BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUN MƠ PHỎNG TRÊN MÁY TÍNH VÀ KHẢO SÁT MẠNG LƯỚI TRAO ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS NATTO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUN 1401111 MƠ PHỎNG TRÊN MÁY TÍNH VÀ KHẢO SÁT MẠNG LƯỚI TRAO ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS NATTO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đỗ Ngọc Quang Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh – Sinh học HÀ NỘI - 2019 Lời cảm ơn Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp trước hết em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt thầy cô môn Vi sinh Sinh học tạo điều kiện, giúp đỡ cho em để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy Đỗ Ngọc Quang Thầy người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tạo cho em điều kiện tốt để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Sự nhiệt huyết, lòng đam mê yêu nghề thầy nguồn động lực để em phấn đấu để làm việc cống hiến Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln đồng hành bên em lúc khó khăn, bận rộn để em hồn thành khố luận tốt nghiệp Trong q trình tham gia khóa luận tốt nghiệp mơn khó tránh khỏi sai sót, em mong thầy, bỏ qua Đồng thời trình độ hạn chế nên báo cáo khóa luận tốt nghiệp khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy, để em hồn thành tốt báo cáo tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Duyên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Bacillus subtilis natto 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Ứng dụng .3 1.1.2.1 Acid Poly-γ-Glutamic (γ-PGA) 1.1.2.2 Nattokinase 1.1.2.3 Acid Dipicolinic (DPA, acid 2,6-pyridinedicarboxylic) 1.2 Mơ hình hóa q trình trao đổi chất máy tính 1.2.1 Nguyên lý trao đổi chất 1.2.1.1 Sự chuyển hóa 1.2.1.2 Con đường chuyển hóa 1.2.1.3 Các dạng lượng để vận hành trình trao đổi chất 1.2.2 Phương pháp Constraint-Based Modeling 10 1.2.2.1 Giới thiệu Constraint-Based Modeling 10 1.2.2.2 Đặc điểm Constraint-Based Modeling 11 1.2.2.3 Biểu diễn trình trao đổi chất dạng mơ hình tốn học 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu 17 2.2 Nội dung 17 2.2.1 Xây dựng mơ hình 17 2.2.2 Đánh giá độ tin cậy khảo sát số đặc điểm mơ hình 18 2.2.2.1 Khả tạo sinh khối mơ hình điều kiện hiếu khí kỵ khí 18 2.2.2.2 Khả sinh tổng hợp L-glutamat mơ hình từ nguồn carbon khác 18 2.2.2.3 Khảo sát thông lượng trình sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose sucrose 18 2.3 Phương pháp 18 2.3.1 Xây dựng sở liệu 18 2.3.1.1 Cơ sở liệu KEGG_ BS 18 2.3.1.2 Cơ sở liệu KEGG_RXN KEGG_MET 19 2.3.2 Xây dựng mơ hình .19 2.3.2.1 Tạo chất trao đổi 19 2.3.2.1 Tạo phản ứng 21 2.3.2.1 Tạo mơ hình 22 2.3.3 Phân tích thơng lượng mơ hình 22 2.3.4 Mô hoạt động mơ hình điều kiện mơi trường khác .23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Xây dựng mơ hình 25 3.1.1 Xây dựng sở liệu 25 3.1.2 Xây dựng mơ hình sơ .26 3.1.3.1 Bổ sung phản ứng thiếu 28 3.1.3.2 Điều chỉnh chiều phản ứng 29 3.1.3.3 Tạo phản ứng trao đổi với môi trường 30 3.1.3.4 Tạo chuỗi phản ứng hô hấp sinh ATP 31 3.1.3.5 Tạo phản ứng tạo sinh khối 32 3.2 Đánh giá độ tin cậy khảo sát số đặc điểm mơ hình 32 3.2.1 Khả tạo sinh khối mô hình điều kiện hiếu khí kỵ khí 32 3.2.2 Khả sinh tổng hợp L-glutamat mơ hình từ nguồn carbon khác .34 3.2.3 Khảo sát thơng lượng q trình sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose sucrose 35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục Phụ lục Phụ lục DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT γ-PGA Poly-γ-glutamic acid Acid Poly-γ-Glutamic TCA Tricarboxylic acid cycle Chu trình Acid tricarboxylic PG-TXL PGA-paclitaxel Liên hợp PGA-paclitaxel tPA Tissue Plasminogen Activator Chất kích hoạt plasminogen mơ DPA 2,6-pyridinedicarboxylic acid Acid dipicolinic (acid pyridinedicarboxylic) ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic ARN Ribonucleic Acid Acid ribonucleic ATP Adenosin triphosphate Adenosin triphosphat NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide KEGG 2,6- Nicotinamid adenin dinucleotid Kyoto Encyclopedia of Genes and Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes and Genomes EC Enzyme Commission Enzyme Commission CBM Mơ hình Constrant-Based Mơ hình Constrant-Based COBRA COnstraint-Based Reconstruction COnstraint-Based Reconstruction and Analysis and Analysis COnstraint-Based Reconstruction COnstraint-Based Reconstruction and Analysis for Python and Analysis cho Python FBA Flux Balance Analysis Flux Balance Analysis BIGG BIochemical, Genetic and BIochemical, Genetic and Genomic Genomic COBRApy DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Ví dụ thơng tin dạng mã hóa chuỗi đường phân bso00010, gen BSNT_10368, phản ứng R01070 25 Bảng 3.2 Thành phần tế bào B subtilis từ nuôi cấy liên tục điều kiện hiếu khí cung cấp thêm glucose 32 Bảng 3.3 Thành phần môi trường thử nghiệm 33 Bảng 3.4 Kết thông lượng tạo L-glutamat mô hình BS195 hiệu suất sinh tổng hợp -PGA thực nghiệm 35 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp γ-PGA theo đường nối tiếp Hình 1.2 Q trình phát triển mơ hình cân hóa học quy mô gen sinh vật khác (trước năm 2008) 11 Hình 1.3 Xây dựng ma trận cân hóa học cho mơ hình mạng chuyển hóa mơ hình 13 Hình 1.4 Hệ phương trình tuyến tính tồn ma trận S mơ tả nồng độ chất chuyển hóa trạng thái ổn định 13 Hình 1.5 Các bước thực FBA 15 Hình1 Một số ứng dụng FBA 16 Hình 2.1 Các bước xây dựng mơ hình trao đổi chất sinh vật 17 Hình 3.1 Ví dụ phần mạng trao đổi chất B subtilis natto BEST195 dạng ma trận 27 Hình 3.2 Con đường chuyển hóa Histidine B subtilis natto BEST 195 27 Hình 3.3 Con đường sinh tổng hợp valin, leucin isoleucin B subtilis natto BEST195 [12] 29 Hình 3.4 Chiều phản ứng khác sở liệu 30 Hình 3.5 Chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa B subtilis natto BEST195 31 Hình 3.6 Kết thơng lượng tạo sinh khối mơ hình BS195 điều kiện hiếu khí (A) kỵ khí (B) 34 Hình 3.7 Kết sản phẩm L-glutamat môi trường 35 Hình 3.8 Con đường tổng hợp L-glutamat từ maltose B subtilis natto 36 Hình 3.9 Con đường tổng hợp L-glutamat từ sucrose B subtilis natto 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Bacillus subtilis sinh vật nghiên cứu rộng rãi sản xuất coi vi khuẩn có đặc tính tốt thứ hai sau Escherichia coli [14] B subtilis lựa chọn để sản xuất số sản phẩm công nghiệp quan trọng, bao gồm enzym, nucleosid, vitamin, kháng sinh… Bacillus subtilis natto BEST195 vi khuẩn điển hình lồi Bacillus subtilis có khả tổng hợp nhiều sản phẩm có tính ứng dụng cao: nattokinase điều trị bệnh tim mạch, huyết khối [4] [19]; acid dipicolinic có tác dụng kháng khuẩn[27] [30] [32]; acid polygamaglutamic ứng dụng phẫu thuật, nghiên cứu khoa học [10] [20] [24] [35] Trao đổi chất mạng lưới phức tạp phản ứng với nhiều yếu tố phụ thuộc lẫn Mơ hình hóa cơng cụ hữu hiệu để nghiên cứu trình trao đổi chất sinh vật, giúp thu ngắn thời gian chi phí cho nghiên cứu thực nghiệm Các nghiên cứu mơ hình hóa trao đổi chất tiến hành 30 năm với 50 mơ hình trao đổi chất sinh vật công bố [28] Hiện nay, liệu đặc điểm sinh học sinh vật gen, đường trao đổi chất, … ngày đa dạng Các sử liệu với phá triển công cụ tin học giúp cho việc mơ hình hóa trao đổi chất thực nhanh chóng với độ tin cậy cao [5] Để góp phần tạo nên cơng cụ nghiên cứu từ ứng dụng sản xuất, định thực đề tài nghiên cứu: “Mơ máy tính khảo sát mạng lưới trao đổi chất vi khuẩn Bacillus subtilis natto.” với hai mục tiêu: - Bước đầu xây dựng mô hình trao đổi chất Bacillus subtilis natto BEST195 máy tính -Sử dụng mơ hình để khảo sát số đặc điểm trao đổi chất liên quan đến sinh tổng hợp L-glutamat CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Bacillus subtilis natto 1.1.1 Đặc điểm sinh học Bacillus subtilis loại trực khuẩn gram dương Các tế bào B subtilis thường dài khoảng 4-10 mcm đường kính 0,25 mcm, với thể tích tế bào khoảng 4,6 fL pha tĩnh [26] Giống thành viên khác chi, hình thành bào tử, để tồn điều kiện môi trường khắc nghiệt nhiệt độ độ ẩm cao Trước năm 1998, B subtilis coi vi khuẩn ưa khí bắt buộc, sau có chứng lồi kỵ khí tùy tiện [18] B subtilis sử dụng rộng rãi cho nghiên cứu phòng thí nghiệm, đặc biệt bào tử, ví dụ đơn giản biệt hóa tế bào [31] B subtilis thường tìm thấy lớp đất (khoảng 106 bào tử gram), rễ có hệ tiêu hóa người, động vật (khoảng 104 bào tử gram phân người) Có chứng cho thấy thơng qua cộng sinh B subtilis thúc đẩy tăng trưởng thực vật [16] Có thể giải thích cho việc thúc đẩy tăng trưởng là: (i) B subtilis cạnh tranh với vi khuẩn khác ảnh hưởng xấu đến trồng, (ii) B subtilis kích hoạt hệ thống phòng thủ vật chủ để sẵn sàng chống lại mầm bệnh tiềm tàng và, (iii) B subtilis sinh số chất dinh dưỡng cần thiết cho (ví dụ phốt nitơ) [16] B subtilis phân chia đối xứng để tạo hai tế bào (phân hạch nhị phân) không đối xứng, tạo bào tử tồn nhiều thập kỷ chịu điều kiện môi trường bất lợi hạn hán, nhiễm mặn, pH cao, xạ Các bào tử hình thành thời điểm bất lợi dinh dưỡng thông qua việc sử dụng sản phẩm thủy phân, cho phép vi khuẩn tồn môi trường điều kiện trở nên thuận lợi Trước trình sinh bào tử, tế bào trở nên linh hoạt nhờ roi mọc bề mặt, lấy DNA từ môi trường sản xuất kháng sinh Những phản ứng xem nỗ lực tìm kiếm chất dinh dưỡng cách tìm kiếm mơi trường thuận lợi hơn, cho phép tế bào sử dụng vật liệu di truyền có lợi đơn giản cách tiêu diệt cạnh tranh Để đánh giá khả hoạt động mơ hình, chúng tơi tiến hành cung cấp cho mơ hình BS195 số thành phần dinh dưỡng tương tự thực nghiệm (Bảng 3) thiết lập mục tiêu hàm tối ưu hóa tạo thơng lượng tối đa cho phản ứng bio1 (phản ứng sinh khối) Đối với điều kiện hiếu khí, mơ hình cung cấp mơi trường CM1, điều kiện kỵ khí, oxy mơi trường thay nicotinat để đảm bảo mơ hình hoạt động Bảng 3.2 Thành phần môi trường thử nghiệm Môi trường Thành phần CM1 CM2 CM3 CM4 C00001 - H2O x x x x C00009 - Pi x x x x C00080 - H+ x x x x C00059 - SO42- x x x x C00244 - NO3- x x x x C00305 - Mg2+ x x x x C00076 - Ca2+ x x x x C00238 - K+ x x x x C00007 - O2 x x x x C14818 - Fe2+ x x x x C14819 - Fe3+ x x x x C00221 - Glucose x C00208 - Maltose x C00089 - Sucrose x C00158 - Acid citric x Chúng tiến hành kiểm tra khả tạo sinh khối điều kiện hiếu khí kỵ khí Kết thơng lượng tối ưu phản ứng bio1 thể hình 13 33 Thơng lượng tạo sinh khối mơ hình BS195 điều kiện hiếu khí 0,898 điều kiện kị khí 0,225 Điều cho thấy có oxy, B subtilis natto tạo nhiều sinh khối khơng có oxy Kết phù hợp với đặc điểm trao đổi chất B subtilis natto kỵ khí tùy tiện phù hợp với kết nghiên cứu B subtilis công bố Shariat [29] B subtilis vi khuẩn kỵ khí tùy tiện nên có khả tạo sinh khối điều kiện có hay khơng có oxy Nhiên cưua Shariat cho thấy điều kiện có oxy, B subtilis có khả tạo sinh khối điều kiện có oxy gấp lần khả tạo sinh khối điều kiện khơng có oxy Hình 3.6 Kết thơng lượng tạo sinh khối mơ hình BS195 điều kiện hiếu khí (A) kỵ khí (B) 3.2.2 Khả sinh tổng hợp L-glutamat mơ hình từ nguồn carbon khác Sản xuất -PGA ứng dụng quan trọng Bacillus subtilis natto [17] Trong thí nghiệm này, chúng tơi đánh giá khả sinh tổng hợp -PGA mơ hình BS195 thơng qua khả sinh tổng hợp tiền chất -PGA L-glutamat Mơ hình BS195 đánh giá hoạt động bốn môi trường mô CM1, CM2, CM3, CM4 (Bảng 4) (Hình 14) cho kết tương tự nghiên cứu thực nghiệm của: Ogawa cộng [22], Ashiuchi cộng [2], Lee cộng [15] Kết cho thấy thông lượng phản ứng sinh tổng hợp L-glutamat mơ BS195 cao mơi trường CM2 chứa maltose, sau CM1 chứa glucose, CM4 chứa acid citric cuối CM3 chứa sucrose (Bảng 4) Các kết phù hợp với số liệu thực nghiệm ba nghiên cứu Ogawa, Ashiuchi Lee tiến hành [22], [2], [15] 34 Bảng 3.3 Kết thơng lượng tạo L-glutamat mơ hình BS195 hiệu suất sinh tổng hợp -PGA thực nghiệm Môi trường Thông lượng tạo L-glutamat mô Hiệu suất sinh tổng hợp hình BS195 (mmol/g sinh khối/h) PGA thực nghiệm CM1 (Glucose) 20.9 25 mg/ml [22] CM2 (Maltose) 35.2 35 mg/ml [22] CM3 (Sucrose) 16.9 13.5 mg/ml [2] CM4 (Acid citric) 18.7 15 mg/ml [15] Hình 3.7 Kết sản phẩm L-glutamat môi trường Môi trường CM1 (A), môi trường CM2 (B), môi trường CM3 (D), môi trường CM4 (C) 3.2.3 Khảo sát thơng lượng q trình sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose sucrose Chúng tiến hành khảo sát thơng lượng q trình sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose sucrose mơ hình BS195 Các tham số thiết lập để tối ưu hóa thơng lượng cho sinh tổng hợp L-glutamat Chuỗi phản ứng tối ưu để tổng hợp L-glutamat từ maltose sucrose thể hình 15 hình 16 Với hai nguồn đường, đường tối ưu để sinh tổng hợp L-glutamat qua chuỗi đường phân chu trình Krebs, phần 2-Oxoglutarat chu trình Krebs chuyển hóa thành L-glutamat Chuỗi chuyển hóa tối ưu tương tự quan sát thấy nghiên cứu thực nghiệm 35 công bố Najar [20] Kết tối ưu cho thấy thơng lượng q trình sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose có giá trị gấp khoảng lần so với sucrose Như mơ hình BS195 bước đầu cho thấy có độ tin cậy để sử dụng cho nghiên cứu trao đổi chất Bacillus subtilis natto BEST195 Hình 3.8 Con đường tổng hợp L-glutamat từ maltose B subtilis natto Hình 3.9 Con đường tổng hợp L-glutamat từ sucrose B subtilis natto 36 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Trong nghiên cứu đạt kết sau: Mục tiêu 1: - Đã bước đầu xây dựng mô hình trao đổi chất mơ Bacillus subtilis natto BEST195 Mục tiêu 2: - Đã mơ q trình tạo sinh khối mơ hình với nguồn carbon maltose glucose - Đã mơ q trình sinh tổng hợp L-glutamat mơ hình từ nguồn carbon glucose, maltose, sucrose, acid citrat - Đã sử dụng mơ hình để xác định chuỗi phản ứng tối ưu cho sinh tổng hợp L-glutamat từ maltose sucrose 4.2 Đề xuất Từ kết nghiên cứu, xin đưa số đề xuất sau: - Sử dụng thêm nhiều công cụ khác tối ưu để xây dựng tinh chỉnh hồn thiện mơ hình mạng trao đổi chất Bacillus subtilis natto - Tiến hành đánh giá độ tin cậy mơ hình sản phẩm khác Bacillus subtilis natto tổng hợp: nattokinase 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 17 A Bordbar, M Monk J., et al (2014), "Constraint-based models predict metabolic and associated cellular functions", Nature Reviews Genetics, 15(2), pp 107 Ashiuchi M, Kamei T, et al (2001), "Isolation of Bacillus subtilis (chungkookjang), a poly-γ-glutamate producer with high genetic competence", Applied microbiology and biotechnology, 57(5-6), pp 764-769 Boyle Nanette R, Morgan John A (2009), "Flux balance analysis of primary metabolism in Chlamydomonas reinhardtii", BMC systems biology, 3(1), pp C Irajie, M Mohkam, et al (2017), "In silico analysis of Nattokinase from Bacillus subtilis sp natto", Int J Pharm Clin Res, 9(4), pp 286-92 Ebrahim Ali, Lerman Joshua A, et al (2013), "COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python", BMC systems biology, 7(1), pp 74 Fell David A, Small J Rankin (1986), "Fat synthesis in adipose tissue An examination of stoichiometric constraints", Biochemical Journal, 238(3), pp 781786 H Sumi, H Hamada, et al (1990), "Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinases", Acta haematologica, 84(3), pp 139143 H Sumi, S Ikeda, et al (2009), "Increasing the production of nattokinase and vitamin k2 in natto with dipicolinic acid", The Open Food Science Journal, 3, pp 10614 I Thiele, Ø Palsson B (2010), "A protocol for generating a high-quality genomescale metabolic reconstruction", Nature protocols, 5(1), pp 93 Ishwar Bajaj, Rekha Singhal (2011), "Poly (glutamic acid)-an emerging biopolymer of commercial interest", Bioresource Technology, 102(10), pp 5551-5561 K Raman, N Chandra (2009), "Flux balance analysis of biological systems: applications and challenges", Briefings in bioinformatics, 10(4), pp 435-449 Kanehisa Minoru, Goto Susumu (2000), "KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes", Nucleic acids research, 28(1), pp 27-30 Kremling Andreas (2013), Systems biology: mathematical modeling and model analysis, Chapman and Hall/CRC L Sonenshein A., A Hoch J., et al (2002), "Bacillus subtilis: from cells to genes and from genes to cells", Bacillus subtilis and its Closest Relatives American Society of Microbiology, pp 3-5 Lee Sang-Yup, Chang Ho-Nam, et al., Method for manufacturing highlyconcentrated polyglutamic acid with additional supply of saccharides 2006, Google Patents M Cazorla F., D Romero, et al (2007), "Isolation and characterization of antagonistic Bacillus subtilis strains from the avocado rhizoplane displaying biocontrol activity", Journal of applied microbiology, 103(5), pp 1950-1959 M Kamada, S Hase, et al (2014), "Whole genome complete resequencing of Bacillus subtilis natto by combining long reads with high-quality short reads", PloS one, 9(10), pp e109999 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 M Nakano M., P Zuber (1998), "Anaerobic growth of a “strict aerobe”(Bacillus subtilis)", Annual Reviews in Microbiology, 52(1), pp 165-190 Meruvu Haritha, Vangalapati Meena (2011), "International Journal of Chemical, Environmental and", Pharmaceutical Research, 2(1), pp 61-66 N Najar I., S Das (2015), "Poly-glutamic acid (PGA)-Structure, synthesis, genomic organization and its application: A Review", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 6(6), pp 2258 Norsigian Charles J, Kavvas Erol, et al (2018), "iCN718, an updated and improved genome-scale metabolic network reconstruction of Acinetobacter baumannii AYE", Frontiers in genetics, 9, pp 121 Ogawa Yoshihiro, Yamaguchi Fumio, et al (1997), "Efficient production of γpolyglutamic acid by Bacillus subtilis (natto) in jar fermenters", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 61(10), pp 1684-1687 Oh You-Kwan, Palsson Bernhard O, et al (2007), "Genome-scale reconstruction of metabolic network in Bacillus subtilis based on high-throughput phenotyping and gene essentiality data", Journal of Biological Chemistry, 282(39), pp 28791-28799 R Bhat A., U Irorere V., et al (2013), "Bacillus subtilis natto: a non-toxic source of poly-γ-glutamic acid that could be used as a cryoprotectant for probiotic bacteria", Amb Express, 3(1), pp 36 Rich PR, The molecular machinery of Keilin's respiratory chain 2003, Portland Press Limited S Allen C., F Loo J., et al (2014), "Monitoring bacterial growth using tunable resistive pulse sensing with a pore-based technique", Applied microbiology and biotechnology, 98(2), pp 855-862 S Udo (1936), "Chemical constituents of Natto, fermented soybeans I The occurrence of dipicolinic acid in natto and its behavior on micro ovrddot organisms", J Agr Chem Soc Japan, 12, pp 386-94 Schellenberger Jan, Park Junyoung O, et al (2010), "BiGG: a Biochemical Genetic and Genomic knowledgebase of large scale metabolic reconstructions", BMC bioinformatics, 11(1), pp 213 Shariat Parvin, Mitchell Wilfrid J, et al (1995), "Anaerobic metabolism in Bacillus licheniformis NCIB 6346", Microbiology, 141(5), pp 1117-1124 Sumi H (1999), "Dipicolinic acid, an antibacterial component contained in natto and in Bacillus subtilis natto", J Soc Biosci Biotech Agri., 73, pp 1289-1291 T Irene S., R Kumaran S (2014), "Spore formation in Bacillus subtilis", Environ Microbiol Rep, 6(3), pp 212–225 T Ohsugi, H Sumi (2011), "The effects of dipicolinic acid on the thrombolytic activity of human cells", Journal of Food Biochemistry, 35(2), pp 370-380 U Kim H., Y Kim T., et al (2008), "Metabolic flux analysis and metabolic engineering of microorganisms", Molecular BioSystems, 4(2), pp 113-120 W Singer J (2005), "Paclitaxel poliglumex (XYOTAX™, CT-2103): a macromolecular taxane", Journal of controlled release, 109(1-3), pp 120-126 Y Otani, Y Tabata, et al (1999), "Sealing effect of rapidly curable gelatin-poly (Lglutamic acid) hydrogel glue on lung air leak", The Annals of thoracic surgery, 67(4), pp 922-926 36 Y Yang, A Sauve A (2016), "NAD+ metabolism: Bioenergetics, signaling and manipulation for therapy", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1864(12), pp 1787-1800 PHỤ LỤC Phụ lục Danh mục đường trao đổi chất Bacillus subtilis natto BEST195 Mã bso00010 bso00020 bso00030 bso00040 bso00051 bso00052 bso00053 bso00061 bso00071 bso00072 bso00121 bso00130 bso00190 bso00220 bso00230 bso00240 bso00250 bso00260 bso00261 bso00270 bso00280 bso00281 bso00290 bso00300 bso00310 bso00330 bso00332 bso00340 bso00350 bso00360 bso00361 bso00362 bso00380 bso00400 bso00401 bso00410 bso00430 bso00440 Con đường trao đổi chất Glycolysis / Gluconeogenesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Citrate cycle (TCA cycle) - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Pentose phosphate pathway - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Pentose and glucuronate interconversions - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Fructose and mannose metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Galactose metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Ascorbate and aldarate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Fatty acid biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Fatty acid degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Synthesis and degradation of ketone bodies - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Secondary bile acid biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Oxidative phosphorylation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Arginine biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Purine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Pyrimidine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Alanine, aspartate and glutamate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Glycine, serine and threonine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Monobactam biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Cysteine and methionine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Valine, leucine and isoleucine degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Geraniol degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Valine, leucine and isoleucine biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Lysine biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Lysine degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Arginine and proline metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Carbapenem biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Histidine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Tyrosine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Phenylalanine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Benzoate degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Tryptophan metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis - Bacillus subtilis subsp Natto BEST195 Novobiocin biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 beta-Alanine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Taurine and hypotaurine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Phosphonate and phosphinate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 bso00450 bso00460 bso00471 bso00472 bso00473 bso00480 bso00500 bso00511 bso00520 bso00521 bso00523 bso00525 bso00550 bso00561 bso00562 bso00564 bso00590 bso00592 bso00600 bso00620 bso00622 bso00625 bso00626 bso00627 bso00630 bso00640 bso00650 bso00660 bso00670 bso00680 bso00730 bso00740 bso00750 bso00760 bso00770 bso00780 bso00785 bso00790 bso00860 bso00900 bso00906 bso00910 bso00920 bso00970 bso00999 bso01053 bso01054 bso01100 bso01110 bso01120 bso01130 Selenocompound metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Cyanoamino acid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 D-Glutamine and D-glutamate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 D-Arginine and D-ornithine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 D-Alanine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Glutathione metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Starch and sucrose metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Other glycan degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Amino sugar and nucleotide sugar metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Streptomycin biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Polyketide sugar unit biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Acarbose and validamycin biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Peptidoglycan biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Glycerolipid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Inositol phosphate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Glycerophospholipid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Arachidonic acid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 alpha-Linolenic acid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Sphingolipid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Pyruvate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Xylene degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Chloroalkane and chloroalkene degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Naphthalene degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Aminobenzoate degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Propanoate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Butanoate metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 C5-Branched dibasic acid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 One carbon pool by folate - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Methane metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Thiamine metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Riboflavin metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Vitamin B6 metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Nicotinate and nicotinamide metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Pantothenate and CoA biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Biotin metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Lipoic acid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Folate biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Porphyrin and chlorophyll metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Terpenoid backbone biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Carotenoid biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Nitrogen metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Sulfur metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Aminoacyl-tRNA biosynthesis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Biosynthesis of secondary metabolites - unclassified - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Biosynthesis of siderophore group nonribosomal peptides - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Nonribosomal peptide structures - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Metabolic pathways - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Biosynthesis of secondary metabolites - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Microbial metabolism in diverse environments - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Biosynthesis of antibiotics - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 bso01200 bso01210 bso01212 bso01220 bso01230 bso01501 bso01502 bso01503 bso02010 bso02020 bso02024 bso02030 bso02040 bso02060 bso03010 bso03018 bso03020 bso03030 bso03060 bso03070 bso03410 bso03420 bso03430 bso03440 bso03450 bso04122 Carbon metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 2-Oxocarboxylic acid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Fatty acid metabolism - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Degradation of aromatic compounds - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Biosynthesis of amino acids - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 beta-Lactam resistance - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Vancomycin resistance - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Cationic antimicrobial peptide (CAMP) resistance - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 ABC transporters - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Two-component system - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Quorum sensing - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Bacterial chemotaxis - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Flagellar assembly - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Phosphotransferase system (PTS) - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Ribosome - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 RNA degradation - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 RNA polymerase - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 DNA replication - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Protein export - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Bacterial secretion system - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Base excision repair - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Nucleotide excision repair - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Mismatch repair - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Homologous recombination - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Non-homologous end-joining - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Sulfur relay system - Bacillus subtilis subsp natto BEST195 Phụ lục Phản ứng sinh khối Bacillus subtilis Marburg 168: 408.3 mol glycine + 266.9 mol L-alanine + 306.7 mol L-valine + 346.4 mol L-leucine + 269.9 mol L-isoleucine + 216.2 mol L-serine + 186.3 mol L-threonine + 175.9 mol L-phenylalanine + 110.8 mol L-tyrosine + 54.3 mol L-tryptophan + 56.7 mol L-cysteine + 113.3 mol Lmethionine + 323.1 mol L-lysine + 193.0 mol L-arginine + 81.7 mol L-histidine + 148.0 mol L-aspartate + 260.4 mol L-glutamate + 148.0 mol L-asparagine + 260.3 mol L-glutamine + 160.6 mol L-proline + 62.7 mol GTP + 38.9 mol CTP + 41.5 mol UTP + 23.0 mol dATP + 17.4 mol dGTP + 17.4 mol dCTP + 22.9 mol dTTP + 0.085750 mol monoglucosyldiacylglycerol + 0.110292 mol diglucosyldiacylglycerol + 0.065833 mol triglucosyldiacylglycerol + 0.004642 mol cardiolipin + 0.175859 mol phosphatidylglycerol + 0.022057 mol lysylphosphatidylglycerol + 0.559509 mol phosphatidylethanolmaine + 0.006837 mol lipoteichoic acid (n=24, linked, glucose substituted) + 0.006123 mol lipoteichoic acid (n=24, linked, N-acetyl-D-glucosamine) + 0.018162 mol lipoteichoic acid (n=24, linked, D-alanine substituted) + 0.014676 mol lipoteichoic acid (n=24, linked, unsubstituted) + 101.82 mol peptidoglycan subunit + 3.62 mol glycerol teichoic acid (n=45, unlinked, unsubstituted) + 2.35 mol glycerol teichoic acid (n=45, unlinked, D-ala substituted) + 1.82 mol glycerol teichoic acid (n=45, unlinked, glucose substituted) + mol 3.11 minor teichoic acid (acetylgalactosamine glucose phosphate, n=30) + 706.3 mol K + 101.7 mol Mg + 3.4 mol Fe(+3) + 3.2 mol Ca + 0.9 mol diphosphate + 0.3 mol menaquinol + 0.4 mol 10-formyltetrahydrofolate + 16.2 mol NAD + 4.7 mol AMP + 2.6 mol ADP + 1.0 mol CMP + 0.9 mol NADP + 0.5 mol CTP + 0.5 mol GMP + 0.4 mol GTP + 0.3 mol CDP + 0.2 mol NADPH + 0.2 mol GDP + 105053.5 mol ATP + 105000 mol H2O → 104985.6 mol phosphate + 104997.4 mol ADP + 105000 mol H+ + mg biomass Phụ lục Một phần mơ hình mạng lưới trao đổi chất Bacillus subtilis natto BEST195 dạng ma trận C17962_c0 C00149_c0 C05751_c0 C05796_c0 C05757_c0 C03114_c0 C00235_c0 C01081_c0 C00327_c0 C05822_c0 C00031_c0 C00492_c0 C00344_c0 C00857_c0 C02745_c0 C00051_c0 C00179_c0 C00794_c0 C00682_c0 C00681_c0 C02355_c0 C00262_c0 C16255_c0 C04462_c0 C04895_c0 C00250_c0 C02291_c0 C11537_c0 C00054_c0 C00053_c0 C06612_c0 C03492_c0 R04956_c0R04993_c0R07599_c0R00442_c0R08210_c0R00519_c0R01179_c0R01283_c0R03012_c0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 R01332_c0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ... vi khuẩn sinh học cần thi t giai đoạn sản xuất thực phẩm dược phẩm B subtilis natto nghiên cứu chứng minh sản xuất γ-PGA khơng sinh độc tố khơng có dấu hiệu gây tan máu lecithinase [24] Do đó,... nitơ bốn yếu tố cần thi t cho việc sản xuất thành phần hóa học tế bào Chúng nguyên liệu để tạo nên tất đại phân tử ADN ARN, protein, lipid polysacarid Các yếu tố khác cần thi t, với số lượng... trình trao đổi chất 1.2.2 Phương pháp Constraint-Based Modeling 10 1.2.2.1 Giới thi u Constraint-Based Modeling 10 1.2.2.2 Đặc điểm Constraint-Based Modeling 11