với enzym hạn chế EcoR I Kênh 2, 3: ADN plasmit của các khuẩn lạc khác nhau cắt với enzym hạn chế EcoR I Kênh 4: Sản phẩm PCR trước khi gắn vào vector Kênh 5: Chỉ thị phân tử ADN Xác định trình tự đoạn gen vùng siêu biến I ADN plasmit sau khi được kiểm tra và khẳng định đã được gắn sản phẩm PCR được gửi cho “BIOSERVICE UNIT”, Bangkok, Thailand để xác định trình tự. Kết quả xác định trình tự nucleotid sản phẩm PCR từ mẫu máu người Việt nam (sản phẩm PCR từ mẫu tóc chưa gửi xác định trình tự) như sau: So sánh trình tự nucleotid của sản phẩm PCR mà chúng tôi thu được với trình tự vùng siêu biến trong mtADN đã được Anderson, 1981 công bố chúng tôi thu được kết quả như sau: REF: Trình tự nucleotid vùng siêu biến I đã được công bố trong Ngân hàng gen Quốc tế. VN1: Trình tự nucleotid vùng siêu biến I mà chúng tôi đã tách dòng từ mẫu máu người Việt Nam. Qua kết quả so sánh, ta thấy trình tự nucleotid của sản phẩm tách dòng và trình tự nucleotid vùng siêu biến I mà Anderson đã công bố năm 1981 có độ tương đồng cao (99.13%). Chỉ có 3 nucleotid khác biệt đó là các vị trí 16 111, 16 223 và 16 362 trong ADN ti thể. Theo kết quả nghiên cứu của Anderson và các tác giả khác vùng siêu biến I trong mtADN chiếm vị trí từ 16 024 đến vị trí 16 366. Sự sai khác này đều là các đột biến thay thế: ở vị trí 16 111 và 16 223 gốc cytosin được thay thế bằng gốc timin (C-->T), còn vị trí 16 362 thi gốc timin lại được thay thế bằng cytosin (T-->C). Mặc dù sự sai khác không nhiều (chỉ có 3 nucleotid) trong vùng siêu biến I nhưng nó cũng làm thay đổi vị trí nhận biết của các enzym cắt hạn chế cũng như việc xuất hiện thêm các vị trí nhận biết của các enzym cắt giới hạn mới. Cụ thể xuất hiện thêm một vị trí nhận biết của enzym Bsr I ở vị trí 16 108, enzym Hph I ở vị trí 16 104, enzym Mae III ở vị trí 16 110 và mất đi vị trí nhận biết của enzym cắt hạn chế Mnl I ở vị trí 16 235. KẾT LUẬN 1. Sử dụng cặp mồi LOOP460F/ LOOP460R chúng tôi đã tách dòng được đoạn gen vùng siêu biến I trong mtADN từ mẫu ADN tách từ máu người Việt nam. 2. Đoạn gen vùng siêu biến đã tách dòng có độ tương đồng cao (99.13%) so với trình tự vùng siêu biến trong mtADN mà Anderson và cộng sự đã công bố trong ngân hàng gen Quốc tế. 3. Sự sai khác về trình tự nucleotid xẩy ra tại các vị trí 16 111, 16 223 và 16 362 trong ADN ti thể. Sự sai khác này đều là các đột biến thay thế: ở vị trí 16 111 và 16 223 gốc cytozin được thay thế bằng gốc timin (C-->T), còn vị trí 16 362 thi gốc timin lại được thay thế bằng cytozin (T-->C). Sự sai khác này đã làm thay đổi vị trí nhận biết của các enzym cắt hạn chế cũng như xuất hiện thêm các vị trí nhận biết của các enzym cắt giới hạn mới: xuất hiện vị trí nhận biết của enzym Bsr I ở vị trí 16 108, enzym Hph I ở vị trí 16 104, enzym Mae III ở vị trí 16 110 và mất đi vị trí nhận biết của enzym cắt hạn chế Mnl I ở vị trí 16 235 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anderson, S., Bankier, A. T., Barrell, B. G., de Bruijn, M. H. L., Coulson, A. R., Drouin, J., Eperon, I. C., Nierlich, D. P., Roe, B. A., Sanger, F., Schreier, P. H., Smith, A. J. H., Staden, R., and Young, I. G. Sequence and organization of the human mitochondrial genome, Nature (1981) 290: 457–465. 2. Case, J. T. and Wallace, D. C. Maternal inheritance of mitochondrial DNA polymorphisms in cultured human fibroblasts, Somatic Cell Genetics (1981) 7:103–108. 3. Giles, R. E., Blanc, H., Cann, H. M., and Wallace, D. C. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA, Proceedings of the National Academy of Sciences (1980) 77:6715–6719. 4. Greenberg, B. D., Newbold, J. E., and Sugino, A. Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA, Gene (1983) 21:33–49. 5. Holland, M. M., Fisher, D. L., Mitchell, L. G., Rodriquez, W. C., Canik, J. J., Merril, C. R., and Weedn, V. W. Mitochondrial DNA sequence analysis of human skeletal remains: Identification of remains from the Vietnam War, Journal of Forensic Sciences (1993) 38:542–553. 6. Hutchison, C. A., Newbold, J. E., Potter, S. S., and Edgell, M. H. Maternal inheritance of mammalian mitochondrial DNA, Nature (1974) 251:536–538. 7. Murray, V. Improved double-stranded DNA sequencing using the linear polymerase chain reaction, Nucleic Acids Research (1989) 17:8889. 8. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proceedings of the National Academy of Sciences (1977) 74: 5463–5467. 9. Stoneking, M., Hedgecock, D., Higuchi, R. G., Vigilant, L., and Erlich, H. A. Population variation of human mtDNA control region sequences detected by enzymatic amplification and sequence-specific oligonucleotide probes, American Journal of Human Genetics (1991) 48:370– 382. 10. Wilson, M. R., Polanskey, D., Repogle, J., DiZinno, J. A., and Budowle, B. A family exhibiting heteroplasmy in the human mitochondrial DNA control region reveals both somatic mosaicism and pronounced segregation of mitotypes, Human Genetics (1997) 100:167–171. 11. Parsons TJ, Muniec DS, Sullivan K, Woodyatt N, Alliston-Greiner R, Wilson MR, Berry DL, Holland KL, Weedn VW, Gill P, and Holland MM (1997)A High Observed Substitution Rate in the Human Mitochondrial DNA Control Region, Nature Genetics, 15, pp. 363-368. 12. Willard JM, Lee DA, and Holland MM, (1998), Recovery of DNA for PCR Amplification from Blood and Forensic samples Using a Chelating Resin, Methods in Molecular Biology: Forensic DNA profiling Protocols, 98, pp. 9-18. 13. Budowle B, Wilson MR, DiZinno JA, Stauffer C, Fasano MA, Holland MM, Monson KL (1999), Mitochondrial DNA Regions HVI and HVII Population Data; Forensic Science International, June 1999. 14. Lee DA, Willard JM, Ross JP, Katz DE, Holland MM, (1999) The Use of DNA Analysis in the Identification and Re-association of Remains Recovered from TWA Flight 800 and KAL Flight 801, The 6th Indo Pacific Congress on Legal Medicine and Forensic Sciences, INPALMS-1998- KOBE, Yoshitsugu Tatsuno (ed.), pp. 249-252. 15. Hagelberg E., Sykes B. and Hedges R (1989) Nature, 342, 485. 16. Hanni C., Brousseau T., Laudet V. and Stehelin D. (1995) Nucl. Acids Res., 23, 881-882. 17. Kalmar T., Bachrati CZ., Marcsik A. and Rasko I. (2000) Nucl. Acids Res., 28, E67-e67. SUMMARY Cloning and sequencing of the hypervariable region I of mitochondrial DNA from Vietnamese blood and hair samples DNA is present inside the nucleus of every cell of our body but it is the DNA of the cell's mitochondria that has been most commonly used to construct evolutionary trees. Mitochondria have their own genome of 16,569 bp that exists outside of the cell nucleus. Each contains 13 protein coding genes, 22 tRNAs and 2 rRNAs. They are present in large numbers in each cell, so fewer samples is required for DNA extraction. They have a higher rate of substitution (mutations where one nucleotide is replaced with another) than nuclear DNA making it easier to resolve differences between closely related individuals. They are inherited only from the mother, which allows tracing of a direct genetic line. They don't recombine. The process of recombination in nuclear DNA (except the Y chromosome) mixes sections of DNA from the mother and the father creating a garbled genetic history. We have obtained total DNA from the Vietnamese hairs and blood samples. The hypervariable region in the D-loop domain of mtDNA was amplified successfully using the primers LOOP460F/ LOOP460R. PCR products were cloned in to vector and subsequently sequenced. In comparison our sequencing data with the sequence of hypervariable region of human mtDNA which was reported by Anderson (1981) we found three substitutions. The substitution C-->T at nucleotide position 16,111; 16,223 and substitution T-->C at nucleotide position 16,362. These substitution to appear recognized site for restriction enzyme Bsr I at position 16,108, and restriction enzyme Hph I at nucleotide position 16,104, and enzyme Mae III at nucleotide position 16,110 but disappear recognized site for restriction enzyme for Mnl at position 16, 235. Those, further systematic studies on mtDNA from Vietnamese population could be done based on the use of optimized protocols. Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Thị Kim Cúc. . XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÙNG SIÊU BIẾN I Ở NGƯ I VIỆT NAM Trần Mỹ Linh, Vũ Thị Thư, Phan Minh Tuấn, Lê Quang Huấn, Lê Trần Bình Viện Công nghệ sinh. Thailand để xác định trình tự. Kết quả xác định trình tự nucleotid sản phẩm PCR từ mẫu máu ngư i Việt nam (sản phẩm PCR từ mẫu tóc chưa g i xác định trình