HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THANH TÙNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ THỊ DNA PHỤC VỤ CHO XÁC ĐINH CON LAI GIỮA BỊ TĨT (BOS GAURUS) VÀ BỊ NHÀ (BOS TAURUS) TẠI VƯỜN QUỐC GIA PHƯỚC BÌNH, NINH THUẬN Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Văn Sơn TS Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn hồn tồn hồn thiện tìm tòi nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn PGS TS Lê Văn Sơn – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Hữu Đức – khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu, hình ảnh, kết trình bày luận văn trung thực, không chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác mà không rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng nhà trường Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Phạm Thanh Tùng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, nỗ lực phấn đấu thân, tơi nhận nhiều hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, cá nhân, tập thể đơn vị khác Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới thầy giáo PGS TS Lê Văn Sơn TS Nguyễn Hữu Đức dành nhiều thời gian, tâm huyết bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến ThS Lê Hồng Đức phòng Cơng nghệ ADN Ứng Dụng, viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cộng tác giúp hồn thành luận văn Tơi xin cám ơn phòng Cơng nghệ DNA ứng dụng, phòng Cơng nghệ trọng điểm gen, phòng Cơng nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình dạy bảo tơi suốt khố học Lời cuối, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới người thân gia đình ln bên tơi, chăm sóc, động viên tơi tồn thể bạn bè giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Mặc dù tơi có nhiều cố gắng hồn thiện luận văn tất nhiệt tình lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp quý báu quý thầy cô bạn Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Phạm Thanh Tùng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Giả thuyết Khoa học 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Phạm vi nghiên cứu 1.5 Ý nghiã khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan bò tót 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm sinh học phân bố 2.2 Các phương pháp giám định di truyền lai 2.2.1 Phương pháp phân tích rDNA – ITS 2.2.2 Phương pháp phân tích gen ty thể 2.2.3 Phương pháp phân tích gen chức nhiễm sắc thể giới tính 2.2.4 Phương pháp phân tích gen chức nhiễm sắc thể sinh dưỡng 10 2.2.5 Phương pháp phân tích gen sử dụng thị phân tử 10 2.2.6 Microsatellite 11 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 15 3.1 Vật liệu nghiên cứu 15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 iii 3.1.2 Các chủng vi khuẩn, vector sử dụng 15 3.1.3 Hóa chất 15 3.1.4 Thiết bị 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng PCR 16 3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tai 17 3.2.3 Phương pháp PCR với mồi đặc hiệu 17 3.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose: 18 3.2.5 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 18 3.2.6 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 19 3.2.7 Phương pháp tách dòng gen 19 3.2.8 Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp 21 3.2.9 Phương pháp xác định trình tự gen 22 Phần Kết nghiên cứu 23 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số 23 4.2 Kết giám định lai gen Nhiễm Sắc Thể sinh dưỡng số 24 4.2.1 Kết PCR với cặp mồi PGF1/PGR1 PT1F/PT1R 24 4.2.2 Kết so sánh trình tự 25 4.3 Kết giám định bê đực nghi lai gen ZFY NST giới tính Y 26 4.4 Kết giám định bê đực nghi lai thị SSR 28 Phần Thảo luận 32 5.1 Kết tách chiết DNA tổng số 32 5.2 Kết giám định lai gen Nhiễm Sắc Thể sinh dưỡng số 32 5.2.1 Kết PCR với cặp mồi PGF1/PGR1 PT1F/PT1R 32 5.2.2 Kết so sánh trình tự 33 5.3 Kết giám định bê đực nghi lai gen ZFY NST giới tính Y 34 5.4 Kết giám định bê đực nghi lai thị SSR 34 Phần Kết luận kiến nghị 36 6.1 Kết luận 36 6.2 Kiến nghị 36 Tài liệu tham khảo 37 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt SSR Single Simple Repeat rDNA Ribosomal DNA ZFY Zinc finger Y DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction EtBr Ethidium bromide v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 3.2 Thành phần gel polyacrylamide 15% 18 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nối gen vào vector tách dòng 20 Bảng 3.4 Thành phẩn phản ứng colony PCR sử dụng mồi PUC18F/R 21 Bảng 4.1 Kết định lượng DNA tổng số máy đo Nanodrop 23 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bò tót, bò nhà bê lai Hình 2.1 Ảnh bò tót tự nhiên Hình 2.2 Cấu trúc rDNA động vật Hình 2.3 Sơ đồ gene ZFY NST Y Hình 2.4 So sánh đánh giá đặc điểm số thị phân tử 10 Hình 2.5 Một số SSR lặp lại hoàn chỉnh 12 Hình 3.1 Vector tách dòng pBT 20 Hình 4.1 Kết tách DNA tổng số từ mơ tai mẫu bê 23 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR gen POU1F1 cặp mồi PG1FPG1R 24 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR gen POU1F1 cặp mồi PT1F/PT1R 24 Hình 4.4 Kết so sánh trình tự gen POUF1 với mồi PGF1/PGR1 bê đực nghi lai chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế 25 Hình 4.5 Kết so sánh trình tự gen POUF1 với mồi PGF1/PGR1 bê nghi lai số chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế 25 Hình 4.6 Kết so sánh trình tự gen POUF1 bê đực nghi lai với cặp mồi PT1F/PT1R chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế 26 Hình 4.7 Kết so sánh trình tự gen POUF1 bê nghi lai (BL3) với cặp mồi PT1F/PT1R chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế 26 Hình 4.8 Kết PCR gen ZFY 27 Hình 4.9 Kết so sánh trình tự gen ZFY bò tót chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế 27 Hình 4.10 Kết so trình tự gen ZFY bê đực nhà chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế 27 Hình 4.11 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi ETH10 gel polyacrilamide 15% 28 Hình 4.12 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi BM1824 gel polyacrilamide 15% 28 vii Hình 4.13 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi TGLA126 gel polyacrilamide 15% 29 Hình 4.14 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi INRA023 gel polyacrilamide 15% 29 Hình 4.15 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi BM1818 gel polyacrilamide 15% 30 Hình 4.16 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi BM861 gel polyacrilamide 15% 30 Hình 4.17 Kết so sánh trình tự đoạn SSR bê đực nghi lai bê đực nhà phần mềm Bioedit 31 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thanh Tùng Tên Luận văn: “Nghiên cứu số thị DNA phục vụ cho xác đinh lai bò tót (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus) vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận” Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Bò tót (tên khoa học Bos gaurus) động vật thuộc guốc chẵn, họ trâu bò (Bovidae) có lơng màu sẫm kích thước lớn, sinh sống chủ yếu vùng đồi Ấn Độ Đơng Nam Á Hiện nay, Việt Nam khoảng 300 bò tót, phân bố chủ yếu vườn quốc gia Mường Nhé (Điện Biên), vùng rừng núi Tây Nguyên, vườn quốc gia Chư Mom Rây (Kon Tum) vườn quốc gia Cát Tiên (Lâm Đồng), sân bay Phú Bài (Huế) Trong tự nhiên, bò tót thường sống thành đàn từ 8– 10 Khi già, khơng cạnh tranh với bò tót đực trẻ, khỏe đàn nên bò tót đực già thường tách đàn để sống riêng lẻ chúng hội lại thành nhóm bò đực già riêng lẻ Có thể tượng sa thải sinh học mà cuối năm 2009 khu vực Vườn Quốc Gia Phước Bình, có xuất bò tót đực tách bầy, có chiều cao khoảng 1,7 mét, thân dài mét, nặng khoảng 1000 kg nhập bầy với đàn bò nơng dân địa phương [14] Tới năm 2012, sau thời gian bò tót đực sống chung với bò nhà, theo ghi nhận Vườn Quốc gia Phước Bình có số bê cho lai bò tót với bò nhà có số đặc điểm ngoại hình màu lơng bê lai gần giống với bò tót Mục tiêu nghiên cứu sàng lọc số thị DNA phục vụ cho xác định lai bò tót (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus) vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận Từ kết PCR vùng gen quan tâm nhiễm sắc thể giới tính, nhiễm sắc thể thường, đoạn SSR phân tích trình tự gen thu bê nghi lai bê nhà thu kết quả: (i) cặp mồi PCR sử dụng giám định bê nghi lai có độ đặc hiệu cao với lồi bò tót bò nhà, qua sử dụng cặp mồi để phân biệt bê nghi lai với bê nhà.(ii) trình tự gen thu bê nghi lai có độ tương đồng cao so với lồi bò tót, qua khẳng định bê lai F1 bò tót đực (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus) ix 4.2.2 Kết so sánh trình tự Chúng tơi tách dòng gen POUF1 mẫu bò tót, bê đực nghi lai (BL1), bê nghi lai (BL3) Trình tự xác đinh với cặp mồi PGF1/PGR1 cho kết hình 4.4 hình 4.5: Hình 4.4 Kết so sánh trình tự gen POUF1 với mồi PGF1/PGR1 bê đực nghi lai chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế Hình 4.5 Kết so sánh trình tự gen POUF1 với mồi PGF1/PGR1 bê nghi lai số chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế Bên cạnh chúng tơi tách dòng 06 mẫu bê dương tính với mồi PT1F/PT1R Kết xác định so sánh trình tự plasmid mang đoạn gen POUF1 hai mẫu bê đực nghi lai (BL1) bê nghi lai (BL3) giải trình tự với cặp mồi PT1F/PT1R cho kết hình 4.6 4.7 25 Hình 4.6 Kết so sánh trình tự gen POUF1 bê đực nghi lai với cặp mồi PT1F/PT1R chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế Hình 4.7 Kết so sánh trình tự gen POUF1 bê nghi lai (BL3) với cặp mồi PT1F/PT1R chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế 4.3 KếT QUả GIÁM ĐịNH BÊ ĐựC NGHI LAI BằNG GEN ZFY TRÊN NST GIớI TÍNH Y Để phân biệt bê đực nghi lai với bê đực nhà với bê cái, cặp mồi YF1/YR1 thiết kết dựa vùng có trình tự nucleotide khác gen ZFY bò tót (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus) nhằm khuếch đại đoạn gen có kích thước dự kiến 592 bp Kết PCR với mồi YF1/YR1 thể hình 4.8 26 Hình 4.8 Kết PCR gen ZFY M: Marker 1kb; BT: bò tót; BL1: Bê đực nghi lai; BL2, BL3, BL4: Bê nghi lai; BN1: Bê đực nhà; BN2: Bê nhà Các băng DNA xuất mẫu bò tót, bê đực nghi lai bê đực nhà sau tinh sạch, gắn vào vector tách dòng pBT xác định trình tự so sánh xác định độ tương đồng với trình tự cơng bố lồi bò tót bò nhà ngân hàng gen quốc tế chương trình BLAST Hình 4.9 Kết so sánh trình tự gen ZFY bò tót chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế Hình 4.10 Kết so trình tự gen ZFY bê đực nhà chương trình BLAST ngân hàng gen quốc tế 27 4.4 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH BÊ ĐỰC NGHI LAI BẰNG CÁC CHỈ THỊ SSR Hình 4.11 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi ETH10 gel polyacrilamide 15% M: Marker 50bp;(-): Đối chứng âm BT: bò tót; BL1: Bê đực nghi lai; BL2, BL3, BL4: Bê nghi lai; BN1: Bê đực nhà; BN2: Bê nhà Hình 4.12 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi BM1824 gel polyacrilamide 15% M: Marker 50bp;(-): Đối chứng âm BT: bò tót; BL1: Bê đực nghi lai; BL2, BL3, BL4: Bê nghi lai; BN1: Bê đực nhà; BN2: Bê nhà 28 Hình 4.13 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi TGLA126 gel polyacrilamide 15% M: Marker 50bp;(-): Đối chứng âm BT: bò tót; BL1: Bê đực nghi lai; BL2, BL3, BL4: Bê nghi lai; BN1: Bê đực nhà; BN2: Bê nhà Hình 4.14 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi INRA023 gel polyacrilamide 15% M: Marker 50bp;(-): Đối chứng âm BT: bò tót; BL1: Bê đực nghi lai; BL2, BL3, BL4: Bê nghi lai; BN1: Bê đực nhà; BN2: Bê nhà 29 Hình 4.15 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi BM1818 gel polyacrilamide 15% M: Marker 50bp;(-): Đối chứng âm BT: bò tót; BL1: Bê đực nghi lai; BL2, BL3, BL4: Bê nghi lai; BN1: Bê đực nhà; BN2: Bê nhà Hình 4.16 Kết PCR-SSR mẫu nghiên cứu với mồi BM861 gel polyacrilamide 15% M: Marker 50bp;(-): Đối chứng âm BT: bò tót; BL1: Bê đực nghi lai; BL2, BL3, BL4: Bê nghi lai; BN1: Bê đực nhà; BN2: Bê nhà Chúng tiến hành tiếp thí nghiệm sản phẩm PCR mồi BM861 mồi NST giới tính Y Kết điện di sản phẩm PCR với thị SSR30 BM861 gel polyacrylamide 15% hình 4.16 cho thấy mẫu bê không xuất băng DNA khuếch đại, mẫu bò tót bê đực nghi lai xuất băng DNA đặc trưng có kích thước khoảng 170 bp bê đực nhà xuất băng DNA đặc trưng có kích thước khoảng 160 bp Chúng tinh băng DNA khuếch đại mẫu bò tót bê đực nghi lai (~170bp) bê đực nhà (~160bp) gắn vào vector tách dòng pBT để đọc trình tự so sánh phần mềm Bioedit 7.0.5.3 (hình 4.17) Hình 4.17 Kết so sánh trình tự đoạn SSR bê đực nghi lai bê đực nhà phần mềm Bioedit 31 PHẦN THẢO LUẬN 5.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ DNA tổng số từ mẫu mô tai mẫu tách chiết theo phương pháp mô tả điện di kiểm tra gel agarose 1% Từ kết điện di hình 4.1 cho thấy, DNA tổng số thu băng sáng đậm, cho thấy nồng độ DNA tổng số có nồng độ cao Để xác định nồng độ DNA tổng số thu được, mẫu DNA định lượng máy đo Nanodrop (Thermo Scientific), kết thể bảng 4.1 Dựa vào kết bảng 4.1, ta thấy mẫu DNA thu có đủ nồng độ độ tinh để tiến hành thí nghiệm DNA tổng số sau pha lỗng đến nồng độ thích hợp cho phản ứng PCR 50 ng/µl 5.2 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH CON LAI BẰNG GEN TRÊN NHIỄM SẮC THỂ SINH DƯỠNG SỐ 5.2.1 Kết PCR với cặp mồi PGF1/PGR1 PT1F/PT1R Để khẳng định lai có mang nhiễm sắc thể từ bò tót hay khơng, chúng tơi thực phản ứng PCR với cặp mồi PGF1/PGR1 đặc hiệu cho gen POUF1 bò tót DNA mẫu nghiên cứu Kết điện di sản phẩm PCR hình 4.2 cho thấy băng điện di sáng rõ, khơng có băng phụ chứng tỏ phản ứng PCR chuẩn điều kiện tốt Do gen POUF1 nằm nhiễm sắc thể thường nên có mặt đực Ở tất mẫu bò tót bê nghi lai xuất băng DNA có kích thước khoảng 675 bp, chứng tỏ tất mẫu mang nhiễm sắc thể bò tót Mặt khác, sản phẩm DNA không xuất mẫu bò nhà chứng tỏ cặp mồi PG1F/PG1R đặc hiệu để nhân đoạn gen POUF1 bò tót, kết dương tính tin tưởng Chúng tơi tiếp tục kiểm tra lai có mang nhiễm sắc thể bò nhà hay khơng phản ứng PCR với cặp mồi PT1F/PT1R đặc hiệu cho đoạn gen POUF1 bò nhà Kết thể hình Kết điện di sản phẩm PCR hình 4.3 cho thấy băng điện di lên mảnh, sáng rõ, khơng có băng phụ, kích thước khoảng 675 bp (đúng kích thước sản phẩm lý thuyết) chứng tỏ điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi PT1F/PT1R 32 chuẩn thành công Kết điện di cho thấy, băng DNA kích thước 675 bp xuất sáu mẫu bê nghi lai bò nhà khơng xuất mẫu bò tót Như vậy, DNA tổng số mẫu nghiên cứu khuếch đại thành công với cặp mồi PT1F/PT1R, chứng tỏ tất mẫu bê nghi lai mang nhiễm sắc thể bò nhà Từ kết hai phản ứng PCR sơ kết luận bê nghi lai bò tót bò nhà Tuy nhiên, kết ban đầu nhóm nghiên cứu, cần kiểm tra lại lần giải trình tự so sánh với ngân hàng liệu 5.2.2 Kết so sánh trình tự Chúng tơi tách dòng gen POUF1 mẫu bò tót, bê đực nghi lai (BL1), bê nghi lai (BL3) Trình tự xác đinh với cặp mồi PGF1/PGR1 cho kết hình 4.4 hình 4.5 Kết so sánh trình tự đoạn gen POUF1 bê đực nghi lai chương trình BLAST hình 4.4 cho thấy độ tương đồng 99% so với lồi bò tót (Bos gaurus) Tương tự, trình tự đoạn gen POUF1 mẫu bê nghi lai số (BL3) có độ tương đồng 99% so với trình tự cơng bố ngân hàng gen quốc tế lồi bò tót Các mẫu lại cho kết tương tự Kết khẳng định bước tiến hành thành công: từ tách DNA tổng số, PCR đến tách dòng Đoạn mồi thiết kế đảm bảo tính đặc hiệu phản ứng PCR nhân thành cơng đoạn gen mong muốn, góp phần khẳng định bê nghi lai bò tót Bên cạnh chúng tơi tách dòng 06 mẫu bê dương tính với mồi PT1F/PT1R Kết xác định so sánh trình tự plasmid mang đoạn gen POUF1 hai mẫu bê đực nghi lai (BL1) bê nghi lai (BL3) giải trình tự với cặp mồi PT1F/PT1R cho kết hình 4.6 4.7 Kết so sánh trình tự đoạn gen POUF1 bê đực nghi lai (BL1) bê nghi lai số (BL3) chương trình BLAST cho thấy độ tương đồng 99% so với lồi bò nhà (Bos taurus) Các mẫu lại cho kết tương tự Kết khẳng định thấy bê nghi lai mang gen bò nhà hay nói cách khác bê nghi lai bò nhà Từ tất kết trên, chúng tơi khẳng định bê nghi lai bò nhà bò tót 33 5.3 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH BÊ ĐỰC NGHI LAI BẰNG GEN ZFY TRÊN NST GIỚI TÍNH Y Gen ZFY (Zinc Finger Y) gen nằm nhiễm sắc thể Y mã hóa cho loại protein có chứa kẽm, số nghiên cứu trước sử dụng gen ZFY để phân biệt giới tính lồi gia súc bò cừu Để phân biệt bê đực nghi lai với bê đực nhà với bê cái, cặp mồi YF1/YR1 thiết kết dựa vùng có trình tự nucleotide khác gen ZFY bò tót (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus) nhằm khuếch đại đoạn gen có kích thước dự kiến 592 bp Kết PCR với mồi YF1/YR1 thể hình 4.8 Qua kết điện di hình 4.8 cho thấy, mẫu bò tót, bê đực nghi lai bê đực nhà xuất băng DNA khoảng 600 bp, mẫu bê khơng xuất băng DNA, chứng tỏ cặp mồi YF1/YR1 dùng để phân biệt bê bê đực Các băng DNA xuất mẫu bò tót, bê đực nghi lai bê đực nhà sau tinh sạch, gắn vào vector tách dòng pBT xác định trình tự so sánh xác định độ tương đồng với trình tự cơng bố lồi bò tót bò nhà ngân hàng gen quốc tế chương trình BLAST Đoạn gen ZFY khuếch đại mẫu bò tót sau giải trình tự có kích thước 592 bp, qua so sánh với trình tự có sẵn ngân hàng gen quốc tế cho kết độ tương đồng 99% (hình) so với trình tự gen lồi bò tót (Bos gaurus) Mẫu bê đực nghi lai cho kết tương tự Đối với mẫu bê đực nhà, đoạn gen ZFY có kích thước 592 bp sau giải trình tự so sánh với trình tự có ngân hàng gen quốc tế Kết so sánh cho thấy, đoạn gen ZFY bê nhà độ tương đồng 99% so với trình tự cơng bố lồi bò nhà (Bos taurus) Như vậy, khẳng định sử dụng cặp mồi để khuếch đại đoạn gen ZFY nhiễm sắc thể Y phân biệt bê đực nghi lai bê đực nhà với bê cái, phân biệt bê đực nghi lai bê đực nhà 5.4 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH BÊ ĐỰC NGHI LAI BẰNG CÁC CHỈ THỊ SSR Từ kết điện di SSR, nhận thấy mồi ETH10, BM1824, TGLA126 khơng có khác biệt mẫu bò Các mồi BM1818, BM861 mồi INRA023 có khác biệt băng điện di mẫu bò nên có khả làm thị phân biệt bò tót bò nhà 34 Chúng tơi tiến hành tiếp thí nghiệm sản phẩm PCR mồi BM861 mồi NST giới tính Y Kết điện di sản phẩm PCR với thị SSRBM861 gel polyacrylamide 15% hình 4.16 cho thấy mẫu bê không xuất băng DNA khuếch đại, mẫu bò tót bê đực nghi lai xuất băng DNA đặc trưng có kích thước khoảng 170 bp bê đực nhà xuất băng DNA đặc trưng có kích thước khoảng 160 bp Chúng tinh băng DNA khuếch đại mẫu bò tót bê đực nghi lai (~170bp) bê đực nhà (~160bp) gắn vào vector tách dòng pBT để đọc trình tự so sánh phần mềm Bioedit 7.0.5.3 (hình 4.17) Kết so sánh trình tự hình 4.17 cho thấy, đoạn DNA khuếch đại bê đực nghi lai có kích thước 172 bp, đoạn DNA khuếch đại bê đực nhà 156 bp với 16 bp ngắn trình tự GT lặp lại liên tục Sự khác biệt khác đoạn lặp lại đơn giản nhiễm sắc thể Y bò tót nhiễm sắc thể Y bò nhà Do đó, bước đầu kết luận bò đực nghi lai lai bò tót đực bò nhà 35 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 6.1 KẾT LUẬN Từ kết nhân PCR vùng gen quan tâm nhiễm sắc thể giới tính, nhiễm sắc thể thường, đoạn SSR phân tích trình tự gen thu bê nghi lai bê nhà rút kết luận sau: - Các cặp mồi PCR sử dụng giám định bê nghi lai có độ đặc hiệu cao (99%) với lồi bò tót bò nhà, qua sử dụng cặp mồi để phân biệt bê nghi lai với bê nhà - Các trình tự gen thu bê nghi lai có độ tương đồng cao so với lồi bò tót Qua khẳng định bê lai F1 bò tót đực (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus) 6.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục phân tích khác biệt sản phẩm PCR mồi BM1818 mồi INRA023 - Tiếp tục tìm thêm thị gen để phân biệt bò tót bò nhà - Nghiên cứu lai F2 để khẳng định cặp mồi nghiên cứu 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Chính phủ (2006) Nghị định Về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, – Số 32/2006/NĐ-CP, Hà Nội Huỳnh Thị Lệ Duyên (2003) Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh in vitro dùng pcr xác định giới tính phơi heo Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Mạnh Hà (2010) Nghiên cứu số đặc điểm sinh thái bảo tồn lồi bò tót Việt Nam Luận án tiến sĩ nông nghiệp Viện sinh thái tài ngun sinh vật, Hà Nội Phan Trọng Hồng, Nơng Văn Hải, Lê Trần Bình Chu Hồng Hà (2005) Sử dung enzym XcmI để thiết kế vector pBT phục vụ tách dòng đọc trình tự gen, Tạp chí Công nghệ Sinh học (3) tr 459-463 Nguyễn Thị Thu Lan (2002) Thiết lập qui trình xác định giới tính heo (sus scrofa domestica) kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Hồ Chí Minh Sách đỏ Việt Nam - phần động vật (2007) NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội tr 31 Viện di truyền nông nghiệp (1998) Kết nghiên cứu khoa học 1997-1998 NXB Nông nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh: Aasen E., Medrano J.F (1990) Amplification of the ZFY DNA ZFX Genes for sex identification in humans, cattle, sheep DNAgoats Bio-Technology Vol pp 1279-1281 Arkadi P (2004) Cloning DNA comparative analysis of the bovine, porcine, DNA equine sex chromosome genes ZFX DNA ZFY Genome Vol 47 (1) pp 74-83 10 Beuzen N D., M J Stear DNA K C Chang (2000) Molecular markers DNA their use in animal breeding The Veterinary Journal 2000 (160) pp 42-52 11 Bongso T A., M Hilmi, M Sopian DNA S Zulkifli (1988) Chromosomes of Gaur cross domestic cattle hybrids Res Vet Sci Vol 44 (2) pp 251-254 12 Eldridge E F (1985) Cytogenetics of livestock, Avi publishing company, 18 Westport, Connecticut, USA pp 115-122 13 Filipe P., C Joao DNA A Antonio (2008) Identification of Species with DNAbased technology: Current progress DNA challenges Recent patents on DNA & Gene Sequences (2) pp 187-200 37 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Hall T A (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor DNA analysis program for Windows 95/98/NT Nucl Acids Symp Ser (41) pp 95-98 Haqq M C., Donahoe K P (1998) Regulation of sex dimorphism in Mammals Physiol Rev (78) pp 1-33 Joshi S P, P K Ranjekar DNA V S Gupta (1999) Molecular markers in plant genome analysis Current Science Vol 77(2) pp 230-240 Jurka J., Pethiyagoda C (1995) Simple repetitive DNA sequences from primates: compilation DNA analysis J Mol Evol (40) pp 120–126 Litt M., Luty J A (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene Am J Hum Genet (44) pp 397 – 401 Lori-Jayne L., Godfrey M H (2002) Comparison of Substitution Rates in ZFX DNA ZFY Introns of Sheep DNA Goat Related Species Supports the Hypothesis of Male-Biased Mutation Rates J Mol Evol (54) pp 54–61 Mamat-Hamidi K., I Idris DNA M Hilmi (2009) Karyotype of Malayan Gaur (Bos gaurus hubbacki), Sahiwal-Friesian Cattle DNA Gaur x Cattle Hybrid Backcrosses Pakistan J Biol Sci Vol 12 (12) pp 896-901 Nguyen T T., G Sem, L., Bui L C., V Peter, S Gerald, R Jean-Paul, M JeanCharles DNA B X Nguyen (2007) Genomic conservation of cattle microsatellite loci in wild gaur (Bos gaurus) DNA current genetic status of this species in Vietnam BMC Genetics (8) pp 77 Nijman I J., M Otsen, E.L.C VerKaar, C de Ruijter, E Hanekamp, J.W Ochieng, S Shamshad, J.E.O Rege, O Hanotte, M.W Barwegen, T Sulawati DNA J.A Lenstra (2003) Hybridization of banteng (Bos javanicus) DNA zebu (Bos indicus) revealed by mitochondrial DNA, satellite DNA, AFLP DNA microsatellites Heredity (90) pp 10-16 Qing G., James E W (1997) A genetic map of bovine Chromosome with an interspecific hybrid backross panel Mammalian Genome (8) pp 258-261 Sambrook J., E F Fritsch DNA T Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual pp 1051–1067 Somasundaram S., Kalaiselvam M (2007) Molecular tools for assessing genetic diversity Centre of Advanced Study in Marine Biology, Annamalai University, pp 83-91 Taiana R., M Jean-Charles, L D Pham, N Q Le DNA M Johan (2008) Species Identification, Molecular Sexing DNA Genotyping Using Non-invasive Approaches in Two Wild Bovids Species: Bos gaurus DNA Bos javanicus Zoo Biology (0) pp 1–10 38 27 28 29 30 31 32 33 Tautz D (1993) Notes on the definition DNA nomenclature of tDNAemly repetitive DNA sequences DNA fingerprinting: State od science, 67, pp 21-28 Trojanowska M R., Bolibok H (2004) Charateristics DNA comparison of three classes of microsatellite-based markers DNA their application in plants Cellular & molecular biology letters (9) pp 221-238 Tumennasan K.H., T Tuya, Y Hotta, H Takase, R M Speed DNA A ChDNAley (1997) Fertility investigations in the F1 hybrid DNA backcross progeny of cattle (Bos taurus) DNA yak (B grunniens) in Mongolia J Cytogenetic DNA Genome Res Vol 78(1) pp 69-73 Verkaar E.L.C., H Vervaecke, C Roden, M L Romero, M.W Barwegen, T Susilawati, I.J Nijman DNA J.A Lenstra (2003) Paternally inherited markers in bovine hybrid populations Heredity (91) pp 565-569 Weising K., Nybom H (2005) DNA Fingerprinting in plant: Principles, methods DNA application-second editon Ann Bot Vol 97 (3) pp 476–477 Xiao C., T Kimiyuki DNA S Shizuyo (1998) Cloning DNA mapping of bovine ZFX gene to the long arm of the X-Chromosome (Xq34) DNA homologous mapping of ZFY gene to the distal region of the short arm of bovine (Yp34), bovine (Yp12-p13), DNA caprine (Yp12-p13) Y Chromosome Mammalian Genome (9) pp 125-130 Ya-Ping Y., James E W (1997) Construction of a bovine Chromosome 19 linkage map with an interspecies hybrid backcross Mammalian Genome (8) pp 262-266 Tài liệu Internet 34 http://baoninhthuan.com.vn/media/40094p25c151/ninh-thuan-trien- vong-du-anlai-tao-giua-bo-tot-va-bo-nha.html 35 http://tuoitre.vn/chinh-tri-xa-hoi/phong-su-ky-su/491404/nghi-van- bo-tot-lai-bonha.html 36 http://www.iucnredlist.org/ 37 http://vi.wikipedia.org/Bò_tót 39 ... hình màu lơng bê lai gần giống với bò tót Mục tiêu nghiên cứu sàng lọc số thị DNA phục vụ cho xác định lai bò tót (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus) vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận Từ kết PCR... biệt cá thể bò tót, bê nghi lai với bò nhà 1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 01 mẫu cá thể bò tót đực (Bos gaurus), 04 mẫu cá thể bê nghi lai bò tót bò nhà thu vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận gồm bê... Nôi dung nghiên cứu: Sử dụng phương pháp PCR, tách dòng gen, đọc trình tự gen để tìm thị DNA để khẳng định bê nghi lai xác lai bò tót (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus), xác định thị DNA dùng để