BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG MSV : 1401118 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA ANGIOTENSIN IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU TIỀM NĂNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG MSV : 1401118 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA ANGIOTENSIN IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU TIỀM NĂNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : TS Lê Thị Xoan TS Hà Vân Oanh Nơi thực : Khoa Dược lí -Hóa sinh - Viện dược liệu Khoa Hóa thực vật – Viện dược liệu KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 LỜI CÁM ƠN Để hồn thành khóa luận này, nhận giúp đỡ vô quý giá từ thầy cô bạn bè Trước tiên, xin bày tỏ lời cám ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Xoan, TS Hà Vân Oanh, ThS Phí Thị Xuyến – người quan tâm, bảo, giúp đỡ, hướng dẫn tận tình tơi suốt q trình làm hồn thành đề tài Tôi xin cám ơn Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền thầy cô, anh chị động viên, hỗ trợ q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cám ơn TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, CN Phạm Thanh Huyền, TS Nguyễn Văn Tài, KTV Nguyễn Thị Huyền Phương anh chị khoa Dược lí – Hóa sinh, khoa Tài nguyên, khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu tạo điều kiện, hỗ trợ tơi q trình thực nghiên cứu Viện Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo tồn thể thầy cô giáo, cán trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho học tập tích lũy kiến thức suốt năm học vừa qua Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, thầy cơ, quỹ học bổng VietSeeds sát cánh, động viên hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Dương MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC Danh sách chữ viết tắt kí hiệu Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .3 1.1 Tăng huyết áp chế sinh lí bệnh tăng huyết áp 1.1.1 Tăng huyết áp 1.1.2 Cơ chế sinh lí bệnh tăng huyết áp 1.2 Enzym chuyển angiotensin .5 1.2.1 Cấu trúc hóa học ACE thể người 1.2.2 Đặc tính ACE 1.2.3 Vai trò ACE điều hòa huyết áp 1.3 Một số phương pháp xác định tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin in vitro 1.3.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại 1.3.2 Phương pháp quan phổ khả kiến (VSP) 1.3.3 Phương pháp HPLC 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động ACE thí nghiệm ức chế ACE in vitro 1.4 Các nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng hạ huyết áp thông qua ức chế enzym chuyển angiotensin 10 1.4.1 Các hướng nghiên cứu giới 10 1.4.2 Tình hình Việt Nam 13 1.5 Các dược liệu tiềm điều trị tăng huyết áp 14 CHƯƠNG HAI: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu – thiết bị .18 2.1.1 Mẫu nghiên cứu: 18 2.1.2 Thuốc, hóa chất 18 2.1.3 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Chuẩn bị cao chiết .20 2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin cao dược liệu 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Kết 28 3.1.1 Khối lượng cao dược liệu thu 28 3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng DMSO lên hoạt động ACE .30 3.1.3 Kết sàng lọc tác dụng ức chế ACE in vitro mẫu dược liệu 30 3.1.4 3.2 Kết xác định IC50 mẫu dược liệu tiềm .33 Bàn luận 34 3.2.1 Bàn luận kết thí nghiệm 34 3.2.2 Về thao tác quy trình thí nghiệm 41 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ .42 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Danh sách chữ viết tắt kí hiệu ACE Angiotensin I – converting enzym AngI Angiotensin I AngII Angiotensin II BSC Benzenesulfonyl cloride BuOH Butanol DCM Diclomethan DMSO Dimethyl sulfoxide EtAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HA Hippuric axit Hex Hexan HHL N-Hippuryl-His-Leu hydrate HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao MeOH Methanol THA Tăng huyết áp RA Hệ Renin-Angiotensin VSP Quang phổ khả kiến UV Tử ngoại (Ultraviolet) Danh mục bảng Bảng 2.1: Thông tin mẫu nghiên cứu 18 Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm 24 Bảng 3.1: Chuẩn bị mẫu cao chiết .28 Bảng 3.2: Ảnh hưởng dung môi DMSO lên tác dụng ức chế ACE .30 Bảng 3.3: Kết ức chế ACE 51 mẫu cao nồng độ 100 µg/ml 50 µg/ml .30 Bảng 3.4: IC50 chất đối chiếu captopril .33 Bảng 3.5: IC50 lược vàng cao nước .33 Danh mục hình Hình 1.1: Phản ứng thủy phân Angiotensinogen thành AngI, AngII [21] Hình 1.2: Vai trò ACE điều hòa huyết áp [39] .7 Hình 2.1: Hệ thống đo ELISA 96 giếng - EL x808 Biotek 20 Hình 2.2: Sơ đồ chiết cao tổng dược liệu 21 Hình 2.3: Sơ đồ chiết cao phân đoạn 22 Hình 2.4: Cơ chế phản ứng thủy phân HHL ACE [16] 23 Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế ACE 26 ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng huyết áp (THA) yếu tố nguy dẫn tới bệnh tim mạch Hầu hết bệnh nhân THA cần điều trị thuốc hạ áp với thay đổi lối sống để đạt hiệu kiểm sốt tối ưu [1], [7] Enzym chuyển hóa Angiotensin (ACE) chiếm vai trò sinh lí quan trọng điều hòa huyết áp Đã có số chất ức chế ACE tổng hợp captopril, lisinopril, enalapril fosinpril sử dụng thuốc điều trị THA Tuy nhiên, thuốc gây số tác dụng phụ đáng kể ho, rối loạn vị giác, phát ban Vì vậy, việc tìm kiếm nguồn thuốc với tác dụng điều trị tương đương, chí vượt trội hơn, đồng thời giảm tác dụng phụ hướng quan tâm Việc tìm kiếm dược chất làm thuốc từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên ln sách ưu tiên chiến lược phát triển ngành Dược nhiều quốc gia, có Việt Nam Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, y học cổ truyền lâu đời Do đó, khai thác nguồn tài nguyên sinh học từ nguồn dược liệu sử dụng theo kinh nghiệm nhân dân sàng lọc tác dụng dược lí cao chiết từ dược liệu hướng tiếp cận phát phát triển thuốc phục vụ cho điều trị [38] Trên giới có nhiều nghiên cứu đánh giá, sàng lọc tác dụng ức chế ACE in vitro cao chiết dược liệu chất/nhóm chất phân lập từ dược liệu [13], [15], [19], [44] Tại Việt Nam, nghiên cứu theo hướng hạn chế Các nghiên cứu bước đầu đánh giá tác dụng ức chế ACE từ chất phân lập từ dược liệu [6] Dựa nghiên cứu trước giới tác dụng ức chế enzym chuyển angiotensin, việc đánh giá lại đối tượng dược liệu trồng Việt Nam có ý nghĩa việc mở rộng mục đích sử dụng dược liệu Tổng quan tài liệu giúp lựa chọn dược liệu dựa hai tiêu chí: là, kinh nghiệm dân gian sử dụng dược liệu điều trị tăng huyết áp lợi tiểu; hai dựa nghiên cứu tác dụng ức chế ACE hạ áp dược liệu Qua đó, lựa chọn mẫu dược liệu đưa vào nghiên cứu bao gồm: sa kê, lược vàng, vỏ thân đỗ trọng, toàn cần tây, phận mặt đất dừa cạn, hồng, thân rễ gối hạc cành gối hạc Từ đó, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym chuyển hóa angiotensin in vitro số dược liệu tiềm Việt Nam” thực với mục tiêu cụ thể là: Đánh giá, sàng lọc tác dụng ức chế ACE in vitro mẫu cao chiết tổng phân đoạn dược liệu thu hái Việt Nam 36 chicoric, axit ferulic, quercetin kaempferol [39] Các nghiên cứu Việt Nam phân tích dịch chiết Hexan phân lập hỗn hợp triterpenoid, b-sitosterol, stigmasterol [8], dịch chiết diclometan ethyl acetat phân lập nhận dạng chất b-sitosterol, b-sitosterol 3-O-b-D-glucopyranosid hỗn hợp b-sitosterol 3O-b-D-glucopyranosid stigmasterol 3-O-b-D-glucopyranosid [5] IC50 số chất có lược vàng nghiên cứu trước ACE bao gồm: quercertin (43 µM), kaempferol (178 µM) [24], axit gallic (257,29 ± 9,39 μg / ml) [12], caffeic axit (0,11-0,14 mg/ml) [55] Dẫn chất axit ferulic feruloyl-Phe-Ala-Pro-OH cho thấy tác dụng ức chế ACE mạnh với giá trị IC50 =1.5 μM [57] Các hợp chất bsitosterol, stigmasterol chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế ACE Tuy nhiên, có chứng minh b-sitosterol có tác dụng cải thiện số số hóa sinh, bao gồm phục hồi chức gan thận động vật tăng huyết áp [58] Những nghiên cứu gợi ý rằng, thành phần có tác dụng ức chế ACE có lược vàng nêu đóng vai trò định tác dụng ức chế ACE cao chiết lược vàng  Gối hạc (Leea rubra) Lá, cành thân rễ Gối hạc (Leea rubra) cho thấy tác dụng ức chế ACE mạnh Ở nồng độ 100 µg/ml, 3/7 cao chiết lá, cành gối hạc 5/7 cao chiết thân rễ gối hạc cho thấy tác dụng ức chế 90%, 13/14 cao chiết hai cho thấy tác dụng ức chế 50% Ở nồng độ 50 µg/ml, tác dụng ức chế ACE phần lá, cành giảm rõ, hai phân đoạn EtAc BuOH đạt 50% Trong đó, phần thân rễ cho thấy tác dụng ức chế ACE mạnh Cao chiết nước, phân đoạn EtAc BuOH thân rễ gối hạc cho tác dụng ức chế hoàn toàn (100%), toàn cao ức chế ACE 50% Qua tìm hiểu, nghiên cứu tác dụng gối hạc (L.rubra) Braxin cho kết ức chế ACE cao chiết cồn phần mặt đất nồng độ 100 µg/ml đạt 57.0±12.5% [19], tương đồng với kết 66,67% nghiên cứu chúng tơi Một nghiên cứu phân tích thành phần cao chiết ethanol gối hạc thu hái Việt Nam phân lập thành phần bao gồm: axit gallic (1), axit 37 protocatechuic (2), axit 4-hydroxybenzoic (3), arctiin (4), kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranosid (5) [11] Giá trị IC50 ACE axit gallic (257,29 ± 9,39 μg / ml) [12], axit protocatechuic (một axit phenonic) không cho thấy tác dụng ức chế ACE in vitro [51] Kaempferol-3-O-α-L- rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranosid dẫn chất kaempferol – chất có tác dụng ức chế ACE, có mối liên quan tác dụng ức chế ACE Theo tìm hiểu, chưa có nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ gối hạc tác dụng ức chế ACE hay tăng huyết áp Tuy nhiên, nghiên cứu xác định thành phần hóa học từ dịch chiết rễ lồi chi Leea Leea thorelii, xác định hợp chất bao gồm: bergenin (1), 11O-acetyl bergenin (2), 11-O-(4′-O-methylgalloyl) bergenin (3), 3,5-dihydroxy-4methoxybenzoic axit (4), ( − )-epicatechin (5), 4″-O-methyl-( − )-epicatechin gallat (6), ( − )-epicatechin gallat (7), microminutinin (8) and stigmasterol Các chất (5), (6), (7) thuộc nhóm flavanol, nhóm chất cho thấy tác dụng ức chế ACE [24], [29] Hơn nữa, nghiên cứu cho thấy, so sánh tác dụng ức chế phân đoạn cao chiết, cao BuOH EtAc lá, cành thân rễ gối hạc cho thấy tác dụng ức chế ACE cao Qua đó, gọi ý thành phần flavon gối hạc đóng vai trò quan trọng khả ức chế ACE cao chiết gối hạc  Cần tây (Apium graveolens) Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết nước nóng, phân đoạn EtAc phần cắn nước thể tác dụng ức chế mạnh nồng độ 50 µg/ml, đạt 70% Khi tiến hành tiếp tục pha lỗng thử với nồng độ µg/ml 0,5 µg/ml cao chiết EtAc cho thấy tác dụng ức chế ACE tương ứng 94, 85% 53,19% (kết khơng bài) Trước đó, nghiên cứu A Simaratanamongkol cộng xác định dịch chiết methanol cần tây có tác dụng ức chế ACE với IC50 1,7 mg/ml Các chất phân lập phân đoạn methanol-nước sau bao gồm: junipediol A 8-O-β-dglucoside (1-β-d-glucosyloxy-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-propane-1,3-diol) (1), có tác dụng ức chế ACE mạnh với IC50 = 76 µg/ml chất khác isofraxidin-β- 38 d-glucoside (2), roseoside (3), apigenin-7-O-β-d-glucoside (4), luteolin-7-O-β-dglucoside (5), icariside D2 (6), apiin (7), chrysoeriol-7-O-β-d-apiosylglucoside (8), and 11,21-dioxo-3 β,15 α,24-trihydroxyurs-12-ene-24-O-β-d-glucopyranoside (9) xác định Các chất số hợp chất (2-6) phân lập từ phân đoạn với hợp chất (1) không cho thấy tác dụng ức chế ACE nồng độ 500 µM Tuy nhiên nghiên cứu cho thấy chúng có tác dụng cộng hợp làm tăng tác dụng ức chế ACE sử dụng hợp chất (1) từ 66% đến 81% tương ứng với nồng độ thêm vào 300 µg/ml hai dung dịch chứa (1) có nồng độ tương ứng 250 µM 500 µM [46] Khi so sánh khả ức chế ACE mạnh cao chiết cần tây thực nghiên cứu (đặc biệt phân đoạn EtAc) với kết ức chế ACE cao chiết methanol chất phân lập từ mẫu cần tây nghiên cứu Thái Lan, ta thấy khả ức chế ACE dược liệu khác khu vực khác Ngồi ra, kết gợi mở việc cần thiết việc phân lập chất có cao chiết phân đoạn EtAc cần tây để đánh giá hoạt tính ức chế ACE  Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) Kết ức chế ACE cao chiết dừa cạn cho thấy tác dụng ức chế ACE mạnh Ở nồng độ 100 µg/ml, cao chiết cồn 500, Hexan, EtAc cắn nước cao chiết cồn 900 cho thấy tác dụng ức chế 80% Hai cao chiết Hexan EtAc nồng độ 50 µg/ml ức chế hồn tồn ACE Cao chiết từ dừa cạn nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp chuột adernalin gây Cao chiết xuất từ với mức liều 30 mg/155 (+/-15) mg trọng lượng thể tiêm vào chuột vào buổi sáng cho thấy tác dụng hạ áp đáng kể chuột [53] Nghiên cứu Srinivasa Rao chứng minh có mặt flavonoid quercetin rutin sử dụng sắc kí lớp mỏng hiệu cao với thành phần dung môi toluene, ethyl acetat methanol cao chiết methanol dừa cạn [40] Trong đó, quercetin rutin chứng minh tác dụng ức chế ACE với giá 39 trị IC50 30,3 µM [56] 71 µM [42] Qua đó, thấy phân đoạn EtAc chứa phần lớn chất có hoạt tính ức chế ACE dừa cạn quercetin, rutin đóng vai trò quan trọng tác dụng ức chế ACE phân đoạn  Lá hồng (Diospyros kaki) Kết cho thấy, cao chiết EtAc hồng có tác dụng ức chế ACE mạnh, ức chế hoàn toàn nồng độ 100 µg/ml 50 µg/ml Tiến hành thử thêm với nồng độ µg/ml cho thấy tác dụng ức chế đạt 82,47% (kết không bài) Nghiên cứu trước Kameda cộng chứng minh flavonoid phân lập từ hồng có khả ức chế ACE astragalin (1) kaempferol-3-O-(2"-Ogalloyl)-glucoside (2), isoquercitrin (3), and quercetin-3-O-(2"-O-galloyl)-glucoside (4) nồng độ 300 µg/ml 67%, 53%, 33% 48%, giá trị IC 50 (1) (2) 180 µg/ml and 280 µg/ml [29] Theo nghiên cứu Kayoko Kawakami cộng sự, proanthocyanidin chiết xuất từ hồng (PAf) có tác dụng hạ huyết áp chuột cao huyết áp nguyên phát Huyết áp chuột giảm sau uống liều nhất, hạ huyết áp phụ thuộc liều Sau uống 300 mg/kg PAf, huyết áp giảm dần từ 181 ± 14 mmHg giờ, đạt tối thiểu 150 ± 15 mmHg giờ, tăng lên sau Ở chuột bình thường, việc sử dụng 300 mg/kg PAf không làm thay đổi huyết áp sau dùng [30] Kết thu từ thí nghiệm cho thấy tương đồng với nghiên cứu trước đó, nhiên việc sử dụng dịch chiết thô mang lại nhiều ý nghĩa việc sử dụng dược liệu theo y học cổ truyền Đồng thời, tiến hành phân tích thành phần so sánh khác biệt cân nhắc để đánh giá dược lực dược liệu Việt Nam so với vùng khác  Xa kê (Artocarpus altilis) Theo kết thí nghiệm, cao chiết xa kê cho thấy tác dụng ức chế ACE mạnh nồng độ 100 µg/ml: 5/7 cao ức chế ACE 80%, bao gồm cao chiết nước, cao chiết cồn, phân đoạn Hex, phân đoạn EtAc, phân đoạn BuOH Khi pha lỗng nồng độ 50 µg/ml, cao Hex tác dụng ức chế ACE Cao chiết nước cồn cho tác dụng ổn định 53,70% 55,55% Kết có số mâu 40 thuẫn với nghiên cứu trước xa kê: cao chiết ethanol nóng có hoạt tính ức chế ACE mạnh (IC₅₀ 54,08 ± 0,29 μg/ ml), sau cao chiết ethyl acetat lạnh (IC₅₀= 85,44 ± 0,85 μg/ml), cao chiết nước có tác dụng ức chế ACE yếu (IC₅₀ = 765,52 ± 11.97 μg/ ml) Sự tương quan thành phần hóa học hoạt động ức chế ACE cho thấy nồng độ cao hợp chất glycosidic phenolic tham gia vào việc kích hoạt hoạt tính ức chế ACE [45] Một số nghiên cứu phân lập thành phần hóa học thành phần dịch chiết methanol Xa kê Việt Nam phân lập artocarpautone, số flavanoids, triterpen biết từ cao chiết, với phát hai hợp chất [27], [36] Ngoài ra, nghiên cứu thành phần cao chiết nước xa kê cho thấy có mặt tanin [4] Do đó, kết tác dụng ức chế ACE cao chiết xa kê gợi ý cho việc phân lập đánh giá tác dụng hoạt chất phân lập cần loại trừ kết dương tính giả ảnh hưởng tanin lên hoạt động ACE  Đỗ trọng (Eucommia ulmoides) Kết cho thấy cao chiết thuộc phân đoạn phân cực đỗ trọng cho tác dụng ức chế ACE mạnh Ở nồng độ 100 µg/ml, có cao cho tác dụng ức chế ACE 50% cao chiết nước, cao chiết cồn 500, cao phân đoạn EtAc, cao phân đoạn BuOH, cao phần cắn nước Khi giảm nồng độ 50 µg/ml, cao chiết nước cho tác dụng ức chế ACE 50% Thành phần có tác dụng chống cao huyết áp đỗ trọng chia làm loại: lignans, iridoids, flavonoids and terpenoids, loại có chế tác dụng riêng biệt Sih and Deyama báo cáo rằng, pinoresinol di-d-glucoside (30 mg/kg) and geniposide axit (30 mg/kg) có tác dụng hạ huyết áp mạnh Tuy nhiên, thành phần có đỗ trọng (thơng thường 0,3%), chưa thể giải thích g vỏ thân đỗ trọng có tác tác dụng làm giảm huyết áp mạnh chuột cống cao huyết áp tự phát (Spontaneously hypertensive rat, SHR) Trong nghiên cứu Luo cộng sự, tác giải phân tách phân đoạn bao gồm lignans 70% iridoids 60% thử tác dụng hạ huyết áp chuột cống trắng bình thường chuột SHR Kết cho thấy, phân đoạn lignan có tác dụng hạ huyết áp theo kiểu 41 phụ thuộc liều dùng chuột thử nghiệm phân đoạn iridoid khơng thể tác dụng [35] Qua thấy rằng, ngồi tác dụng ức chế ACE, tác dụng điều trị huyết áp đỗ trọng thể thơng qua chế hạ áp khác 3.2.2 Về thao tác quy trình thí nghiệm Việc áp dụng phương pháp đánh giá tác dụng ức chế ACE in vitro đĩa 96 giếng triển khai lần Việt Nam, mang lại nhiều ưu điểm vượt trội cho nghiên cứu sàng lọc: tiết kiệm thời gian, chi phí nghiên cứu, độ xác tương đối cao Trong q trình nghiên cứu cần lưu ý số vấn đề gặp phải ảnh hưởng tới kết nghiên cứu: - Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym làm ảnh hưởng đến tốc độ mức độ gây sai số đo quang, cần kiểm soát chặt chẽ yếu tố để giảm thiểu tối đa sai số - Về chất tham gia phản ứng tạo màu (BSC Quinolin): Việc sử dụng BSC Quinolin cho phản ứng tạo màu nhạy, nhanh định lượng khác yêu cầu thời gian lâu để đạt chuyển đổi màu hồn tồn [50] Tuy nhiên, quinolin bền, nhanh chóng bị oxi hóa chuyển sang màu nâu tiếp xúc với ánh sáng [60] Do đó, thao tác thí nghiệm cần tiến hành nhanh chóng điều kiện tránh ánh sáng để đảm bảo độ xác thí nghiệm 42 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ Kết luận: Trong khuôn khổ đề tài này, thu kết sau: - Trong chiết tổng mẫu dược liệu nghiên cứu, cao chiết nước thân rễ gối hạc cao chiết nước lược vàng cho thấy tác dụng ức chế ACE mạnh 100% 81% nồng độ 50 µg/ml - Xác định 11 mẫu cao chiết ức chế ACE mạnh từ 51 mẫu cao dược liệu tiềm điều trị tăng huyết áp bao gồm: Lược vàng (cao chiết nước, cao chiết cồn 500, cao chiết phân đoạn BuOH, phân đoạn DCM), dừa cạn (phân đoạn hexan, phân đoạn EtAc), thân rễ gối hạc (cao chiết nước, cao chiết phân đoạn EtAc, cao chiết phân đoạn BuOH), cần tây (phân đoạn EtAc), hồng (phân đoạn EtAc) - Đã xác định IC50 cao nước lược vàng 19,55 µg/ml IC50 captopril 14,72 nM Kiến nghị Đề tài sàng lọc tác dụng ức chế ACE in vitro 51 mẫu cao từ mẫu dược liệu tìm 11 cao chiết có tác dụng tốt Tuy nhiên, để khai thác, sử dụng hiệu nguồn dược liệu, đồng thời tối ưu hóa quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế ACE để việc sàng lọc tiến đơn giản, nhanh chóng, xác hơn, tiến hành với số lượng lớn mẫu dược liệu, đề tài xin đề xuất số nội dung nghiên cứu tiếp theo: - Tiếp tục xác định giá trị IC50 10 mẫu cao tiềm lại xác định nghiên cứu - Mở rộng quy mơ sàng lọc để tìm kiếm phát dược liệu có tiềm ức chế ACE Việt Nam - Phân lập xác định hoạt tính ức chế ACE in vitro chất phân lập từ phân đoạn DCM BuOH lược vàng phân đoạn EtAc BuOH thân rễ gối hạc 43 - Đánh giá tác dụng hạ huyết áp in vivo mơ hình tăng huyết áp thực nghiệm để khắng định tác dụng hạ huyết áp dược liệu lược vàng thân rễ gối hạc để phát triển dược liệu nghiên cứu phát triển thuốc điều trị tăng huyết áp có nguồn gốc từ dược liệu DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y Tế, Khuyến cáo chẩn đoán điều trị tăng huyết áp 2018 2018, Hội Tim mạch học Quốc gia Việt Nam BỘ Y TẾ (2007), Hóa sinh học (sách dùng cho đào tạo dược sĩ đại học), NXB Y học, pp Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, pp 305 Nguyễn Thị Thúy An (2014), Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học sa kê, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Văn Đậu, Hoàng Thị Hoa, et al (2011), "Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học lược vàng (Callisia fragrans L.)", Tạp chí Dược học, T51-S6 (2011), pp 54-57 Phạm Thùy Linh, Bá Thị Châm, et al (2014), "Phân lập chất từ rau chua Hibiscus sabdariffa có tác dụng ức chế enzym chuyển hóa Angiotensin I", pp 334-337 Tierney McPhee, Papadakis (2008), Chẩn đoán điều trị y học đại, NXB Y HỌC, pp 619-649 Trần Thị Ánh Hồng (2011), Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học thân lược vàng tỉnh Quảng Nam, Trường Đại học Đà Nẵng Trần Thị Liên Minh, Mai Phương Thảo (2017), Một số chuyên đề sinh lí học, Nhà Xuất Y học, pp 266-283 10 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kĩ Thuật pp Quyển 1: 689-694, 800-807, 874-875 11 Vũ Đức Lợi, Phạm Giang Lam, et al (2016), "Chiết xuất, phân lập số hợp chất từ gối hạc (Leea rubra Blume ex Spreng.)", VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, 32(1), pp 12-17 Tài liệu tiếng anh 12 Chaudhary Sushil Kumar, Mukherjee Pulok K, et al (2012), "ACE inhibiton activity of standardized extract and fractions of Terminalia bellerica", Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 12(4), pp 273-277 13 Ahmad Islamudin, Yanuar Arry, et al (2017), "Review of angiotensinconverting enzyme inhibitory assay: Rapid method in drug discovery of herbal plants", Pharmacognosy reviews, 11(21), pp 1-7 14 Ara Naznin, Rashid Mamunur, et al (2009), "Comparison of hypotensive and hypolipidemic effects of Catharanthus roseus leaves extract with atenolol on adrenaline induced hypertensive rats", Pakistan journal of pharmaceutical sciences, 22(3), pp 267-271 15 Barbosa-Filho José M, Martins Valeska KM, et al (2006), "Natural products inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE): A review between 1980-2000", Revista Brasileira de Farmacognosia, 16(3), pp 421-446 16 Barbosa Filho Jose, K.M Martins Valeska, et al (2006), Natural products inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE) A review between 1980-2000, pp 17 Basso Nidia, Terragno Norberto A (2001), "History about the discovery of the renin-angiotensin system", Hypertension, 38(6), pp 1246-1249 18 Braga F Castro, Wagner H, et al (2000), "Screening the Brazilian flora for antihypertensive plant species for in vitro angiotensin-I-converting enzyme inhibiting activity", Phytomedicine, 7(3), pp 245-250 19 Braga Fernão C, Serra Carla P, et al (2007), "Angiotensin-converting enzyme inhibition by Brazilian plants", Fitoterapia, 78(5), pp 353-358 20 Cushman DW, Cheung HS (1971), "Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung", Biochemical pharmacology, 20(7), pp 1637-1648 21 Chen Jiwang, Wang Yimei, et al (2013), "Comparison of analytical methods to assay inhibitors of angiotensin I-converting enzyme", Food chemistry, 141(4), pp 3329-3334 22 Cheung Hong-Son, Wang Feng-Lai, et al (1980), "Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence", Journal of Biological Chemistry, 255(2), pp 401-407 23 Duncan A C., Jäger, A K., & van Staden, J (1999), "Screening of Zulu medicinal plants for angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors", Journal of Ethnopharmacology, 68(1-3), pp 63-70 24 Guerrero Ligia, Castillo Julián, et al (2012), "Inhibition of angiotensinconverting enzyme activity by flavonoids: structure-activity relationship studies", PloS one, 7(11), pp e49493 25 Hansen Klaus, Nyman Ulf, et al (1995), "In vitro screening of traditional medicines for anti-hypertensive effect based on inhibition of the angiotensin converting enzyme (ACE)", Journal of ethnopharmacology, 48(1), pp 4351 26 Houston Mark C (2005), "Nutraceuticals, vitamins, antioxidants, and minerals in the prevention and treatment of hypertension", Progress in cardiovascular diseases, 47(6), pp 396-449 27 Huong Tran Thu, Cuong Nguyen Xuan, et al (2012), "A new prenylated aurone from Artocarpus altilis", Journal of Asian natural products research, 14(9), pp 923-928 28 Jimsheena VK, Gowda LR (2010), "Arachin derived peptides as selective angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitors: structure-activity relationship", Peptides, 31(6), pp 1165 29 Kameda K Takaku T, Okuda H, Kimura Y, Okuda T, Hatano T, Agata I, Arichi S (1987), "Inhibitory effects of various flavonoids isolated from leaves of persimmon on angiotensin converting enzyme activity", J Nat Prod., pp 30 Kawakami Kayoko, Aketa Saiko, et al (2011), "Antihypertensive and vasorelaxant effects of water-soluble proanthocyanidins from persimmon leaf tea in spontaneously hypertensive rats", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 75(8), pp 1435-1439 31 Ko F N Huang T F., Teng C M (1991), "Vasodilatory action mechanisms of apigenin isolated from Apium graveolens in rat thoracic aorta", Biochim Biophys Acta 1115, 1115, pp 69–74 32 Lacaille-Dubois M A., Franck, U., & Wagner, (2001), "Search for potential angiotensin converting enzyme (ACE)-inhibitors from plants", Phytomedicine, 8(1), pp 47-52 33 Li Guan-Hong, Liu Huan, et al (2005), "Direct spectrophotometric measurement of angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity for screening bioactive peptides", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 37(2), pp 219-224 34 Loizzo Monica R, Saab Antoine M, et al (2008), "In vitro inhibitory activities of plants used in Lebanon traditional medicine against angiotensin converting enzyme (ACE) and digestive enzymes related to diabetes", Journal of ethnopharmacology, 119(1), pp 109-116 35 Luo Li-fang, Wu Wei-hua, et al (2010), "Antihypertensive effect of Eucommia ulmoides Oliv extracts in spontaneously hypertensive rats", Journal of Ethnopharmacology, 129(2), pp 238-243 36 Mai Nguyen Thi Thanh, Hai Nguyen Xuan, et al (2012), "Three new geranyl aurones from the leaves of Artocarpus altilis", Phytochemistry letters, 5(3), pp 647-650 37 Moghadam Maryam Hassanpour, Imenshahidi Mohsen, et al (2013), "Antihypertensive effect of celery seed on rat blood pressure in chronic administration", Journal of medicinal food, 16(6), pp 558-563 38 Newman David J, Cragg Gordon M (2007), "Natural products as sources of new drugs over the last 25 years", Journal of natural products, 70(3), pp 461-477 39 Olennikov DN, Ibragimov TA, et al (2008), "Chemical composition of Callisia fragrans juice Phenolic compounds", Chemistry of natural compounds, 44(6), pp 776-777 40 Rao A Srinivasa, Fazil Mohammed (2013), "Simultaneous estimation of quercetin and rutin in ethanolic extract of Catharanthus roseus Linn leaves by HPTLC method", Glob Res Anal, 2, pp 155-157 41 Regulska Katarzyna, Stanisz Beata, et al (2014), "How to design a potent, specific, and stable angiotensin-converting enzyme inhibitor", Drug Discovery Today, 19(11), pp 1731-1743 42 Salles Trevisan Maria Teresa, Ricarte Irvila, et al (2018), "Inhibition of angiotensin I converting enzyme by anacardic acids isolated from Cashew nut (Anacardium occidentale Linn.) shell liquid", International Journal of Food Properties, 21(1), pp 921-929 43 Saputri FC, Mun’im Abdul, et al (2015), "Inhibition of angiotensin converting enzyme (ACE) activity by some Indonesia edible plants", Int J Pharm Sci Res, 6(3), pp 1054-9 44 Sharifi Niusha, Souri Effat, et al (2013), "Discovery of new angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors from medicinal plants to treat hypertension using an in vitro assay", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 21(1), pp 74 45 Siddesha Jalahalli M, Angaswamy Nataraju, et al (2011), "Phytochemical screening and evaluation of in vitro angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of Artocarpus altilis leaf", Natural product research, 25(20), pp 1931-1940 46 Simaratanamongkol Arunee, Umehara Kaoru, et al (2014), "Identification of a new angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor from Thai edible plants", Food chemistry, 165, pp 92-97 47 Soejarto Djaja Doel, Zhang Hong Jie, et al (2006), "“Studies on Biodiversity of Vietnam and Laos” 1998− 2005: Examining the Impact", Journal of natural products, 69(3), pp 473-481 48 Spyroulias Georgios A, Galanis Athanassios S, et al (2004), "Structural features of angiotensin-I converting enzyme catalytic sites: conformational studies in solution, homology models and comparison with other zinc metallopeptidases", Current topics in medicinal chemistry, 4(4), pp 403-429 49 Sturrock ED, Natesh R, et al (2004), "Structure of angiotensin I-converting enzyme", Cellular and molecular life sciences, 61, pp 2677-2686 50 Umberger Charles J, Fiorese Frank F (1963), "Colorimetric method for hippuric acid", Clinical chemistry, 9(1), pp 91-96 51 Wagner Hildebert, Elbl Gabriele (1992), "ACE-inhibitory procyanidins from Lespedeza capitata", Planta medica, 58(03), pp 297-297 52 Wu Xiao-Lin, San Cheang Wai, et al (2014), "Antagonism of Ca2+ influx via L-type Ca2+ channels mediates the vasorelaxant effect of Catharanthus roseus-derived vindorosine in rat renal artery", Planta medica, 80(18), pp 1672-1677 53 Ara N., Rashid M., et al (2009), "Comparison of hypotensive and hypolipidemic effects of Catharanthus roseus leaves extract with atenolol on adrenaline induced hypertensive rats", Pak J Pharm Sci, 22(3), pp 267-71 54 Ben Henda Y., Labidi A., et al (2013), "Measuring angiotensin-I converting enzyme inhibitory activity by micro plate assays: comparison using marine cryptides and tentative threshold determinations with captopril and losartan", J Agric Food Chem, 61(45), pp 10685-90 55 Chiou S Y., Sung J M., et al (2017), "Antioxidant, Antidiabetic, and Antihypertensive Properties of Echinacea purpurea Flower Extract and Caffeic Acid Derivatives Using In Vitro Models", J Med Food, 20(2), pp 171-179 56 Jenis J., Kim J Y., et al (2017), "Phytochemical profile and angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activity of Limonium michelsonii Lincz", J Nat Med, 71(4), pp 650-658 57 Kayahara H., Miao Z., et al (1999), "Synthesis and biological activities of ferulic acid derivatives", Anticancer Res, 19(5a), pp 3763-8 58 Olaiya C O., Esan A M., et al (2014), "Ameliorative effects of β-sitosterol on some biochemical indices of hypertension in wistar albino rats", Afr J Med Med Sci, 43(Suppl 1), pp 157-166 59 "Trung tâm Dữ liệu thực vật Việt Nam", Retrieved, from http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=news&newsid=1103 60 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Quinoline#section=PhysicalDescription ... đó, đề tài Nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym chuyển hóa angiotensin in vitro số dược liệu tiềm Việt Nam thực với mục tiêu cụ thể là: Đánh giá, sàng lọc tác dụng ức chế ACE in vitro mẫu... HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG MSV : 1401118 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM CHUYỂN HÓA ANGIOTENSIN IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU TIỀM NĂNG TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC... nhiều nghiên cứu đánh giá, sàng lọc tác dụng ức chế ACE in vitro cao chiết dược liệu chất/nhóm chất phân lập từ dược liệu [13], [15], [19], [44] Tại Việt Nam, nghiên cứu theo hướng hạn chế Các nghiên