TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Bộ môn Dược lý KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA “VIÊN TIỂU ĐƯỜNG TĐ01” TRÊN THỰC NGHIỆM 1 A ĐỘC TÍNH CẤP 1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Thuốc “Viên tiểu đường TĐ01” Dạng viên nang, đạt tiêu chuẩn sở công ty Sao Thái Dương sản xuất đạt tiêu chuẩn sở Có phụ lục thành phần qui trình sản xuất riêng - Liều lâm sàng dự kiến dùng người: viên/ngày 1.1.2 Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22g Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột nuôi phòng thí nghiệm Bộ mơn Dược lý 5-7 ngày trước nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu thức ăn chuẩn dành riêng cho chuột (do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp), uống nước tự 1.2 Máy móc phục vụ nghiên cứu - Cân điện tử Nhật, độ xác 0,001 gam - Kim đầu tù cho chuột uống - Cốc chia vạch, bơm kim tiêm 1ml 1.3 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu độc tính cấp thuốc thử TĐ-01 theo đường uống chuột nhắt trắng Nghiên cứu độc tính cấp xác định LD 50 thuốc thử TĐ-01 chuột nhắt trắng theo đường uống [1], [2], [3], [4] Trước tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm Chuột chia thành lô khác nhau, lô 10 Cho chuột uống thuốc thử TĐ-01với liều tăng dần thể tích để xác định liều thấp gây chết 100% chuột liều cao không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) Theo dõi tình trạng chung chuột, trình diễn biến bắt 2 đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như nơn, co giật, kích động, tiết…) số lượng chuột chết vòng 72 sau uống thuốc Tất chuột chết mổ để đánh giá tổn thương đại thể Từ xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 thuốc thử Sau tiếp tục theo dõi tình trạng chuột đến hết ngày thứ sau uống thuốc thuốc thử TĐ-01 1.4 Xử lý số liệu Các số liệu xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Student phần mềm Microsoft Excel Kết nghiên cứu Chuột nhắt trắng uống thuốc thử TĐ-01 từ liều thấp đến liều cao Lô chuột uống đến liều 75 ml/kg thể chuột tương đương 0,25 ml/10 g, lần 24 Theo dõi chuột chết, triệu chứng bất thường 72 sau uống thuốc lần suốt ngày, kết trình bày bảng Liều 75 ml/kg liều tối đa dùng đường uống để đánh giá độc tính cấp thuốc thử TĐ-01 (nồng độ đặc nhất, thể tích uống tối đa, số lần uống tối đa 24 giờ) Bảng 1: Kết nghiên cứu độc tính cấp theo liều Thuốc thử Lô chuột Lô Lô Lô Lô n 1 1 Liều (ml/kg) Tỷ lệ chết (%) 30 45 60 75 Dấu hiệu bất thường khác Không chết, không tiêu chảy, khơng có bất thường Khơng chết, khơng tiêu chảy, khơng có bất thường Khơng chết, khơng tiêu chảy, khơng có bất thường Khơng chết, khơng tiêu chảy, khơng có bất thường Kết luận: Thuốc thử TĐ-01 khơng có biểu độc tính cấp liều 75 ml/kg dung dịch gốc Chưa xác định LD50 chuột nhắt trắng thuốc thử TĐ01trên đường uống [1] Thuốc thử TĐ-01với liều 75 ml /kg tương ứng với 100 viên/kg khơng có độc tính cấp Như chuột uống với liều gấp 46,29 lần người khơng có độc tính cấp Theo WHO thuốc an tồn cao, có số điều trị rộng (Tính hệ số ngoại suy chuột nhắt trắng 12, người trưởng thành 50 kg, liều tối đa viên/ngày/người) 4 TÀI LIỆU THAM KHẢO Gerhard Vogel H (2008), Drug discovery and evaluation Pharmacological assays, Springer British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984) Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity Human Toxicol., 3, 85-92 Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J and Walker, A.P (1990) The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test Fd Chem Toxicol 28, 469-482 OECD (2001), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, acute oral toxicity, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19 World Health Organization (2000), Working group on the safety and efficacy of herbal medicine, Report of regional office for the western pacific of the World Health Organization 5 B ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 1.1 Đối tượng nghiên cứu: 1.1.1 Thuốc hoá chất nghiên cứu: 1.1.1.1 Thuốc nghiên cứu: Thuốc “Viên tiểu đường TĐ01” Dạng viên nang, đạt tiêu chuẩn sở công ty Sao Thái Dương sản xuất - Liều lâm sàng dự kiến dùng người: viên/ngày Liều lâm sàng dự kiến dùng chuột cống (liều có tác dụng tương đương người, tính theo hệ số 6): 1,08 viên/kg/ngày 1.1.1.2 Hoá chất: - Kit định lượng enzym chất chuyển hoá máu : ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần, creatinin hãng Hospitex Diagnostics (Italy) hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng máy sinh hóa bán tự - động Erba Ấn Độ Các dung dịch xét nghiệm máu hãng Exigo, định lượng máy Exigo – - Boule Medical AB Thụy Điển Các hoá chất xét nghiệm làm tiêu mô bệnh học 1.1.2 Động vật thực nghiệm: hai giống, khoẻ mạnh Chuột cống trắng chủng Wistar, trọng lượng 180 ± 20 g Trung tâm cung cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng – Hà Tây cung cấp Động vật ni phòng thí nghiệm - 14 ngày trước nghiên cứu thức ăn chuẩn dành riêng, uống nước tự 1.2 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu độc tính bán trường diễn chuột cống trắng theo đường uống theo hướng dẫn Tổ chức y tế giới thuốc có nguồn gốc dược liệu [1]: Chuột chia làm lô, lô 10 - Lô chứng: Uống nước cất 1ml/kg/ngày 6 - Lô trị 1: Uống “Viên tiểu đường TĐ01” liều 1,08 viên/kg/ngày (liều dự kiến lâm sàng) - Lô trị 2: Uống “Viên tiểu đường TĐ01” liều 3,24 viên/kg/ngày (gấp lần lô trị 1) Chuột uống nước thuốc thử 90 ngày liên tục, ngày lần vào buổi sáng Các tiêu theo dõi trước trình nghiên cứu: - Tình trạng chung, thể trọng chuột - Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu số lượng tiểu cầu - Đánh giá chức gan thơng qua định lượng chất chuyển hố máu: bilirubin toàn phần, albumin cholesterol - Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym máu: ALT, AST - Đánh giá chức thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết Các thông số theo dõi kiểm tra vào trước lúc uống thuốc, sau 30 ngày uống thuốc, sau 60 ngày uống thuốc sau 90 ngày uống thuốc - Mô bệnh học: Sau 90 ngày uống thuốc, chuột mổ để quan sát đại thể toàn quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận 30% số chuột lô Các xét nghiệm vi thể thực Trung tâm Nghiên cứu phát sớm ung thư (do PGS.TS Lê Đình Roanh đọc kết vi thể) 1.3 Xử lý số liệu: Các số liệu nghiên cứu xử lý thống kê theo phương pháp t-test Student Số liệu biểu diễn dạng: X Sự khác biệt có ý nghĩa p < 0,05 7 ± SD KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Tình trạng chung thay đổi thể trọng chuột: 2.1.1 Tình trạng chung: Trong thời gian thí nghiệm, chuột lơ chứnghoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống tốt, phân khô Lô uống “Viên tiểu đường TĐ01” liều hoạt động chậm chạp hơn, nhanh nhẹn, ăn so với lơ chứng, mắt sáng, phân khô Đặc biệt, chuột lô trị có biểu yếu chuột lơ trị 2.Ngồi khơng thấy điểm thêm lô chuột suốt thời gian nghiên cứu 2.1.2 Sự thay đổi thể trọng chuột: Bảng 2.1.Ảnh hưởng “Viên tiểu đường TĐ01” đến thể trọng chuột Lô chứng Thời gian % thay Trọng đổi trọng lượng (g) lượng Trước uống thuốc 164,00 ± 19,41 Sau 30 ngày 176,00 ± uống thuốc 24,59 P trước – sau P trước – sau P trước – sau 7,3 > 0,05 164,00 ± 17,13 2,1 161,50 ± 40,69 4,4 172,00 ± 21,50 > 0,05 179,00 ± 31,43 P (t-test Student) % thay đổi trọng lượng 179,50 ± 15,89 > 0,05 0,3 > 0,05 3,6 > 0,05 0,8 > 0,05 > 0,05 5,8 > 0,05 1,2 Lô trị % thay Trọng đổi trọng lượng (g) lượng > 0,05 > 0,05 Sau 90 ngày 162,00 ± uống thuốc 14,94 Trọng lượng (g) 171,50 ± 10,29 > 0,05 Sau 60 ngày 167,50 ± uống thuốc 23,24 Lô trị 185,95 ± 19,55 > 0,05 0,3 178,00 ± 21,11 > 0,05 Kết bảng 2.1 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày 90 ngày uống “Viên tiểu đường TĐ01”, trọng lượng chuột lô (lô chứng lô trị) có xu hướng tăng so với trước nghiên cứu, nhiên mức tăng không rõ rệt, 8 khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê Khơng có khác biệt mức độ gia tăng trọng lượng chuột lô chứng lô dùng thuốc thử (p > 0,05) 2.2 Đánh giá chức tạo máu: Bảng 2.2.Ảnh hưởng “Viên tiểu đường TĐ01” đến số lượng hồng cầu máu chuột Số lượng hồng cầu ( T/l ) Thời gian Trước uống thuốc Sau 30 ngày uống thuốc p (trước sau) Sau 60 ngày uống thuốc p (trước sau) Sau 90 ngày uống thuốc p (trước sau) Lô chứng Lô trị Lô trị P (t- test Student) Lô trị – Lô trị – Lô chứng Lô chứng 7,09 ± 0,78 7,17 ± 0,37 6,95 ± 0,62 > 0,05 > 0,05 7,57 ± 0,46 6,87 ± 0,55 7,34 ± 0,27 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 6,92 ± 0,69 6,32 ± 0,63 7,16 ± 0,43 > 0.05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 6,95 ± 0,82 6,35 ± 0,51 6,06 ± 0,52 > 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 Kết bảng 2.2 cho thấy: Ở thời điểm trước nghiên cứu, số lượng hồng cầu máu chuột tất lô khơng có khác biệt Sau 30 ngày dùng thuốc “Viên tiểu đường TĐ01”với liều 1,08 viên/kg/ngày, chuột lô trị có số lượng hồng cầu thấp có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P 0,05 11,40 ± 1,67 11,16 ± 1,27 > 0,05 > 0,05 12,52 ± 1,42 11,31 ± 1,42 > 0,05 > 0,05 11,87 ± 1,01 11,78 ± 0,85 Lô trị – Lô trị – Lô chứng Lô chứng > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 11,41 ± 0,57 > 0,05 11,38 ± 0,51 > 0,05 Kết bảng 2.3 cho thấy: Sau 30 ngày,60 ngày 90 ngày uống “Viên tiểu đường TĐ01”,chuột lô trị (uống “Viên tiểu đường TDD01” liều tương đương lâm sàng 1,08 viên/kg/ngày) có hàm lượng huyết sắc tố giảm dần theo thời gian, nhiên thay đổi chưa có ý nghĩa so với lơ chứng so với trước dùng thuốc (p>0,05) Ở lô trị (uống “Viên tiểu đường TDD01” liều gấp lần lâm sàng 3,24 viên/kg/ngày), lượng huyết sắc tố chuộtsau 30 ngày 60 ngày uống thuốc khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng so sánh thời điểm trước sau uống thuốc thử Tuy nhiên, đến 90 ngày sau dùng thuốc, số hạ thấp rõ rệt so với lô chứng so với trước nghiên cứu (p 0,05 1,18± 0,15 1,24± 0,23 1,28± 0,20 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 1,24 ± 0,18 1,12± 0,21 1,11± 0,11 > 0,05 > 0,05 > 0,05 1,17± 0,13 1,09± 0,19 1,07± 0,12 > 0,05 > 0,05 > 0,05 p (trước - sau) Sau 60 ngày uống thuốc p (trước - sau) Sau 90 ngày uống thuốc p (trước - sau) > 0,05 > 0,05 Kết bảng 2.13 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày 90 ngày uống “Viên tiểu đường TĐ01”, xét nghiệm đánh giá chức gan nồng độ cholesterol tồn phần máu chuột lơ trị (uống “Viên tiểu đường TĐ01” liều tương đương lâm sàng 1,08 viên/kg/ngày) lô trị (uống “Viên tiểu đường TĐ01” liều gấp lâm sàng 3,24 viên/kg/ngày) khác biệt có ý nghĩa so với lơ chứng so sánh hai thời điểm trước sau uống thuốc thử (p>0,05) 2.5 Đánh giá chức thận: Bảng 2.14 Ảnh hưởng “Viên tiểu đường TĐ01” đến nồng độ creatinin máu chuột 18 18 Thời gian Trước uống thuốc Sau 30 ngày uống thuốc p (trước - sau) Sau 60 ngày uống thuốc p (trước - sau) Sau 90 ngày uống thuốc p (trước - sau) Creatinin (mg/dl) Lô chứng Lô trị Lô trị P (t- test Student) 1,07± 0,09 1,08± 0,09 1,08± 0,09 > 0,05 1,07± 0,09 1,07 ± 0,11 1,08± 0,12 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 1,03± 0,09 1,12± 0,10 1,05± 0,11 > 0,05 > 0,05 > 0,05 1,05± 0,07 1,03± 0,08 1,02± 0,08 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Kết bảng 2.14 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày 90 ngày uống “Viên tiểu đường TĐ01”, lô trị (uống “Viên tiểu đường TĐ01”liều tương đương lâm sàng1,08 viên/kg/ngày) lô trị (uống “Viên tiểu đường TĐ01”liều gấp liều lâm sàng90mg /kg/ngày), nồng độ creatinin máu chuột khơng có thay đổi khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng so sánh hai thời điểm trước sau uống thuốc thử (p>0,05) 2.6 Thay đổi mô bệnh học: Sau 90 ngày uống thuốc 2.6.1 Đại thể: Trên tất chuột thực nghiệm (cả lô chứng lơ trị), khơng quan sát thấy có thay đổi bệnh lý mặt đại thể quan tim, phổi, gan, lách, tuỵ, thận hệ thống tiêu hố chuột 2.6.2 Vi thể: - Hình thái vi thể gan: + Lô chứng: + Lô trị (uống “Viên tiểu đường TĐ01”1,08 viên/kg/ngày): + Lô trị (uống “Viên tiểu đường TĐ01”3,24 viên/kg/ngày): 19 19 Ảnh 1: Hình thái vi thể gan chuột lơ chứng (chuột số 02) (HE x 400) Tế bào gan bình thường (HE x 400: Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400 lần) Ảnh 2: Hình thái vi thể gan chuột lơ chứng (chuột số 09) (HE x 400) Tế bào gan bình thường (HE x 400: Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400 lần) 20 20 Ảnh 3: Hình thái vi thể gan chuột lô chứng (chuột số 10) (HE x 400) Tế bào gan bình thường (HE x 400: Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400 lần) Ảnh 4: Hình thái vi thể gan chuột lơ trị 1(chuột số 24) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan thối hóa nhẹ, có hốc sáng nhỏ 21 21 Ảnh 5: Hình thái vi thể gan chuột lô trị 1(chuột số 27) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan bình thường Ảnh 6: Hình thái vi thể gan chuột lơ trị 1(chuột số 30) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan bình thường 22 22 Ảnh 7: Hình thái vi thể gan chuột lơ trị 2(chuột số 36) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan bình thường Ảnh 8: Hình thái vi thể gan chuột lô trị 2(chuột số 44) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan thối hóa nhẹ, có hốc sáng nhỏ 23 23 Ảnh 9: Hình thái vi thể gan chuột lô trị 2(chuột số 45) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan bình thường - Hình thái vi thể thận: + Lơ chứng: + Lơ trị (uống “Viên tiểu đường TĐ01”1,08 viên/kg/ngày): + Lô trị (uống “Viên tiểu đường TĐ01”3,24 viên/kg/ngày): Ảnh 10: Hình thái vi thể thận chuột lơ chứng (chuột số 02) (HE x 400) Thận bình thường 24 24 Ảnh 11: Hình thái vi thể thận chuột lơ chứng (chuột số 09) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 12: Hình thái vi thể thận chuột lơ trị (chuột số 10) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 25 25 Ảnh 13: Hình thái vi thể thận chuột lô trị 1(chuột số 24) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường Ảnh14: Hình thái vi thể thận chuột lơ trị 1(chuột số 27) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 26 26 Ảnh 15: Hình thái vi thể thận chuột lô trị 1(chuột số 30) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Thận thối hóa nhẹ tế bào ống lượn gần Ảnh 16: Hình thái vi thể thận chuột lơ trị (chuột số 36) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 27 27 Ảnh 17: Hình thái vi thể thận chuột lô trị 2(chuột số 44) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 18: Hình thái vi thể thận chuột lơ trị (chuột số 45) sau 90 ngày uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 28 28 NHẬN XÉT Kết nghiên cứu độc tính bán trường diễn “Viên tiểu đường TĐ01”cho thấy: Trên hai lô chuột, lô uống “Viên tiểu đường TĐ01” liều tương đương lâm sàng 1,08 viên/kg/ngày lô uống liều cao gấp lần lâm sàng (3,24 viên/kg/ngày) liên tục 90 ngày, kết cho thấy: - Cả hai liều thuốc thử không làm ảnh hưởng xấu đến tình trạng chung, mức độ tăng trọng lượng chuột so với lô chứng.Tuy nhiên, chuột lô uống “Viên tiểu đường TĐ01” liều tương đương lâm sàng có biểu yếu lô trị 2: Hoạt động chậm hơn, ăn - Cả hai liều thuốc thử làm thay đổi kết xét nghiệm đánh giá chức tạo máu (số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit) so với lô chứng (p