TÀI LIỆU THỰC TẬP VI SINH PHẦN TÓM TẮT LÝ THUYẾT-THỰC HÀNH KHÁNG SINH ĐỒ Kháng sinh đồ: thử nghiệm độ nhạy KS phòng thí nghiệm - E-test - Kirby-Bauer - Pha loãng ống nghiệm 2.Nguyên tắc phương pháp Kirby-Bauer: tẩm KS vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp khuếch tán mặt thạch chung quanh, ngăn cản phát triển VK Phương pháp Kirby-Bauer: - Ưu: + Phương pháp dễ làm + Ứng dụng VS lâm sàng + Cùng lúc phát nhiều loại KS - Nhược: + Chỉ định tính Đặc điểm đĩa KS (giấy): - Đường kính 6mm - Được bảo quản ống chứa chất bảo quản (hút ẩm) t ≤ -40C - Khi chuẩn bị dùng để t = 2-80C Môi trường làm KS đồ (Kirby-Bauer): MHA (Muller Hinton Agar) Kích thước mầm cấy (Kirby-Bauer): 108 CFU/ml Độ đục chuẩn: 0.5 Mc Faland (McF) (hoặc so độ đục với dd BaSO4.2H2O) Thời gian ủ làm KS đồ: 18-24h/370C Nhìn đĩa KS đọc kết quả: - Có vòng vơ khuẩn : VK nhạy với KS, đo đường kính dựa vào bảng + Nhạy + Trung gian + Kháng - Không có vòng vơ khuẩn: VK kháng KS 10 Tên phương pháp khuếch tán đĩa thạch: Kirby-Bauer 11 Lưu ý đọc KS đồ theo phương pháp Kirby-Bauer: - VK mọc sát đĩa giấy, khơng có vòng vơ khuẩn: kháng - Nếu có vòng vơ khuẩn: đọc theo vòng (trừ trường hợp sd KS Sulfonamid VK cấy Proteus) - Có vòng vơ khuẩn: đo đường kính so với bảng NCCLS kết luận * Lưu ý vòng vơ khuẩn: - Vòng vơ khuẩn vắt: ??? - Vòng vơ khuẩn đục: đề kháng ??? 12 Phương pháp pha loãng liên tiếp: - Ưu: Định lượng (MIC) - Nhược: tốn công, tốn thời gian, làm loại KS 13 Môi trường thực KS đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp: NB (Nutrient Broth: môi trường dinh dưỡng lỏng) 14 Điều kiện đọc KQ KS đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp: - Ống phải - Ống 10 phải đục - Độ giảm dần từ ống → 10 - Độ đục tăng dần từ ống → 10 15 KS đồ theo phương pháp E-test: - Ưu: định tính định lượng - Nhược: đắt tiền VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT - Có mơi trường phân lập: MC (Mac Conkey), SS (Shigella, Salmonella), EMB (Eosin Methylen Blue) Lý thuyết: tính chất trực khuẩn đường ruột: - Gr(-), hiếu khí/kị khí tùy nghi - Đa số di động (1 số không di động Shigella, Klebsiella) - Glu(+) (Gas(±)) - Khử Nitrate → Nitrite - Oxidase (-) - Lac(±) Thực hành: * Cho đĩa petri chứa môi trường phân lập: - MC (Mac Conkey): hồng + TT: + Mấy loại khúm vi khuẩn? + Lac(+): hồng cánh sen + Lac(-): trắng trong/đục, vàng + LT: + Chất thị: đỏ trung tính + Chất ức chế: muối mật, crystal violet + Lactose - EMB (Eosin Methylen Blue): tím + TT: + Số loại khúm + Lac(+): tím than + Lac(-): + Ánh kim (+): E.coli + LT: + Chất thị, ức chế: Eosin, Methylen Blue + Lactose - SS (Shigella, Salmonella): vàng + TT: + Số loại khúm + Lac(+): đỏ, hồng + Lac(-): + H2S(+): chấm đen + LT: + Chất thị: đỏ trung tính + Chất ức chế: Muối mật, Brilliant green + Lactose * Thử nghiệm hóa sinh: - Mơi trường TSI, KIA (Kliger Iron Agar): có thạch đứng thạch nghiêng/ sử dụng kim cấy Glu(+), Glu(+), Glu(+), Glu(+), Chuẩn Lac(+) Lac(-) H2S(+) Gas(+) Thạch nghiêng (L) Thạch đứng (G) Pseudomonas + Riêng môi trường TSI (Triple Suger Iron) có thêm đường Sucrose, giúp tìm VK lên men Lactose chậm (nhiều ngày) - Môi trường SIM (Sulfide Indole Motility): bán lỏng, khảo sát di động, sinh H2S sinh Indole / sử dụng kim cấy Mot(+) Ống nghiệm đục Mot(-) Ind(+) Ind(-) Không đục Sau nhỏ Sau nhỏ ống nghiệm TT Kovac’s TT Kovac’s (đục theo (+) đỏ (-) vàn đường cấy) + Indole: khảo sát sinh men Tryptophanase H2S(+) H2S(+) màu đen (toàn ống nghiệm → Mot(+)) Tryptophane Indole + Pyruvic acid + Ammonia Indole + p-dimethylaminobenzaldehyde (Kovac’s) → Dimethylammonium (đỏ) - Môi trường Citrate (Sodium citrate + Agar): thạch nghiêng / sử dụng vòng cấy Cit(+) Cit(-) Mơi trường màu Môi trường màu xanh xanh blue + Thử nghiệm khả sử dụng carbon từ muối citrate VK + Chấ thị: Bromothymol Blue - Môi trường MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer): môi trường lỏng / sử dụng vòng cấy + Thử nghiệm Methyl Red: phát VK lên men Glucose mạnh + Sau cho NaOH 40% để trung hòa acid + Thử nghiệm Voges Proskauer: phát VK sử dụng đường Glucose theo hướng khác (sử dụng thuốc thử α-napthol) MR(+) MR(-) VP(+) VP(-) Vàng Hồng Cà phê/đỏ Nâu dơ/nâu đất - Mơi trường Stuart’s Urea Broth: lỏng / sử dụng vòng cấy + Chất thị: đỏ phenol + Xác định VK có sản xuất men Urease khơng pH 6,8/ Ure(-) - vàng pH 8,1/ Ure(+) - đỏ cánh Chuẩn sen CẦU KHUẨN GRAM DƯƠNG Staphylococci (Tụ cầu khuẩn) - Hình cầu, xếp thành chùm - Môi trường MSA chứa 7,5% NaCl cho Staphylococci mọc Coagulase(+) Coagulase(-) Streptococci (Liên cầu khuẩn) - Hình bầu dục, xếp thành chuỗi - Chỉ mọc môi trường giàu dinh Pneumococcus (Phế cầu khuẩn) - Hình mũi giáo, nến; xếp thành đơi - Tan muối mật - Test nhạy cảm với MSA Mannitol(+) → vàng Coagulase(+) → S.aureus MSA dưỡng (thạch máuOptochin → phân biệt Mannitol(-) BA, thạch nâu-CA) phế cầu với liên cầu Coagulase(-) → S.epidermidis S.saprophyticu s Tụ cầu vàng tiết Hemolysin → Tiết Streptolysin → tan huyết tiêu hyết Catalase(+) ≠ liên cầu, phế cầu Catalase(-) Catalase(-) Thử nghiệm Catalase: phân biệt Staphylococci (+) với Streptococci (-) Thử nghiệm Coagulase: phân biệt Staphylococcus aureus với Staphylococci khác - Trên lam: tìm Coagulase liên kết - Trên ống nghiệm: tìm Coagulase tự - Kết quả: + Coagulase(+): làm đông đặc huyết tương → S.aureus + Coagulase(-): không làm đông đặc huyết tương Thử nghiệm lên men đường Mannitol: Staphylococci aureus lên men Mannitol, sinh acid làm đổi màu thị đỏ phenol từ đỏ sang vàng - Ống MSA từ đỏ sang vàng: Mannitol(+) - Ống MSA giữ màu: Mannitol(-) Thử nghiệm Hemolysin: Staphylococcus aureus sinh Hemolysin ly giải hồng cầu - Tiêu huyết (+): xung quanh khúm VK xuất vòng sáng tiêu huyết Thử nghiệm kháng Novobiocin: S.saprophyticus có khả đề kháng Novobiocin - Đường kính vòng vơ khuẩn < 16mm: Staphylococcus saprophyticus - Đường kính vòng vơ khuẩn > 16mm: Staphylococci Coagulase(-) khác Taxo A: thử nghiệm nhạy cảm với Bacitracin - Dùng để phân biệt Streptococcus tiêu huyết β nhóm A - Kết quả: - Có vòng vơ khuẩn → Streptococcus tiêu huyết β nhóm A - Khơng có vòng vơ khuẩn → Taxo A(-) Thử nghiệm CAMP: - Streptococci nhóm β tiết yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tan huyết với β-hemolysin S.aureus Taxo P: thử nghiệm nhạy cảm với Optochin - Dùng để phân biệt Pneumococcus - Kết quả: - Đường kính vòng vơ khuẩn ≥ 14mm: Pneumococcus - Đường kính vòng vơ khuẩn < 14mm: dùng thí nghiệm tan muối mật (Bile Esculin) CẦU KHUẨN GRAM ÂM (Neisseria) - Song cầu Gr(-) đứng thành đơi có mặt lõm quay vào - Có loại thường gây bệnh cho người: N.meningitidis (Menigococcus-màng não cầu) N.gonorrhoae (Gonococcus-lậu cầu) - Thử nghiệm lên men đường nhanh: định danh + Maltose(+): Menigococcus + Maltose(-): Gonococcus ĐỀ THI THỰC TẬP – THAM KHẢO TRẠM 1: - Đọc kết thí nghiệm Mannitol/MSA (đỏ) + Mơi trường MSA, chất thị: đỏ phenol + Ủ 350C/18-24h + Có VK mọc hay không? + Kết quả: + Vàng: Mannitol(+) + Đỏ: Mannitol(-) TRẠM 2: - Đọc thí nghiệm Coagulase/huyết tương (vàng) + Môi trường huyết tương + Thử nghiệm phân biệt Staphylococcus aureus loại Staphylococci khác + Kết quả: + Huyết tương đơng vón, lợn cợn: Coagulase(+) + Huyết tương lỏng: Coagulase(-) + Chú ý: quan sát KQ 10s đầu TRẠM 3: - Thí nghiệm tiêu huyết (Hemolysin)/thạch máu + Mơi trường (BA: Blood Agar) + Có VK mọc hay khơng? + Kết quả: + Có vòng sáng quanh khúm VK: (+) + Khơng có vòng sáng: (-) TRẠM 4: - Thử nghiệm kháng Novobiocin/thạch nâu (CA) + Ủ 350C/18-24h + Kháng (-): d vòng vơ khuẩn ≤ 16mm: Staphylococcus saprophyticus + Nhạy cảm (+): d vòng vơ khuẩn > 16mm: Staphylococcus aureus Staphylococci Coagulase(-) khác TRẠM 5: - Thử nghiệm nhạy cảm Bacitracin (Taxo A) + Kháng (Taxo A(-)): khơng có vòng vơ khuẩn + Nhạy (Taxo A(+)): có vòng vơ khuẩn: Streptococcus tiêu huyết β nhóm A TRẠM 6: - Thử nghiệm nhạy cảm Optochin (Taxo P) + Dùng để phân biệt Pneumococcus Streptococci tiêu huyết α khác (Streptococcus viridans) + Kháng (Taxo P(-)): đường kính vòng vơ khuẩn < 14mm: làm thêm thử nghiệm tan muối mật (Bile Esculin) để xác định Pneumococcus + Nhạy (Taxo P(+)): đường kính vòng vô khuẩn ≥ 14mm: Pneumococcus TRẠM 7: - Đọc kết kháng sinh đồ đĩa thạch (Kirby Bauer): + Có vòng vơ khuẩn → đo đường kính (mm) → nhạy cảm/trung gian/kháng + Khơng có vòng vơ khuẩn → kháng TRẠM 8: - Đọc phết VK nhuộm Gram KHV: + Màu đỏ: Gr(-) / Màu tím: Gr(+) + Hình cầu: cầu khuẩn / Hình que: trực khuẩn + KQ: cầu/trực khuẩn Gr(±), xếp: rải rác, chuỗi, đôi, chùm (cầu khuẩn); rải rác, bó (trực khuẩn); phẩy khuẩn, xoắn khuẩn (trực khuẩn) TRẠM 9: - Đọc KQ cấy vạch chiều xem có loại khúm? TRẠM 10: - Đọc kết phết VK kháng nhuộm Gram + Trả lời có hay khơng trực khuẩn kháng acid (Acid Fast Bacilli): + AFB(+) + AFB(-) TRẠM 11: - Đọc KQ môi trường KIA (đỏ) + Môi trường: KIA + Glucose(+) + Lactose(+): vàng / (-): đỏ + Gas(+): có lỗ khí, thạch bị đẩy, vỡ / (-): khơng có khí + H2S(+): đen / (-): khơng đen TRẠM 12: - Đọc KQ môi trường Citrate (xanh lá) + Citrate(+): xanh dương (pH=7,6) + Citrate(-): xanh (pH=6,9) TRẠM 13: - Đọc KQ mơi trường Urea (tím sen) + Urea(+): mặt khum chất lỏng màu tím đậm + Urea(-): mặt khum tím nhạt TRẠM 14: - Đọc KQ môi trường SIM (bán lỏng): + H2S(+): đen / (-): không đen + Di động(+): đục xung quanh đường cấy / (-): không đục xa đường cấy + Indole(+): nhỏ Kovac’s → đỏ / (-): vòng TRẠM 15: - Đọc KQ cấy vạch chiều môi trường MC: + Môi trường: MC + Mấy loại khúm + Lac(+): đỏ, hồng (nhìn xung quanh khúm) / (-): trắng, vàng TRẠM 16: - Đọc KQ môi trường phân lập SS: + Mơi trường: SS + Có loại khúm + Lac(+): đỏ, hồng (nhìn xung quanh khúm) / (-): trắng, vàng + H2S(+): đen / (-): không đen TRẠM 17: - Đọc KQ mơi trường phân lập EM: (thạch tím than) + Môi trường: EM + Mấy loại khúm + Lac(+): tím / (-): + Ánh kim(+): E.coli CÂU HỎI LÝ THUYẾT Bài 1: Dụng cụ bản, phương pháp nhuộm Gram, nhuộm Ziehl-Neelsen Nguyên tắc nhuộm Gram: - Alcol 950 tẩy màu hợp chất “tím Gentian – Iod” VK Gr(-) Bộ thuốc nhuộm Gram: - Tím Gentian, Lugol, Alcol 950,Đỏ Safranin VK Gr: - Gr(+): có 40 lớp Peptidoglycan chiếm 50% vật liệu cấu tạo TB - Gr(-): có 1-2 lớp Peptidoglycan chiếm 5-10% vật liệu cấu tạo TB Nhỏ dầu Cèdre quan sát vật kính 100X để tăng độ chiết quang Tiêu cự gì: - Là khoảng cách nhìn rõ từ tiêu đến vật kính Tiêu cự vật kính: - 10X: 16 mm - 40X: mm - 100X: mm Độ phóng đại = độ phóng đại thị kính x độ phóng đại vật kính Dụng cụ PTN VS gồm: đèn cồn, kim cấy, vòng cấy, ống nghiệm, hộp Petri Thời gian trả lời kết xét nghiệm VK ngày 10 Đặc điểm cấu tạo trực khuẩn kháng acid: - Dài, mãnh, bắt màu đỏ - Kháng lại xâm nhập phẩm nhuộm có lượng lớn lipid lớp cỏ 11 Trực khuẩn kháng acid bắt màu với thuốc nhuộm Carbonfuchsin 12 Bộ thuốc nhuộm phương pháp nhuộm kháng acid: - Carbonfuchsin, Methylen Blue, Dung dịch acid-alcol (HCl 3% - Alcol 700) 13 Công dụng dung dịch acid-alcol: - Tẩy màu Carbonfuchsin TB biểu mô, bạch cầu 14 Công dụng Methylen Blue: - Bắt màu xanh TB biểu mô, bạch cầu Bài 2: Phân lập vi khuẩn Nguyên tắc cấy vạch chiều: - Làm cạn dần mầm cấy Mục đích việc làm cạn dần mầm cấy: - Phân lập VK Môi trường cấy vạch chiều: - NA (Nutrient Agar) Bài 3: Chỉ tiêu xét nghiệm nước VSV Coliform đánh giá tình trạng vệ sinh chung nguồn nước Faccal coliform đánh giá vi sinh vật nguồn nước Faccal streptococci chứng nguồn nước nhiễm phân Clostridium perfringens đánh giá chất lượng khử khuẩn mẫu nước Staphylococcus gây tiêu chảy ngộ độc thực phẩm Bài 4: Kiểm tra vi sinh khơng khí Cho biết loại VSV mọc môi trường sau: BA cho tất VSV mọc 370C/5-10% CO2/24h MC cho trực khuẩn Gr(-) mọc 370C/24h SA cho vi nấm mọc 370C/72h Các môi trường dùng để kiểm tra vi sinh khơng khí là: - BA, MC, SA Kể tên phương pháp kiểm tra vi sinh khơng khí: - Phương pháp lắng bụi Koch - Phương pháp hút bụi màng lọc Gelatin - Phương pháp hút bụi trực tiếp lên mặt thạch đặt máy hút Mục đích kiểm tra vi sinh khơng khí: - Phát VSV gây bệnh qua đường hô hấp khơng khí - Đánh giá tình trạng vệ sinh sở SX thực phẩm, sở y tế - Đánh giá hiệu biện pháp khử trùng sở y tết - Điều tra tình trạng nhiễm VSV gây dịch Bài 5: Kháng sinh đồ Kể tên phương pháp làm KSĐ: - Phương pháp Kirby-Bauer - Phương pháp pha loãng liên tiếp - Phương pháp E-Test Kể tên vật liệu để làm KSĐ: - Đĩa KS - Môi trường - Huyền dịch VK Môi trường tiêu chuẩn làm KSĐ phương pháp Kirby-Bauer MHA Độ đục McFarland là: 0,5 = 108 CFU/ml MIC nồng độ tối thiểu (µg/ml) ức chế phát triển VK quan sát mắy thường Bài 6: Vi khuẩn đường ruột Tính chất chung Enterobacteriaceae: - Trực khuẩn Gr(-); đa số di động trừ Shigella, Klebsiella; Glu(+), Oxidase(-) loại VK đường ruột gây bệnh thường gặp: - E.coli (gây tiêu chảy): ETEC, EIEC, EHEC, VTEC - Shigella (gây lị trực trùng): nhóm A: S.dysenteriae (thường gặp VN) nhóm B: S.flexneri (thường gặp VN) nhóm C: S.boydii nhóm D: S.sonnei - Salmonella (gây thương hàn) - Yersinia (gây dịch hạch) Môi trường chuyên chở thường dùng Cary-Blair Kể tên môi trường phân lập: MC, EMB, SS Kể tên mơi trường sinh hóa: KIA, MR-VP, SIM, Urea, Citrate Quy trình phân lập Enterobacteriaceae: - Bệnh phẩm → Cary-Blair → EMB, MC, SS → chọn khúm → KIA/TSI: oxidase(-) → PƯ sinh hóa Trong mơi trường EMB có ánh kim chắn có E.coli Trong mơi trường KIA nồng độ Glucose/Lactose: 1/10 Mơi trường TSI khác KIA chỗ có thêm đường sucrose 10 Thạch TSI khảo sát tính chất VK? - Biết sơ khởi dạng VK phân lập, khảo sát tính chất sinh hóa Glu, Lac, H2S, Gas 11 Thạch TSI khảo sát thêm tính chất VK? - Tìm VK lên men Lac chậm đa số VK đường ruột lên men Lac chậm lên men Suc sau ngày 12.Mơi trường citrate khảo sát tính chất VK: - Xem VK có sử citrate nguồn lượng không 13 Chất thị môi trường Citrate Bromothymol Blue 14 Môi trường Urea khảo sát VK có sinh Urease khơng 15 Mơi trường SIM khảo sát VK có sinh H2S, Indole, di động khơng 16 Phản ứng Indole dùng thuốc thử Kovac’s Trắc nghiệm: Công dụng đèn cồn a Khử khuẩn b Diệt khuẩn c Bảo vệ d Tất Khi mở nắp ống nghiệm phải nghiên ống nghiệm góc: a 450 b 900 c 1350 d 1800 Gr(+) khác Gr(-) chỗ: a Lớp lipid b Lớp biểu bì c Lớp peptidoglycan d Lớp mỡ Kích thước VK tính đơn vị: a nm b mm c µm d cm Phương pháp nhuộm Gram gọi phương pháp nhuộm: a Đơn b Kép c Nóng d Lạnh Phương pháp nhuộm Gram màu tương phản là: a Đỏ/hồng b Vàng/đỏ c Tím/xanh d Tím/đỏ Phương pháp nhuộm kháng acid có thành phần thuốc: a Tím/đỏ b Đỏ/xanh c Vàng/hồng d Tím/xanh Mục đích cấy vạch chiều gì? a Nhân chủng VK b Làm tăng số lượng VK c Tách rời khúm VK riêng d Dễ nhận dạng Phương pháp nhuộm kháng acid gọi phương pháp: a Đơn b Kép c Ziehl-Neelsen d Lạnh 10 Khi đọc kết nhuộm Gram: a Hình dạng b Màu sắc c Sắp xếp d Cả 11 Khi đọc kết nhuộm kháng acid: a Hình dạng b Màu sắc c Sắp xếp d Xác định trực khuẩn kháng acid ... chảy ngộ độc thực phẩm Bài 4: Kiểm tra vi sinh khơng khí Cho biết loại VSV mọc môi trường sau: BA cho tất VSV mọc 370C/5-10% CO2/24h MC cho trực khuẩn Gr(-) mọc 370C/24h SA cho vi nấm mọc 370C/72h... 370C/24h SA cho vi nấm mọc 370C/72h Các môi trường dùng để kiểm tra vi sinh không khí là: - BA, MC, SA Kể tên phương pháp kiểm tra vi sinh khơng khí: - Phương pháp lắng bụi Koch - Phương pháp hút bụi... lên mặt thạch đặt máy hút Mục đích kiểm tra vi sinh khơng khí: - Phát VSV gây bệnh qua đường hơ hấp khơng khí - Đánh giá tình trạng vệ sinh sở SX thực phẩm, sở y tế - Đánh giá hiệu biện pháp