Đang tải... (xem toàn văn)
Mắm là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn, phân bố trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến. [13] Trƣớc đây, ở Việt Nam cây mắm dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày nay, cây mắm cũng cung cấp nguyên liệu cho việc chế biến dƣợc và cung cấp sắc tố cho công nghiệp. [15] Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ phải chịu hàng ngàn tấn bom đạn cùng với đó là một lƣợng hóa chất khổng lồ đã đổ xuống đây làm cho rừng bị tàn phá khủng khiếp. Do vậy, từ năm 1978 huyện Cần Giờ đã tiến hành khôi phục lại hệ sinh thái rừng ngập mặn, sau 22 năm khôi phục tổ chức UNESCO đã công nhận là “khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/02/2000.[10] Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trƣờng, là khu làm sạch môi trƣờng sinh thái, môi trƣờng nƣớc và không khí Thành phố đã bị ô nhiễm nghiêm trọng. Rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là rừng phòng hộ, vừa là rừng bảo vệ Thành phố Hồ Chí Minh [2]. Vì thế việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm là vô cùng cấp thiết nhằm có chiến lƣợc quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Chúng ta cũng có thể tìm ra chỉ thị phân tử cho cây mắm và bảo tồn nguồn gene quý.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: NGÔ TRẦN VŨ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ NGƠ TRẦN VŨ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn Ba, Mẹ ngƣời thân gia đình ln quan tâm, tạo điều kiện động viên suốt q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn: - Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập thực tập - Các Thầy, Cô giáo môn CNSH Thầy, Cơ trực tiếp giảng dạy suốt q trình học tập năm qua - Thầy Bùi Minh Trí tận tình hƣớng dẫn động viên suốt thời gian thực đề tài - Các anh chị Trung tâm Phân tích Hố sinh Trƣờng Đại học Nơng Lâm tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài - Các anh chị Ban quản lý rừng Cần Giờ tận tình giúp đỡ thời gian làm đề tài - Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu động viên giúp đỡ suốt năm học Tp Hồ Chí Minh Tháng năm 2007 Sinh viên thực Ngơ Trần Vũ iii TĨM TẮT Ngơ Trần Vũ, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 “HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM ĐEN (Avecinnia officinalis) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẨN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Giáo viên hƣớng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ Rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc xem “lá phổi xanh” Thành phố với chức điều hịa khơng khí, giảm ô nhiễm môi trƣờng xử lý nƣớc thải Thành phố, thu nhận khí CO2 cho khí O2 hoạt động cơng nghiệp Để có chiến lƣợc lâu dài bền vững việc đánh giá mức độ di truyền quần thể nhằm có chiến lƣợc bảo tồn nguồn gen quý Kết đạt đƣợc: - Thu thập 50 mẫu mắm đen với đặc điểm hình thái khác - Xác định điều kiện bảo quản cho tối ƣu - Hồn thiện qui trình ly trích DNA - Primer OPA10 OPA5 không cho kết phản ứng RAPD-PCR - Primer OPD18 cho sản phẩm nhƣng chƣa đƣợc tối ƣu - Primer cho band kích thƣớc 400bp nên khơng có ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền - Bƣớc đầu khảo nghiệm primer OPAC10, xác định điều kiện tối ƣu cho primer - Nghiên cứu đa dạng di truyền mắm primer OPAC10 11 mẫu thu đƣợc trung bình 5,4 band/mẫu Tỷ lệ đồng hình 62,5% tỷ lệ đa hình 37,5% band đồng hình band đa hình Phân tích phân mềm NTSYSpc 2.1, phân nhóm di truyền cho đồng hình cao Cây phân nhóm di truyền chia làm nhóm, nhóm I có hệ số đồng dạng di truyền cao 0,875-1 Nhóm thu đƣợc nhánh không đủ điều kiện thực nhiều mẫu iv SUMMARY Ngo Tran Vu, Nong Lam University, 9/2007 “RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avecinnia officinalis IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE AREA BY RAPDPCR” Supervisor: Bui Minh Tri Can Gio mangrove forest was economic and environmental value, it was very important for air-condition and waste water treatment of Ho Chi Minh City Can Gio mangrove forest had rich and diversified floristic composition So, studying genetic diversity of Avecinnia officinalis tree aimed conserve genetic resource gene The obtained results were: - To collect 50 samples leaf with many tree different characteristic - Optimized process extraction DNA for Avecinnia officinalis tree - Optimized RAPD-PCR reaction for primer OPAC10 - To use software NTSYSpc 2.1 analyses for 11 samples Polymorphism had band and rate 37, 5%, isomorphism had band and rate 62, 5% v MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách bảng ix Danh sách hình x Danh sách chữ viết tắt xi Chƣơng 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu giới hạn đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Giới hạn đề tài Chƣơng 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn 2.1.1 Giới thiệu khu vực dự trữ sinh rừng ngập mặn 2.1.2 Vai Trò khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2 Một số khái niệm đa dạng sinh học 2.2.1 Đa dạng sinh học 2.2.2 Sự đa dạng di truyền 2.2.3 Ý nghĩa việc nghiên cứu bảo vệ đa dạng di truyền 2.3 Đặc điểm sinh vật học hình thái học mắm đen 2.3.1 Hình thái học 2.3.2 Phân bố 2.3.3 Vai trò rừng mắm 2.4 Các kỹ thuật tách chiết DNA 2.4.1 Các thông tin di truyền 2.4.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA 10 vi 2.4.3 Đánh giá chất lƣợng DNA 11 2.4.3.1 Định lƣợng DNA quang phổ kế 11 2.4.3.2 Định tính DNA phƣơng pháp điện di 12 2.5 PCR (polymerase chain reaction) 12 2.5.1 Nguyên tắc 12 2.5.2 Thành phần phản ứng PCR 14 2.5.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới PCR 14 2.5.4 Ƣu điểm nhƣợc điểm 14 2.6 Một số thị phân tử nghiên cứu đa dạng sinh học 15 2.6.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 15 2.6.2 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 16 2.6.3 Chỉ thị AFLP 17 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 3.1 Nội dung đề tài 20 3.2 Thời gian thực đề tài 20 3.3 Vật liệu 20 3.3.1 Mẫu mắm đen 20 3.3.2 Hóa chất thí nghiệm 21 3.3.2.1 Các hóa chất dùng ly trích DNA 21 3.3.2.2 Hóa chất dùng kiểm tra định lƣợng DNA 22 3.3.2.3 Hóa chất dùng định tính DNA 22 3.3.2.4 Hóa chất dùng để phản ứng RAPD 22 3.3.3 Trang thiết bị 22 3.4 Phƣơng pháp 23 3.4.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.4.3 Cách bố trí thí nghiệm 23 3.4.4 Phƣơng pháp ly trích DNA 23 3.4.4.1 Quy trình ly trích mẫu tƣơi Doyle Doyle (1988) 23 3.4.4.2 Quy trình ly trích DNA nitơ lỏng 24 3.4.4.3 Định tính DNA phƣơng pháp điện di 25 vii 3.4.4.4 Phƣơng pháp định lƣợng DNA quang phổ kế 25 3.4.5 Thực phản ứng RAPD-PCR 26 3.4.5.1 Primer sử dụng 26 3.4.5.2 Bố trí thí nghiệm 26 3.4.6 Phân tích kết phần mềm NTSYSpc 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Thu thập mẫu tiểu khu rừng ngập mặn Cần Giờ 32 4.2 Bảo quản ly trích vật liệu di truyền 33 4.2.1 Bảo quản 33 4.2.2 Ly trích vật liệu di truyền 33 4.3 Kết phản ứng RAPD-PCR 37 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Đề nghị 45 Chƣơng 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần hóa chất dung dịch ly trích EB 19 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất TE 1X 19 Bảng 3.3 Danh sách primer dùng nghiên cứu 23 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR thí nghiệm 24 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR thí nghiệm 24 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR thí nghiệm 25 Bảng 3.7 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR thí nghiệm 25 Bảng 3.8 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR thí nghiệm 26 Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR thí nghiệm 26 Bảng 3.10 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD-PCR thí nghiệm 27 Bảng 3.11 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD-PCR thí nghiệm 27 Bảng 4.1 Bảng OD mẫu nghiền theo qui trình cải tiến 34 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình dáng mắm đen Hình 2.2 Lá hoa mắm đen Hình 2.3 Trái mắm đen Hình 2.4 Nguyên tắc hoạt động phản ứng PCR 12 Hình 2.5 Nguyên tắc kỹ thuật RFLP 14 Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động kỹ thuật RAPD 15 Hình 4.1 Bản đồ vị trí lấy mẫu mắm đen Cần Giờ 32 Hình 4.2 Ly trích DNA theo qui trình Doyle Doyle (1988) 33 Hình 4.3 Ly trích theo qui trình Doyle Doyle (1988) cải tiến 34 Hình 4.4 Ly trích DNA theo qui trình nitơ lỏng 36 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPA10 OPA5 37 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer RAH8 38 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer 39 Hình 4.8 Kích thƣớc band phản ứng RAPD-PCR primer 39 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm phản ứng RAPD-PCR với primer OPAC10 40 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm thí nghiệm 41 Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm thí nghiệm 41 Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR mồi OPAC10 tối ƣu 42 Hình 4.13 Cây phân nhóm di truyền 11 mẫu mắm đen 43 x ... Tổng quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn 2.1.1 Giới thiệu khu vực dự trữ sinh rừng ngập mặn 2.1.2 Vai Trò khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2 Một số khái niệm đa dạng sinh học... quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn 2.1.1 Giới thiệu khu vực dự trữ sinh rừng ngập mặn Khu dự trữ sinh Cần Giờ nằm vùng ven biển vịnh Gềnh Rái cửa sông Đồng Nai với hệ sinh thái rừng ngập mặn đặc... mẫu mắm đen Hoàn thiện kỹ thuật RAPD cho mắm đen Đánh giá đa dạng di truyền quần thể mắm đen Mô tả quan hệ di truyền mẫu mắm đen phần mềm NTSYSpc 1.2.3 Giới hạn đề tài Đề tài nghiên cứu
