CÁCH PHA CHẾ MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT TRONG DẠY THỰC HÀNH SINH HỌC PGS TS Biền Văn Minh Trường ðHSP – ðại học Huế Cũng ñộng - thực vật, ñể sinh trưởng tế bào vi sinh vật (VSV) cần chất dinh dưỡng thích hợp Trong ni cấy nhân tạo người ta chuẩn bị loại “thức ăn” cung cấp cho nhóm VSV khác Dạng “thức ăn” ñược gọi “mơi trường ni cấy” Mơi trường ni cấy thường gọi theo tên người chế tạo cơng thức, ví dụ môi trường Hansen, Sabouraud… theo nguồn chất dinh dưỡng có mơi trường, ví dụ mơi trường thạch - thịt - pepton… Một mơi trường sử dụng để ni cấy VSV phải có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có pH thích hợp, có độ nhớt định, khơng chứa yếu tố độc hại phải tuyệt đối vơ trùng Làm mơi trường nhằm thực việc phân lập, nhân giống, giữ giống VSV, ñồng thời để ni cấy nghiên cứu đăc điểm sinh học chúng Nguyên tắc pha chế môi trường - Pha chế môi trường phải dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hố chất dinh dưỡng lồi VSV - Cần phải ñiều chỉnh tỉ lệ nồng ñộ chất thành phần môi trường ñể ñảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào VSV - ðảm bảo điều kiện lý - hố cần thiết cho hoạt động trao đổi chất VSV - Mơi trường phải vơ trùng tuyệt đối để ni cấy phát triển loại VSV mong muốn Phân loại mơi trường - Dựa vào mục đích sử dụng, người ta chia môi trường thành loại: Môi trường sở, môi trường làm giàu, môi trường chọn lọc môi trường giám biệt a Môi trường sở (minimum medium): mơi trường có đủ chất cần thiết cho đa số VSV phát triển Mơi trường thường dùng để ni cấy VSV dễ phát triển Ví dụ, mơi trường thạch – thịt – peptone dùng để phân lập, ni cấy vi khuẩn b Môi trường làm giàu (enrichment medium): môi trường sở cho thêm số chất dinh dưỡng ñặc biệt để thích hợp với việc ni cấy số nhóm VSV Các chất bổ sung thêm máu, huyết thanh, cao nấm men, mơ động vật nước chiết thực vật Ví dụ, để ni cấy vi khuẩn Bordetella pertussis người ta dùng môi trường sở Difco 0048 (đã khử trùng mơi trường 1100C 30 phút) có bổ sung máu thỏ vơ trùng (đã lọc qua nến lọc), cho nồng ñộ cuối 15% c Môi trường chọn lọc (Selective medium): môi trường, ngồi chất dinh dưỡng sở có số chất đặc hiệu để kích thích VSV phát triển số chất kìm hãm để ức chế phát triển VSV khác Môi trường thường ñược dùng ñể nuôi cấy, phân lập loại VSV định Ví dụ, mơi trường Hansen dùng để phân lập, nuôi cấy nấm men d Môi trường giám biệt (differential medium) dùng việc giám định lồi VSV khác để xác định vị trí phân loại chúng Chẳng hạn, xác ñịnh khả sinh protease bổ sung casein hay gelatin vào mơi trường, khả sinh amylase thêm tinh bột tan vào môi trường, khả sinh lipase thêm dầu ăn thị màu, khả sinh H2S thêm Pb acetate - Dựa vào trạng thái vật lý, người ta chia môi trường làm loại: + Môi trường lỏng hay dịch thể (liquid medium): Trong thành phần có chất dinh dưỡng nuớc, dùng để ni tăng sinh, thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa dùng để giữ giống bảo quản VSV khơng tăng trưởng tốt mơi trường rắn + Mơi trường đặc hay cứng (solid medium): mơi trường dịch thể có bổ sung 2% thạch (agar - agar) dùng ñể phân lập VSV hiếu khí + Mơi trường bán đặc (semisolid medium): môi trường dịch thể chứa 0,35-0,75% thạch (dùng ñể kiểm tra khả di ñộng) môi trường xốp mơi trường có sử dụng ngun liệu làm xốp cám, cơm, mạt cưa, than bùn…(dùng ñể ni cấy VSV hiếu khí dạng sợi) Các bước pha chế môi trường nuôi cấy Bước một: Chuẩn bị dụng cụ: pipet, ống ñong, ống nghiệm, cân, bình cầu Bước hai: ðối với mơi trường lỏng: cân, đong đủ thành phần mơi trường cho vào bình cầu; mơi trường đặc thêm 2% thạch (cân thạch ngâm vào nước trước 5-10 phút, vớt thạch, vắt khô) Bước ba: ðun sôi nhỏ lửa khuấy ñều cho tan hết lọc qua vải nóng (500C) làm cách dùng lòng trắng trứng gà với lit môi trường ðánh trứng sủi bọt cho vào môi trường, khuấy đều, đun sơi phút, để lắng lọc qua vải Bước bốn: ðo pH môi trường máy ño pH Chỉnh pH ñến giá trị thích hợp dung dịch NaOH 10% HCl 10% Bước năm: Dùng phểu thủy tinh, rót mơi Làm nút bơng theo trình tự a, b, c trường vào dụng cụ (1/4 chiều cao ống nghiệm ñể chế thạch nghiêng, 1/2 chiều cao ống nghiệm - thạch ñứng, 1/3 chiều cao đĩa petri – mơi trường thạch đĩa) Làm nút bơng (dùng bơng khơng thấm nước) để nút miệng ống nghiệm (nút khơng q chặt q lỏng, thường dài 3-4cm) Bao giấy chống thấm đầu ống nghiệm hay bình nón đựng mơi trường (hình trên) Bước sáu: Hấp 1100C môi trường 30 phút, ñem chế thạch ñĩa, hay lát nghiêng ñể cho mơi trường đơng lại ta mơi trường thạch nghiêng (xem hình dưới) Bước bảy: Nhận định kết Người nghĩ đến sử dụng môi trường đặc nghiên cứu vi sinh vật Robert Koch vào năm 1881 Thạch sản phẩm chế tạo từ Rau câu vàng (Gracilaria verucosa) chất làm cứng môi trường Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần pha chế phòng thí nghiệm sinh học Thành phần số môi trường cách pha chế a Môi trường thạch – thịt – peptone (phân lập, ni cấy vi khuẩn) * Cơng thức: Nước thịt bò 1000ml; peptone 10g; NaCl 5g; glucose 20g; thạch 20g Làm nuớc thịt bò: Lọc hết gân mỡ thịt, xay hoăc băm nhỏ, cân 500g ngâm thịt vào 1000ml nước cất, ñể tủ lạnh qua ñêm ðun từ từ sơi, vớt bọt, khuấy đều, trì sơi âm ỉ 1giờ, khuấy ñều Lọc qua giấy lọc ñể loại mỡ, bã thịt, thêm nước cất cho đủ 1000ml Nếu cất giữ để dành ñóng chai hấp 1100C 30 phút * Pha chế: + Chuẩn bị dụng cụ: bình cầu (hoặc nồi nhơm), ống ñong, giấy lọc, dao, máy xay thịt, cân Cân ñong ñủ nước thịt, peptone, muối cho vào nồi nhơm đun nóng cho tan ðiều chỉnh pH đến 7,2 – 7,4 Cho thạch (ñã ngâm nước trước 10 phút, rửa sạch) vào, đun sơi, lọc qua bơng gạc mơi trường nóng phân phối vào ống nghiệm, bình cầu hay bình nón Dùng nút bơng nút ống nghiệm, bao giấy bịt ñầu miệng chúng Hấp 1100C 30 phút; lấy ống nghiệm đặt nằm nghiêng cho thạch đơng + u cầu: thạch phải tan ñều, màu vàng nhạt sẫm, không cứng mềm b Môi trường Hansen (phân lập, nuôi cấy nấm men) Glucose 50g; peptone 10g; KH2PO4 3g; MgSO4.7H2O 3g; thạch 20g; nước cất 1000ml; pH= 6,0 c Môi trường Czapek (phân lập nuôi cấy nấm mốc) Saccharose 30g; NaNO3 2g; K2HPO4.3H2O 1g; KCl 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g; thạch 20g; nước cất 1000ml; pH =7,0 d Môi trường Gause (phân lập nuôi cấy xạ khuẩn) Tinh bột tan 20g; KH2PO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; KNO3 1g; NaCl 0,5g; FeSO4 0,01g; thạch 20g; nước cất 1000 ml; pH = 7,2 - 7,4 Cách pha: Hòa tan hố chất thành phần mơi trường vào nước, tinh bột hồ tan nước ấm Khuấy cho tan ñều ñổ trộn vào nhau, thêm nước cho đủ 1000ml e Mơi trường nước chiết khoai tây giá đậu xanh (ni cấy vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) Khoai tây 100g, giá ñậu xanh 100g, đường kính 50g; thạch 20g; nước cất 1000 ml ðun sơi khoai tây (đã gọt vỏ, thái lát) giá đậu xanh với nước cất bình cầu 10 phút, sau đem lọc lấy dịch trong, cho hỗn hợp đường kính thạch vào bình chứa dịch trong, đun sơi, khuấy cho hồ tan, lọc qua bơng gạc mơi trường nóng phân phối vào ống nghiệm, bình cầu hay bình nón Dùng bơng nút ống nghiệm lại, bao giấy bịt đầu miệng ống, hấp 1100C 30 phút; lấy ống nghiệm đặt nằm nghiêng cho thạch đơng Câu hỏi: 1) Trình bày nguyên tắc việc pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật? 2) Nêu bước pha chế loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Nguyên nhân môi trường bị hư hỏng ? Phương pháp bảo quản mơi trường? 3) Trình bày loại môi trường nuôi cấy VSV cần pha chế phòng thí nghiệm ? Ứng dụng? Những ñiểm cần lưu ý: - Thạch (agar - agar) chất rắn bổ sung làm cứng môi trường, chất dinh dưỡng VSV Thạch nóng chảy 1000C đơng lại 400C Nếu cần cấy VSV trước mơi trường đơng đặc, người ta ñể môi trường nguội ñến 45 – 500C cấy vào - Với bình mơi trường đơng cần đun cách thủy để mơi trường lỏng đồng Khi lấy bình khỏi nồi phải dùng khăn thấm khơ bình (tránh nước thành bình nhỏ vào đĩa mơi trường gây nhiễm) Có thể đặt bình vào nồi hấp đun đến hòa tan, khơng nên ñun bình bếp ñiện - Trong trình thạch ñông không ñược làm rung bàn hay rung ống thạch Sau thạch đơng, ống nguội hẳn gói ống thạch nghiêng giấy vơ trùng, đặt vào tủ ấm 30-370C để kiểm tra độ vơ trùng để làm khô mặt thạch Sau vài ngày lấy quan sát Những ống thạch nghiêng vô trùng (không chứa khuẩn lạc VSV) dùng để ni cấy VSV - Rất nhiều loại ñường dễ bị phân giải trình khử trùng pH kiềm (đặc biệt có mặt muối phosphate peptone) làm cho màu môi trường chuyển thành màu nâu sản phẩm tạo thành ức chế sinh trưởng VSV ðể tránh tình trạng người ta khử trùng môi trường pH acid nhẹ khử trùng riêng biệt ñối với ñường Tài liệu tham khảo [1] Vũ Thị Minh ðức, Thực tập vi sinh vật học, NXB ðại học Quốc gia Hà Nội năm 2001 [2] John William Henry Eyre, 2009 A Laboratory Guide for Medical, Dental, and Technical Students, http://www.gutenberg.org/ ... pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật? 2) Nêu bước pha chế loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Nguyên nhân môi trường bị hư hỏng ? Phương pháp bảo quản môi trường? 3) Trình bày loại mơi trường. .. môi trường Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần pha chế phòng thí nghiệm sinh học Thành phần số môi trường cách pha chế a Môi trường thạch – thịt – peptone (phân lập, nuôi cấy vi khuẩn)... nghĩ đến sử dụng môi trường đặc nghiên cứu vi sinh vật Robert Koch vào năm 1881 Thạch sản phẩm chế tạo từ Rau câu vàng (Gracilaria verucosa) chất làm cứng môi trường Các loại môi trường nuôi cấy