BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM HỒNG NGỌC NGHI£N CøU MốI LIÊN QUAN GIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MộT Số BIếN CHứNG BệNH NHÂN ĐáI THáO §¦êNG TYPE Chuyên ngành : Sinh lý học Mã số : 60720106 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS Nguyễn Huy Bình 2.TS Nguyễn Thị Thanh Hương Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập tiến hành nghiên cứu, tơi giúp đỡ tận tình từ thầy cô giáo, bạn đồng nghiệp, từ quan người thân gia đình Hồn thành luận văn này, cho phép tơi bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Bình, TS Nguyễn Thị Thanh Hương, người thầy, người cô, người hướng dẫn khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Tập thể cán nhân viên Khoa khám bệnh - Bệnh viện đa khoa SaintPaul, Trung tâm Gen Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, thầy cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội nói chung thầy giáo Bộ mơn Sinh lý học nói riêng tạo điều kện thuận lợi nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu cho trình học tập, nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp Cuối xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình, người thân động viên, chia giúp đỡ trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Phạm Hồng Ngọc LỜI CAM ĐOAN Tôi Phạm Hồng Ngọc, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40 chuyên ngành Sinh lý học, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Nguyễn Huy Bình, TS Nguyễn Thị Thanh Hương Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Phạm Hồng Ngọc DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5,10-MTHF 5-MTHF ALTT ARMS BMI Cholesterol TP DHF DNA ĐTĐ eGFR HATT HATTr HCTH Hcy HDL – C HTKTW IDF LDL – C MTHFR RLMM TALTT TBMMN TG THF TK WHO 5,10- Methylene tetra hydrofolate 5-Methyl tetra hydrofolate Áp lực thẩm thấu Amplification refractory mutation system Body mass index Cholesterol toàn phần Dihydro folate Deoxiribonucleic acid Đái tháo đường Estimate glomerular filtration rate Huyết áp tâm thu Huyết áp tâm trương Hội chứng thận hư Homocystein High density lipoprotein cholesterol Hệ thần kinh trung ương International Diabetes Federation Low density lipoprotein cholesterol Methyl tetrahydrofolate reductase Rối loạn mỡ máu Tăng áp lực thẩm thấu Tai biến mạch máu não Triglycerid Tetra hydrofolate Thần kinh World Health Organization MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh lý phức tạp nhiều yếu tố nhiều gen gây nên Theo thông báo Liên đoàn ĐTĐ quốc tế IDF (International Diabetes Federation) có khoảng 415 triệu người mắc ĐTĐ type số tăng lên tới 642 triệu người vào năm 2020 khơng có hành động can thiệp kịp thời IDF ước tính 183 triệu người họ mắc ĐTĐ [1] Tại Việt Nam tỷ lệ mắc ĐTĐ cao gia tăng nhanh chóng Theo điều tra năm 1990 điều tra Hà Nội, Huế, thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ mắc ĐTĐ type tương ứng 1,20%, 0,96% 2,52% [2] Thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ nước 5,0% (khoảng 4,5 triệu người), thành phố lớn khu cơng nghiệp có tỷ lệ từ 7,0% đến 10,0% [3] Như sau 10 năm tỷ lệ ĐTĐ gia tăng 300% [4] Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ gia tăng nhanh chóng tồn giới kéo theo hậu nghiêm trọng sức khỏe kinh tế toàn xã hội ĐTĐ nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ giới, gây giảm tuổi thọ trung bình từ đến 10 năm, nguyên nhân hàng đầu gây mù lồ suy thận giai đoạn cuối [5] Có nhiều nguyên nhân làm gia tăng biến chứng ĐTĐ chế độ ăn uống khơng hợp lý, vận động, khơng tn thủ chế độ chăm sóc điều trị, dùng thuốc khơng đúng, Ngồi số yếu tố khác góp phần làm gia tăng biến chứng đa hình gen, có gen MTHFR C677T Gen MTHFR C677T làm tăng nồng độ homocystein (Hcy) máu làm giảm hoạt tính enzyme methyl tetrahydrofolat reductase (MTHFR), giảm chuyển hóa Hcy thành methionine Do ức chế phát triển nội mạc, giảm đáp ứng vận mạch, giảm tác dụng heparin làm gia tăng biến chứng ĐTĐ đặc biệt biến chứng tim mạch [6], [7], [8] Những người mang 10 gen MTHFR C677T dạng dị hợp tử hoạt tính enzyme MTHFR giảm 30% - 40% so với bình thường dạng đồng hợp tử 70% [9], [10] Trên giới có nhiều nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với biến chứng tim mạch, thận, thần kinh,… [11], [12], [13], [14], [15] Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu đề cập đến vấn đề trên, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với số biến chứng bệnh nhân đái tháo đường type 2” với hai mục tiêu: Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T bệnh nhân ĐTĐ type 2 Xác định mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với số biến chứng bệnh nhân ĐTĐ type 52 Linnebank M, Homberger A, Nowak-Goettl U et al (2000), Linkage disequilibrium of the common mutation 677C→T and 1298A→C of the human methylenetetrahydrofolate reductase gene as proven by the novel polymorphisms 129C→T, 1068C→T, Eur J Ped, 159, 472 - 473 53 Rosenberg N, Murata M, Ikeda Y et al (2002), The frequent 5,10methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism is associated with a common haplotype in Whites, Japanese, and Africans, Am J Hum Genet, 70, 758 - 762 54 Frosst P, Blom H.J, Milos R et al (1995), A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase, Nat Gene., 10, 111 - 113 55 Goyette P, Frosst P, Rosenblatt DS et al (1995), Seven novel mutations in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and genotype/phenotype correlations in severe MTHFR deficiency, Am J Hum Genet, 56, 1052 - 1059 56 Goyette P, Christensen B, Rosenblatt DS et al (1996), Severe and mild mutations in cis for the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, and description of novel mutations in MTHFR, Am J Hum Genet, 59, 1268 - 1275 57 Viel A, Dall'Agnese L, Simone F et al (1997), Loss of heterozygosity at the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase locus in human ovarian carcinomas, Br J Cancer, 75, 1105 - 1110 58 Weisberg I, Tran P, Christensen B et al (1998), A second genetic polymorphism in methylenetrahydrofolate reductase (MTHFR) associated with decreased enzyme activity, Mol Genet Metabol, 64, 169 - 172 59 Rady PL, Szucs S, Grady J et al (2002), Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine synthase reductase (MTRR) in ethnic populations in Texas: A report of a novel MTHFR polymorphic site, G1793A, Am J Med Genet, 107, 162 - 168 60 Botto LD, Yang Q (2000), 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase gene variants and congenital anomalies: a HuGE review, Am J Epidemiol, (151), 862 - 877 61 Wilcken B, Bamforth F, Li Z et al (2003), Geographical and ethnic variation of the 677T>C allene of 5, 10 meththylenetetrahydrofolat reductase (MTHFR): findings from over 7000 newborns from 16 areas worldwide, J Med Genet, 40, 619 - 625 62 Schneider J A, Rees D C, Liu Y T et al (1998), Worldwide distribution of a common MTHFR mutation, Am J Hum Genet, 62, 1258 - 1260 63 Sadewa A H, Sunarti, Sutomo R et al (2002), The C677T mutation in the MTHFR gene among the indonesia Javanese population, Kobe J Med Sci., 8, 137 - 144 64 Hegete R A, Tully C, Young T K et al (1997), 677T mutation of MTHFR and cardiovascular disease in Canada Inuit, Lancet, 349, 1221 - 1222 65 Laura Di Renzo, Luigi Tonino Marsella, Francesca Sarlo et al (2014), C677T gene polymorphism of MTHFR and metabolic syndrome: response to dietary intervention, Journal ò translational medecine, 12, 329 - 348 66 Boyi Yang, Shujun Fan, Xueyan Zhi et al (2014), Associations of MTHFR C677T and MTRR A66G gene polymorphisms with metabolic sydrome: A case control study in Northern China, Int J Mol Sci, 15, 21687 - 21702 67 Nevin llhan, Mehmet Kucuksu, Dilara Kaman et al (2008), The 677 C/T MTHFR Polymorphism is Associated with Essential Hypertension, Coronary Artery Disease, and Higher Homocysteine Levels, Archives of Medical Research, 39(1), 125 - 130 68 R F Franco, A G Araújo, J F Guerreiro et al (2013), Analysis of the 677 C→T Mutation of the Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene in Different Ethnic Group, Thrombosis and Haemostasis, 79(1), 119 - 121 69 Santosh Kumar Gupta, Jyoti Kotwal, Atul Kotwal (2010), Role of homocystein and MTHFR C677T gene polymorphism as risk factors for coronary artery disease in young Indians, Indian J Med Res, 135, 506 - 512 70 Frosst P, Blom HJ, Milos R et al (1995), A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase, Nat Genet, 10(1), 111 - 113 71 Makiko Maeda, Isamu Yamamoto, Masakatsu Fukuda et al (2003), MTHFR Gene Polymorphism as a Risk Factor for Diabetic Retinopathy in Type Diabetic Patients Without Serum Creatinine Elevation, Diabetes Care, 26(2), 547 - 548 72 Vlad Shpichinetsky, Itamar Raz, Yechiel Friedlander et al (2000), The Association between Two Common Mutations C677T and A1298C in Human Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene and the Risk for Diabetic Nephropathy in Type II Diabetic Patients, J Nutr, 130, 2493 2497 73 Maša Vidmar, Alenka Šmid, Nataša Karas-Kuželički (2017), The influence of folic acid and 5-methyltetrahydofolate on the metabolic activity depending on changes in the folate cycle genes, Department of Obstetrics and Gynecology, Universery Medical Centre Ljubljana, Slovenia 74 Jacob Joseph, Joseph Loscalzo (2013), Methoxistasis: Integrating the Roles of Homocysteine and Folic Acid in Cardiovascular Pathobiology, Nutrients, 5(8), 3235 - 3256 75 PGS TS Nguyễn Công Khẩn, PGS TS Hà Thị Anh Đào (2007), Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, Nhà xuất Y học 76 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật sinh học phân tử, Nhà xuất Y học 77 International Diabetes Federation (2012), Global Guideline for Type Diabetes 78 Nguyễn Lân Việt (2007), Tăng huyết áp, Thực hành tim mạch, Nhà xuất Y học 79 Metzger BE, Coustan DR (2007), Summary and recommendations of the Fifth International Workshop–Conference on Gestational Diabetes Mellitus, Diabetes Care, 30(2), 251 - 260 80 World Health Organization Western Pacific Region (2000), Redefining obesity and its treatment, International Obesity Taskforce 81 National Cholesterol Education Program (2001), ATP III Guidelines AtA-Glance Quick Desk Reference 82 Hội tim mạch học Việt Nam (2015), Cập nhật khuyến cáo, chẩn đoán, điều trị tăng huyết áp 2015 83 Đỗ Gia Tuyển (2007), Suy thận mạn, Bài giảng bệnh học nội khoa tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội 84 Phạm Ngọc Hoa, Nguyễn Huỳnh Nguyên, Lê Thị Mãi (2016), Tỷ lệ yếu tố nguy bệnh đái tháo đường có biến chứng khoa nội tổng hợp Bệnh viện đa khoa An Giang, Kỷ yếu hội nghị khoa học Bệnh viện An Giang, 10, 49-58 85 Phan Hướng Dương (2016), Thực trạng tiền đái tháo đường hiệu can thiệp có bổ sung metformin người có BMI ≥ 23kg/m2 thành phố Hải Phòng năm 2012 - 2014, Luận án tiến sĩ y học, Viện vệ sinh dịch tễ trung ương 86 Lizbeth Salazar-Sanchez, Juan Jose Madrigal-Sanchez, Pedro GonzalezMartinez (2016), ACE I/D (Rs1799752), MTHFR C677T (Rs1801133), and CCR5 D32 (Rs333) Genes and their Association with Hypertension and Diabetic Nephropathy in Urban Areas of Costa Rica, Nicaragua, and Mexico, Update on Essential Hypertension, Mexico, InTech 87 Otiniano M, Ottenbacher K, Black S (2003), Lower extremity amputations in diabetic Mexican – American elders: incidence, prevalence and correlationes, J Diabetes, 5, 59 - 65 88 Kesavadev JD, Short KR, Nair KS (2003), Diabetes in old age: an emerging epidemic, J Assoc Physicians India, 51, 1083 - 1094 89 Nguyễn Thị Thu Trang (2013), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân đái tháo đường type có tăng huyết áp, Tạp chí y học thực hành, 5, tr 57 - 60 90 C Heidemann, HoffmannJ, Spranger (2005), A dietary pattern protective against type diabetes in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC), Diabetologia, 48(6), 1126 - 1134 91 Phan Hướng Dương (2011), Điều tra dịch tễ học bệnh đái tháo đường yếu tố nguy tỉnh Kiên Giang 2004, Y học thực hành, 771(6) 28 - 32 92 Nguyễn Thị Nhạn (2003), Nghiên cứu biến chứng thần kinh tự chủ tim mạch trắc nghiệm Ewing bệnh nhân đái tháo đường, Luận án tiến sĩ y học, Trường Đại học Y Huế 93 Nguyễn Khoa Diệu Vân (1999), Nghiên cứu giá trị microalbumin niệu chẩn đoán sớm bệnh cầu thận đái tháo đường, Luận văn tốt nghiệp BSCK II, Đại học Y Hà Nội 94 Gomez-Marcos M.A, Recio-Rodriguez J, Patino-Alonso M.C (2011), Yearly evolution of organ damage markers in diabetes or metabolic syndrome: data from the LOD-DIABETES study, Cardiovascular Diabetology, 10, 90 - 99 95 Alert CV Fraser HS (1997), Diabetes mellitus in Barbados: An assessment of the CCMRC/Ministry of Health's effort to improve management in the public sector, West Indian Med, 46(2), 20 - 30 96 Phùng Thị Thu Phương (2015), Nghiên cứu nồng độ betahydroxubutyrate máu bệnh nhân đái tháo đường Việt Nam, Sinh học thực nghiệm, Đại học quốc gia Hà Nội 97 Trần Nam Quân (2015), Nghiên cứu microalbumin niệu mức lọc cầu thận người tiền đái tháo đường đái tháo đường type phát lần đầu, Y học thành phố Hồ Chí Minh, 19(5), 137 - 142 98 EN Ellis BA Warady (1997), Renal structural - functional relationships in early diabetes mellitus, Pediatric Nephropathy, 11, 584 - 591 99 GW stephen JA Gillaspy (1990), Racial differences in the incidence of end stage renal disease in typ I and II diabetes mellitus, Am J Kidney, 15, 562 - 567 100 David M Nathan (2014), The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Study at 30 Years: Overview, Diabetes Care, 37(1), - 16 101 Wilfinger M.C, Weaver K.P, Loffert A.J (1997), DNA extraction and purification, Meta gene, 503, 509-22 102 Sarah W El Hajj Chehadeha, Herbert F Jelinekb, Wael A Al Mahmeedc (2016), Relationship between MTHFR C677T and A1298C gene polymorphisms and complications of type diabetes mellitus in an Emirati population, Meta Gene, 9, 70 - 75 103 Anzel Bahadir, Recep Eroz Yasin Turker (2015), Does the MTHFR C677T gene polymorphism indicate cardiovascular disease risk in type diabetes mellitus patients?, Anatol J Cardiol, 15, 524 - 530 104 Settin A, El-Baz R, Ismaeel A (2015), Association of ACE and MTHFR genetic polymorphisms with type diabetes mellitus: Susceptibility and complications, J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 16(4), 838 - 843 105 Sarah W, El Hajj Chehadeh, Herbert F (2016), Relationship between MTHFR C677T and A1298C gene polymorphisms and complications of type diabetes mellitus in an Emirati population, Meta Gene, 9, 70 - 75 106 American Diabetes Association (2011), Executive Summary: Standards of Medical Care in Diabetes - 2011, Diabetes Care, 1, - 10 107 American Diabetes Association (1999), Implications of the United Kingdom Prospective Diabetes Study, Diabetes Care, 22(1), 27 - 31 108 Nurten Dinỗ, Selda Bereket Yỹcel, Fatma Taneli (2015), The Effect of the MTHFR C677T Mutation on Athletic Performance and the Homocysteine Level of Soccer Players and Sedentary Individuals, Journal of Human Kinetics volume, 51, 61 - 69 109 Motahareh Kheradmand, Zhila Maghbool, Sedigheh Salemi (2017), Associations of MTHFR C677T polymorphism with insulin resistance, results of NURSE Study (Nursing Unacquainted Related Stress Etiologies), J Diabetes Metab Disord 2017, (16), 22 - 30 110 Dicker-Brown A (2001), The effect of glucose and insulin on the activity of methylene tetrahydrofolate reductase and cystathionine-β-synthase: studies in hepatocytes, Atherosclerosis, 158(2), 297 - 301 111 Li Y (2013), Hyperhomocysteinemia promotes insulin resistance by inducing endoplasmic reticulum stress in adipose tissue, j Bio Chem, 288(14), 9583 - 9592 112 Haiyan Chen, Fang Wei, Lihua Wang (2015), MTHFR gene C677T polymorphism and type diabetic nephropathy in Asian populations: a meta-analysis, Int J Clin Exp Med, 8(3), 3662 - 3670 PHỤ LỤC I MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN MTHFR C677T Ở BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE Mã bệnh án……………………Mã số bệnh nhân……………………… Đã ký giấy đồng ý tham gia Có Khơng (Nếu khơng, kết thúc) Họ tên người tham gia nghiên cứu Địa Điện thoại liên lạc └─┴─┴─└─┴─└─┴─└─┴─┴─┴─┘ C THÔNG TIN VỀ BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU C1 Giới Nam C2 Nữ Ngày tháng năm Ngày/tháng/năm  //  C3 sinh Dân tộc Kinh Khác D THÔNG TIN VỀ TIỀN SỬ, TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG VÀ BỆNH ĐTĐ D1 Tiền sử gia đình có người mắc Có D2 đái tháo đường Tiền sử sinh ≥ 4kg Khơng Có D3 (với nữ) Tiền sử chẩn đốn đái tháo Khơng Có D4.1 đường thai nghén (với nữ) Tiền sử hút thuốc Khơng Có Thời điểm chẩn đốn Khơng  //  D4.2 D5 Tiền sử có rối loạn Có D6 Lipid máu Tiền sử mắc bệnh tăng huyết áp Không Có Tiền sử mắc bệnh lý khác Khơng Có D7 Khơng  Thối hóa khớp gối  Cơn đau thắt ngực  Suy tim  Loãng xương  Loãng xương  Suy thận  Bệnh phổi tắc  lý 9 Bệnh Khác (ghi rõ ) nghẽn mạn tính tuyến giáp ……………… D8 Dùng thuốc: Thuốc đái tháo đường  Thuốc viên D9 D11 D13 D15 tiêm + viên Cân nặng (kg) , Vòng mơng (cm) Chiều cao (cm) Đo vòng  Thuốc tiêm, liều , D10 Vòng D12 , BMI , D14 cổ chân  Thuốc P D16 , E CÁC THĂM DÒ CẬN LÂM SÀNG eo (cm) , Huyết áp nghỉ (mmHg), Đo vòng cổ chân T , E1 Glucose , E2 HbA1c (%) , E3 Triglycerid , E4 CholesterolTP , E5 (mmol/l) LDL – , E6 (mmol/l) HDL – chol , E7 (mmol/l) ALT (UI/l) , E8 (mmol/l) AST (UI/l) , E9 Creatinin , E10 Ure (mmol/l) , (µmol/l) chol E11 CRP , E12 BC niệu , E13 Microabumin , E14 Protein niệu , E15 niệu Hồng cầu (T/l) , E16 (g/l) BC (G/l) , E17 Hb(g/l) Tiểu cầu(G/l) , , E18 E19 Kết DNA NEUT (%) , , CC  CT  TT  PHỤ LỤC II TRANG THIẾT BỊ TÁCH DNA − − − − − − − − − − − − − − − − Máy li tâm Kubota 3300, máy Centrifuge 5424 R (Eppendorf) Máy minispin Máy lắc vortex Máy đo mật độ quang NanoDrop 1000 (Thermo) Máy ủ nhiệt Thermomixer comfort (Eppendorf) Máy PCR mastercycle epgradient (Eppendorf) Máy điện di Mulpid Exu (Nhật Bản) Máy chụp Geldoc Tủ an toàn sinh học Tủ lạnh bảo quản -4oC, -20oC Ống PCR 0,2 ml, ống eppendorf 1,5ml khử trùng Bộ pipet 1000μl, 200μl, 100μl, 20μl, 10 μl Đầu côn loại khử trùng khơng có DNA (free DNA) Giá để ống, phiến lạnh để mẫu Găng tay, áo choàng, giấy thấm Bút dạ, đồng hồ bấm giờ, thùng đựng rác PHỤ LỤC III HĨA CHẤT SINH PHẨM TÁCH DNA Bộ hóa chất để tách DNA (kit Omega – USA) − − − − − − − Cell Lysis Solution 28 Nucleic Lysis Solution RNase Solution DNA rehydration Solution Protein precipitation Solution Ethanol 70% nhiệt độ phòng (bảo quản 40C) Isopropanol tinh (96 -100%) nhiệt độ phòng (bảo quản 40C) Hóa chất để PCR, điện di − − − − − − − − PCR Master mix 2x (Fermantas) Thang DNA chuẩn X174 DNA/ HaeIII Digest (Biolabs) Dung dịch EDTA (0.5M, PH = 8) Đệm điện di UltrapureTMTBE buffer 0.5X (Invitrogen) RedsafeTM (Intron Biotechnology) Thạch Agarose (Promega, Spain) Nước tinh GIBCO® UltraPure Distilled Water (Invitrogen) Mẫu bệnh phẩm DNA tách chiết PHỤ LỤC IV Quy trình tách DNA DNA tách từ tế bào bạch cầu sử dụng Kit PROMEGA: Lấy 300ul máu, sau bổ sung thêm 900ul Cell Lysis Solution => Mix Ủ 10 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 14500 rcf 30 giây Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul Nuclei Lysis Solution => Mix Bổ sung 100ul Protein Precipitation Solution Vortex 20 giây Ly tâm 16000 rcf phút Chuyển sịch sang ống eppendorf có chứa 300ul Isopropanol => Mix Ly tâm 16000 rcf 10 phút 10 Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul ethanol 70% 11 Ly tâm 16000 rcf phút => Loại bỏ dịch 12 Làm khô mẫu 15 phút máy hút chân không 13 Bổ sung 100ul nước 3D/ DNA Rehydration Solution Ủ 65°C 4°C qua đêm PHỤ LỤC V Bảng A Mối tương quan gen MTHFR C677T với kiểm soát lipid máu bệnh nhân ĐTĐ type phân tích tương quan đa biến Yếu tố liên quan OR (95%CI) p Tuổi (năm) 0,92 (0,92 - 1,01) Kiểm soát BMI 0,63 (0,96 - 1,04) >0,05 >0,05 Đường Uống dùng Uống + tiêm 0,37 (0,11 – 1,32) >0,05 thuốc Tiêm 0,58 (0,22 - 1,49) >0,05 Thời gian mắc bệnh 1,17 (0,48 - 2,86) >0,05 Kiểm soát đường máu 0,70 (0,33 - 1,50) >0,05 Kiểm soát huyết áp 1,0 (0,96 - 1,04) >0,05 eGFR 0,84 (0,27 – 2,66) >0,05 Gen 0,98 (0,44 – 2,20) >0,05 Giá trị p nhận từ phân tích hồi quy tuyến tính đa biến logistic regression Bảng B Mối tương quan gen MTHFR C677T với kiểm soát HbA1c máu bệnh nhân ĐTĐ type phân tích tương quan đa biến Yếu tố liên quan OR (95%CI) p Tuổi (năm) 1,,02 (0,97 - 1,07) Kiểm soát BMI 1,01 (0,91 - 2,47) >0,05 >0,05 Đường Uống dùng Uống + tiêm 1,61 (0,48 – 5,43) >0,05 thuốc Tiêm 9,29 (2,35 - 36,71) 0,05 Kiểm soát lipid 0,74 (0,28 – 1,92) >0,05 Kiểm soát huyết áp 0,67 (0,29 - 1,56) >0,05 eGFR 0,36 (0,10 – 1,38) >0,05 Gen 1,45 (0,58 – 3,60) >0,05 Giá trị p nhận từ phân tích hồi quy tuyến tính đa biến logistic regression ... gen MTHFR C677T với số biến chứng bệnh nhân đái tháo đường type 2 với hai mục tiêu: Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T bệnh nhân ĐTĐ type 2 Xác định mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR. .. nhận thấy tỷ lệ gen MTHFR 677TT bệnh nhân có biến chứng võng mạc đái tháo đường cao kiểu gen lại [71] Nghiên cứu Vlad Shpichinetsky kết luận đa hình gen MTHFR C677T có mối liên quan với phát triển... cộng gen MTHFR yếu tố nguy quan trọng bệnh lý mạch máu [70] Khi nghiên cứu 156 bệnh nhân đái tháo đường type 2, Makiko Maeda tần số mang gen MTHFR 677CT 40%, đồng thời xác định mối liên quan đa hình