Đang tải... (xem toàn văn)
1. Tính cấp thiêt của đề tài Gan là một nội quan lớn của cơ thể người và động vật, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình trao đổi chất, thải độc và là cơ quan miễn dịch quan trọng của cơ thể. Máu cung cấp cho gan từ hai nguồn, khoảng 75% lưu lượng máu đi đến gan là từ các bộ phận của hệ tiêu hóa, lách thông qua tĩnh mạch cửa và 25% còn lại từ động mạch gan. Chính vì vậy, áp suất riêng phần của oxi trong máu mang đến cung cấp cho gan rất thấp. Ngoài ra, gan nhận các chất, trao đổi chất và chuyển hóa các chất từ máu mang đến. Do đó gan thường xuyên tiếp xúc với nội độc tố, các chất độc, vi khuẩn, virut... đây là những nguyên nhân làm gan tổn thương và dẫn đến các bệnh về gan (Higuchi và Gores, 2003). Các độc tố khi vào gan, kích thích tế bào gan sản xuất các cytokine tiền viêm như yếu tố hoại tử khối u (TNF-), interleukin-6 (IL-6) và interleukin-10 (IL- 10)…đóng vai trò quan trọng trong quá trình miễn dịch và gây chết tế bào. Các cytokine tiền viêm gây ra phản ứng viêm gan, khởi động cho quá trình tự điều chỉnh để chữa bệnh. Tuy nhiên nếu tình trạng viêm không giảm sau một thời gian ngắn, việc sản xuất các cytokine liên tục sẽ dẫn đến sự hình thành xơ hóa và xơ gan (Mannaa và Abdel-Wahhab, 2016). Do đó, có thể thông qua việc điều chỉnh quá trình sản xuất và hoạt động của các cytokine để bảo vệ gan. Bên cạnh đó, stress oxy hóa cũng là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến tổn thương và hoại tử tế bào gây ra trong bệnh về gan. Các gốc oxy hóa như hydroxyl, anion superoxide và hidrogen peroxide… phá h ủy mô gan, gây tổn thương tế bào thông qua quá trình peroxy hóa lipid màng, đột biến ADN (Cochrane, 1991). Vì vậy, việc tìm ra các tác nhân có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp có hoạt tính chống oxy hóa được đề xuất để ngăn ngừa và điều trị bệnh gan do stress oxy hóa. Cây thảo dược đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người. Các loại thuốc được chiết xuất từ thảo dược được dùng phổ biến trong điều trị bệnh, trong đó có bệnh gan do hiệu quả, mức an toàn và chi phí hợp lý. Cơ chế bảo vệ gan của các loại thảo dược thường thông qua hoạt động chống oxy hóa, kháng virus, chống viêm, chống xơ và các hoạt động miễn dịch. Tuy nhiên, chỉ có một số các dịch chiết và một số các hợp chất được phân lập từ các loài thảo dược đã được khảo sát, đánh giá hiệu quả hoạt tính bảo vệ gan trong các mô hình in vitro, ex vivo và in vivo. Hầu hết các loại thảo dược đều chưa được thử nghiệm để chứng minh hiệu quả bảo vệ gan mặc dù được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và trong dân gian (Dhiman và Chawla, 2005). Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng. Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 5.117 loài và dưới loài thực vật bậc cao có mạch được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa bệnh (Viện Dược liệu, 2017). Đây là nguồn dược liệu quý cần được nghiên cứu, khai thác sử dụng có hiệu quả và bảo tồn, phát triển bền vững cho cộng đồng . Trong số những loài đã được phát hiện, cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus), cây Nhó đông (Morinda longissima), cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus) là những cây được sử dụng nhiều trong các bài thuốc dân gian để điều trị bệnh trong đó có bệnh gan. Tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ gan của ba loại cây này sẽ bổ sung thêm nguồn nguyên liệu dược liệu sử dụng trong quá trình hỗ trợ, điều trị bệnh gan. Xuất phát từ nhữnglý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật Dứa dại (Pandanus odoratissimus), Nhó đông (Morinda longissima), Chùm ruột (Phyllanthus acidus)Việt Nam với các mục tiêu sau: 1. Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa từ các dịch chiết của quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông, lá cây Chùm ruột phân bố ở Việt Nam. 2. Chiết tách và phân lập một số hợp chất từ 3 loài thực vật này, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập. 3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan in vitro của các hợp chất được phân lập Đề tài này là cần thiết, đóng góp vào việc nghiên cứu về hoạt tính bảo vệ gan, chống oxy hóa của các dịch chiết, phát hiện các hợp chất tinh khiết có tác
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN CÔNG THÙY TRÂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA BA LỒI THỰC VẬT DỨA DẠI (PANDANUS ODORATISSIMUS), NHĨ ĐƠNG (MORINDA LONGISSIMA), CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gan số bệnh gan 1.1.1 Cấu trúc gan 1.1.2 Chức số hoạt động sinh lý gan 1.1.3 Một số dạng bệnh lý thường gặp gan 1.2 Stress oxy hóa bệnh gan 1.2.1 Gốc tự 1.2.2 Stress oxy hóa bệnh gan .10 1.2.3 Chống oxy hóa bảo vệ gan 10 1.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan in vitro, ex vivo 13 1.3 Vai trò số cytokine hệ chuyển đổi tín hiệu hoạt hóa phiên mã (signal transducer and activator of transcription 3- stat3) bệnh gan .14 1.3.1 Một số cytokine liên quan đến sinh học bệnh gan .14 1.3.2 Tín hiệu hoạt hóa phiên mã (Signal transducer and activator of transcription – STAT3) tế bào Kupffer bệnh gan 18 1.4 Các loài thực vật sử dụng nghiên cứu 19 1.4.1 Cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f) 19 1.4.2 Cây Nhó đơng(Morinda longissima Y.Z.Ruan) 22 1.4.3 Cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus L Skeels) 26 Chƣơng 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu .31 2.1.2 Hoá chất sử dụng nghiên cứu .32 2.1.3 Thiết bị 32 2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu hóa học .33 2.2.1 Phương pháp điều chế phần chiết từ nguyên liệu thực vật để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan 33 iii 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất .37 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất .37 2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu sinh học 38 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa DPPH .38 2.3.2 Phương pháp xác định khả ức chế peroxyl hóa lipid (thử nghiệm MDA) 39 2.3.3 Phương pháp xác định khả bảo vệ tế bào gan .40 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính cảm ứng/ức chế cytokine 41 2.3.5 Phương pháp xử lí số liệu .42 Chƣơng 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43 3.1 Kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phân tích sơ thành phần hóa học phân đoạn Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 3.1.1 Điều chế phần chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 3.1.2 Sơ phân tích thành phần hóa học phân đoạn tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 3.1.3 Kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 45 3.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-B;ML-B PA-C .49 3.2.1 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-B Dứa dại 49 3.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng 51 3.2.3 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 54 3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất đƣợc tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 60 3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại 60 3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng 65 3.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 69 Chƣơng BÀN LUẬN KẾT QUẢ 85 iv 4.1 Kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 85 4.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-B; ML-B PA-C .86 4.2.1 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-D Dứa dại 86 4.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đông 90 4.2.3 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PA-E Chùm ruột .92 4.3 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất đƣợc tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 106 4.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại 106 4.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng .108 4.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 118 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐLIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ ATP Adenosine triphosphate ADN Deoxyribonucleic acid Bcl-xl B-cell lymphoma-extra large CCl4 Carbon tetrachloride C-NMR Carbon nuclear magnetic res COSY Correlation spectroscopy d Doublet dd Doublet of doublet DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer DMEM Dulbescco´s modified eagle medium DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl EtOAc Ethyl acetate HMBC Heteronuclear multiple bond correlation H-NMR Proton nuclear magnetic resonance HSQC Heteronuclear singlet quantum coherence spetroscopy IC Inhibitory concentration (Nồng độ ức chế) IL Interleukin IR Infrared spetroscopy (Phổ hồng ngoại) LPS lipopolysaccharide MDA Malondialdehyde MKK Mitogen - activated protein kinase kinase MMP matrix metalloproteinases MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide MS Mass spetrometry (Phổ khối) vi NF-B Nuclear factor kappa B NOESY Nuclear overhause effect ROS Reactive oxygen species s Singlet STAT3 Signal transducer and activation of transcription TNF- Tumor necrosis factors C Carbon chemicalshift ( độ dịch chuyển hóa học Carbon) H Proton chemicalshifrt (độ dịch chuyển hóa học Proton) vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các phân đoạn chiết Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 Bảng 3.2.Kết định tính nhóm hợp chất tự nhiên phân đoạn chiết xuất từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 44 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính loại bỏ gốc tự DPPH phân đoạn từ Dứa dại, rễ Nhó đông Chùm ruột 46 Bảng 3.4.Kết thử hoạt tính chống oxy hóa thơng qua ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) Dứa dạiquả Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 47 Bảng 3.5.Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại 63 Bảng 3.6.Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng 68 Bảng 3.7.Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 73 Bảng 3.8 Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào RAW 264.7 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 77 Bảng 4.1 Số liệu phổ H- 13 C-NMR chất PA5 PA8 (500 & 125 MHz, MeOD) 101 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ đường tác động TNF-α tế bào gan .16 Hình 1.2 Tính hiệu STAT3 tế bào Kupffer 19 Hình 1.3 Cây Dứa dại 20 Hình 1.4 Cây Nhó đơng 23 Hình 1.5 Cây Chùm ruột 26 Hình 3.1 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn PO-B Dứa dại 50 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn PO-B rễ Nhó đơng .52 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 55 Hình 3.4 Giá trị IC50 thử nghiệm DPPH hợp chất PO1: Vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)-medioresinol phân lập từ phân đoạn chiết PO-B Dứa dại acid ascorbic .61 Hình 3.5 Giá trị IC50 thử nghiệm MDA hợp chất PO1: Vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)- medioresinol 62 Hình 3.6 Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương CCl4 gây hợp chất PO1: vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)syringaresinol; PO4: (+)-medioresinol tách chiết từ phân đoạn POB Dứa dại 65 Hình 3.7 Giá trị IC50 thử nghiệm DPPH hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol phân lập từ phân đoạn chiết ML-B rễ Nhó đơng acid ascorbic 66 Hình 3.8 Giá trị IC50 thử nghiệm MDA hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol phân lập từ phân đoạn chiết ML-B rễ Nhó đơng 67 Hình 3.9 Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương CCl4 gây hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng 69 ix Hình 3.10 Giá trị IC50 thử nghiệm DPPH hợp chất PA1: kaempferol; PA2: kaempferol -3-O-β-D-glucopyranoside; PA3: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L- arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C Chùm ruột acid ascorbic 70 Hình 3.11 Giá trị IC50 thử nghiệm MDA hợp chất PA1: kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside; PA3: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[αL-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L- arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C Chùm ruột .71 Hình 3.12 Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương CCl4 gây hợp chất PA1: kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-Dglucopyranoside; PA3: (Quercitrin); Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA4: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside PA5: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D-galactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl x ester; PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L- arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 76 Hình 3.13 Kết ức chế sản xuất TNF-α từ tế bào RAW hợp chất PA5: kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D- galactopyranoside; PA8: kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-ß-Dglucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C Chùm ruột thời điểm 24 48 80 Hình 3.14 Kết tác động hợp chất PA5: kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside; PA8: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C Chùm ruột đến trình sản sinh IL-6 từ tế bào RAW thời điểm 24 48 81 Hình 3.15.Kết tác động hợp chất PA5: kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside; PA8: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C Chùm ruột đến trình sản sinh IL-10 từ tế bào RAW 264.7 thời điểm 24 48 83 xi ... gan Xuất phát từ nhữnglý trên, tiến hành thực đề tài Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan ba lồi thực vật Dứa dại (Pandanus odoratissimus), Nhó đông (Morinda longissima), Chùm ruột (Phyllanthus acidus )Việt. .. đoạn Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 3.1.1 Điều chế phần chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột 43 3.1.2 Sơ phân tích thành phần hóa học phân đoạn tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột. .. phát hợp chất tinh khiết có tác dụng bảo vệ gan tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột phân bố Việt Nam Các kết đề tài góp phần giải thích hoạt tính bảo vệ gan thuốc dân gian, nâng cao giá