BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *** - NGÔ THỊ TUYẾT NHUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen α globin gây bệnh Hemoglobin H” cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu khoa Di truyền Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Trung Ương BS Ngơ Diễm Ngọc trưởng nhóm Tơi nhận đồng ý trưởng nhóm tất thành viên nhóm nghiên cứu việc cơng bố nội dung thực kết thu Các nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn trung thực rõ ràng Xác nhận trưởng nhóm nghiên cứu Học viên Ngơ Thị Tuyết Nhung i LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Trương Quốc Phong, trưởng phòng thí nghiệm Proteomics- Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học- Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo em suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn BS Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa Di truyền Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung Ương tạo đạo điều kiện cho em hoàn thành nghiên cứu Em xin cảm ơn thầy cô môn Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền đạt kiến thức cho em trình học tập rèn luyện Trong thời gian học tập nghiên cứu nhận giúp đỡ tận tình đầy động viên khích lệ tập thể cán nhân viên khoa Di truyền Sinh học phân tử, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối cùng, cho phép tơi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè quan tâm, cổ vũ cho vững bước đường học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 09 Năm 2017 Học viên Ngô Thị Tuyết Nhung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 11 1.1.Lịch sử nghiên cứu bệnh Alpha Thalassemia 11 1.1.1 Thế giới 11 1.1.2.Việt Nam 13 1.2.Cấu trúc phân tử Hemoglobin người bình thường 14 1.2.1.Cấu trúc phân tử Hemoglobin 14 1.2.2.Các dạng Hemoglobin thể 15 1.3.Bệnh Alpha Thalassemia 17 1.3.1 Khái niệm chung bệnh Alpha Thalassemia 17 1.3.2.Dịch tễ học bệnh α Thalassemia 17 1.3.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh α thalassemia 18 1.3.3.1 Người mang gen α thalassemia 19 1.3.3.2 α thalassemia thể nhẹ 19 1.3.3.3 Bệnh Hemoglobin H (HbH) 19 1.3.3.4 Hội chứng phù thai Hemoglobin Bart’s (Hb Bart’s) 19 1.4.Vị trí, cấu trúc chức gen α globin 20 1.4.1 Cụm gen α globin 20 1.4.2 Gen α globin 21 1.5 Chẩn đoán bệnh Alpha Thalassemia 22 1.5.1 Xét nghiệm huyết đồ 22 1.5.1.1 Xét nghiệm công thức máu 22 1.5.1.2 Điện di Hemoglobin 22 1.5.2.Chẩn đoán sinh học phân tử 23 1.5.2.1 Kỹ thuật lai đặc hiệu 24 1.5.2.2 Kỹ thuât khuếch đại alen đặc hiệu (Amplification refractory mutation system- ARMS PCR) 24 1.5.2.3.Kỹ thuật xử lý enzym cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism analysis- RFLP PCR) 25 1.5.2.4 Kỹ thuật GAP-PCR 25 1.5.2.5 Kỹ thuật giải trình tự gen 25 1.5.2.6 Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification - MLPA) 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2.Hoá chất sử dụng 28 2.3.Trang thiết bị 28 2.4.Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Tách chiết ADN 29 2.4.1.1 Tách chiết ADN từ máu ngoại vi[54] 29 2.4.1.2.Tách chiết ADN từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy 30 2.4.1.3 Xác định nồng độ ADN tổng số 30 2.4.2 Phương pháp PCR sàng lọc đột biến thường gặp gene HBA 31 2.4.2.1.Phản ứng Mutiplex Gap PCR sàng lọc đột biến SEA, α3.7, α4.2 31 2.4.2.2.Phản ứng C-ARMS PCR sàng lọc đột biến HbCS, HbQS 33 2.4.3 Phương pháp điện di Agarose 34 2.4.3.1 Nguyên tắc 34 2.4.3.2 Quy trình 34 2.4.4 Phản ứng PCR khuếch đại toàn gene HBA1, HBA2 36 2.4.5 Tinh sản phẩm PCR 37 2.4.6 PCR mồi đơn 37 2.4.7.Tinh BigDye X 39 2.4.8 Phân tích trình tự gene 39 2.4.9 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật Multiplex Gap- PCR 39 2.5.Vấn đề đạo đức nghề nghiệp……………………………………… 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 Đánh giá quy trình kỹ thuật sử dụng để phát đột biến gen  globin 41 3.2 Kết xác định đột biến gen  globin 47 bệnh nhân HbH 44 3.2.1 Kết xác định đột biến đoạn thường gặp kỹ thuật Multiplex Gap- PCR C-ARMS PCR 44 3.2.2 Kết xác định đột biến điểm gặp dạng đoạn kỹ thuật giải trình tự gen bệnh nhân HbH 47 3.2.2.1 Đột biến điểm c.2delT (p.Met1Argfs) gen 2 47 3.2.2.2 Đột biến điểm c.92 GA (p.Arg31Lys) gen 2 48 3.2.2.3.Đột biến điểm c.426 AT(p.Ter142Tyr)- Hb Pakse gen 2 50 3.2.2.4 Đột biến điểm c.81GT(p.Glu27Asp)- Hb Hekinan gen 1 51 3.2.3 Tổng hợp kết tỷ lệ đột biến gen α globin bệnh nhân HbH 52 3.3 Kết chẩn đoán trước sinh 54 3.4 Đối chiếu kết chẩn đoán trước sinh 56 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ý nghĩa Viết tắt / -/ gen hoạt động, người bình thường Dị hợp tử +-thal, người mang gen α+-thalassemia (Silent Carrier) / Dị hợp tử 0-thal, người mang gen α0-thalassemia (Cis) ( thalassemia trait) -/- Đồng hợp tử +-thal, người mang gen α0-thalassemia (Trans)( thalassemia trait) -3.7 Đột biến đoạn gen lệch phải 3.7kb -4.2 Đột biến đoạn gen lệch trái 4.2kb SEA Đột biến đoạn gen dạng South East Asia -HbCS Đột biến điểm Hb Constant Spring (TAA>CAA) -HbQS Đột biến điểm Hb Quong Sze (CTG>CCG) -c.2delT Đột biến điểm ATG>A-G codon ATG gen 2 -c.92 G>A Đột biến điểm AGG>AAG codon 31 gen 2 -c.426 A>T Đột biến điểm TAA>TAT, Hb Pakse -c.81G>T Đột biến điểm GAG>GAT codon 27 gen 1, Hb Hekinan (2β2) Hemoglobin A (2δ2) Hemoglobin A2 (ζ2ε2) Hemoglobin Gower1 (2ε2) Hemoglobin Gower2 (ζ2γ2) Hemoglobin Porland (2γ2) Hemoglobin F β4 Hemoglobin H γ4 Hemoglobin Bart’s C-ARMS-PCR Combine-Amplification Refractory Mutation SystemPolymerase Chain Reaction CO2 Carbon dioxide CO Carbon monoxide GAP-PCR GAP Polymerase Chain Reaction (PCR khoảng cách) Hb Hemoglobin HGB (g/dL) Khối lượng hemoglobin (g/dL) HCT (%) Hematocrit (%) HPFH Hereditary persistence of fetal hemoglobin, Hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai di truyền HPLC High Performance Liquid Chromatography MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification MCV (fL) Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu MCH (pg) Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung bình hồng cầu (pg) O2 Oxygen PCR Polymerase Chain Reaction RBC (1012/L) Red Blood Cells, số lượng hồng cầu TIF Thalassemia International Foundation, Hiệp hội Thalassemia quốc tế WHO World Health Organization, Tổ chức y tế giới DANH MỤC HÌNH Hình1.1: Sơ đồ cấu tạo phân tử Hemoglobin 14 Hình 1.2: Chức vận chuyển oxy phân tử Hemoglobin 15 Hình 1.3: Các chuỗi globin giai đoạn trước sinh, sau sinh 16 Hình 1.4: Hội chứng phù thai Hb Bart’s 20 Hình 1.5: Cấu trúc cụm gen α globin 20 Hình 1.6: Cấu trúc vùng MCS-R cụm gen α globin .21 Hình 1.7: Cấu trúc gen α globin 22 Hình 1.8: Điện di Hemoglobin kỹ thuật HPLC 23 Hình 2.1: Sơ đồ qui trình xác định đột biến  globin gây bệnh Hemoblobin H .29 Hình 2.2: Nguyên lý kỹ thuật GAP-PCR 31 Hình 2.3: Nguyên lý kỹ thuật C- ARMS-PCR 33 Hình 3.1: (A) Điện di sản phẩm Multiplex GAP-PCR, (B) Điện di sản phẩm CARMS-PCR cho 20 mẫu khơng có đột biến gen  globin .41 Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR của:(A) Kỹ thuật Mutiplex GAP-PCR, (B) Kỹ thuật C-ARMS-PCR 20 mẫu có đột biến gen  globin 42 Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR đột biến đoạn thường gặp gen  globin bệnh nhân HbH kỹ thuật Multiplex GAP PCR .44 Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đột biến -HbCS -HbQS kỹ thuật C-ARMS- PCR .45 Hình 3.5 Kết giải trình tự gen  globin phát đột biến điểm c.2delT (p.Met1Argfs) 48 Hình 3.6: Kết giải trình tự gen  globin phát đột biến điểm c.92G>A (p.Arg31Lys) .49 Hình 3.7: Kết giải trình tự gen  globin phát đột biến điểm c.426A>T (p.Term142Tyr) 50 Hình 3.8: Kết giải trình tự gen  globin phát đột biến điểm c.81G>T (p.Glu27Asp) .52 Hình 3.9: Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s kỹ thuật Multiplex GAP PCR 54 Hình 3.10 Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s kỹ thuật CARMS PCR .55 Hình 3.11 Hình ảnh điện di Hemglobin máu cuống rốn thu thập từ thai bị phù mắc Hb Bart’s 57 Bảng 3.4: Kiểu gen 47 bệnh nhân HbH Tên đột biến Kiểu gen HbH dạng đoạn Số BN % 15 31,9 Đột biến đoạn gen lệch phải (-α3.7) SEA/-α3.7 10 21,3 Đột biến đoạn gen lệch trái (-α4.2) SEA/-α4.2 10,6 32 68,1 HbH dạng không đoạn TAACAA codon 142 gen 2 (-HbCS) SEA/-αHbCS 27 57,5 ATGA-G codon ATG gen 2 (-αc.2delT) SEA/-αc.2delT 4,3 CTGCCG codon 125 gen 2 (-c.81G T) SEA/-αc 81G T  2,1 AGGAAG codon 31 gen 2 (-c.92 GA) SEA/-αc.92 GA 2,1 TAATAT codon TAA gen 2 (-c.426 SEA/-αc.426 AT 2,1 47 100 AT ) Tổng Từ bảng 3.4 cho thấy, tổng số 47 bệnh nhân nghiên cứu, có 32/47 (68,1%) người mắc HbH thuộc nhóm đột biến khơng đoạn, 14/47(31,9%) thuộc nhóm đột biến đoạn Người mang kiểu gen ( SEA/-αHbCS) chiếm tỷ l ệ cao nhất: 27/47 (57,5%), người mang kiểu gen ( SEA/-α3.7): 10/47 (21,3%); người mang kiểu gen ( SEA/-α4.2): 5/47(10,6%) Kết phù hợp với số nghiên cứu khác tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc Trong 435 bệnh nhân HbH nghiên cứu tỉnh Quảng Đơng, có 328/435 (75,6%) người mắc HbH thuộc nhóm đột biến khơng đoạn, 107/435 (25.4%) thuộc nhóm đột biến đoạn [ 72] Một nghiên cứu Thái Lan, người mang kiểu gen ( SEA/-αHbCS): 181/355 (51%), người mang kiểu gen ( SEA/-α3.7): 135/355 (38%), tỷ lệ người mang kiểu gen ( SEA/-α4.2) 2/355 (0,6 %) Một nghiên cứu khác Thái Lan Suthat F cộng sự, 355 bệnh nhân nghiên cứu, có 60% thuộc nhóm đột biến khơng đoạn, chiếm tỷ lệ cao SEA/-αHbCS (51%), 40% thuộc nhóm đột biến đoạn Như vậy, kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu 53 3.3 Kết chẩn đoán trước sinh Đối tượng tiến hành chẩn đoán trước sinh bệnh  thalssemia bao gồm 46 thai phụ, 32 thai phụ có nguy sinh mắc bệnh Hb Bart’s 14 thai phụ có nguy sinh mắc bệnh HbH Các thai phụ chốc ối tuần thai thứ 16 đến 18, dịch ối sau nuôi cấy thu hoạch tách chiết ADN Xét nghiệm sàng lọc đột biến thai nhi dựa đột biến biết bố mẹ Hình 3.9: Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s kỹ thuật Multiplex GAP PCR M: Marker 1kb; (1>5): Chứng (1): Bình thường; (2): Dị hợp đột biến ( SEA/αα); (3): -3.7/αα;(4) SEA/-α4.2 (HbH);(5): Đồng hợp đột biến SEA/ SEA (Hb Bart’s);(6, 7): ADN bố mẹ dị hợp SEA/αα; (8): ADN thai bình thường αα /αα; (9):Chứng âm khơng có ADN Kết hình 3.9 cho thấy, mẫu số mẫu chứng bình thường, có băng có kích thước 1800 bp tương ứng với băng 2 bình thường Mẫu số mẫu chứng dị hợp tử đột biến đoạn gen SEA, sản phẩm điện di cho băng kích thước 1800bp tương ứng với băng 2 bình thường băng kích thước 1349bp băng đột 54 biến SEA Mẫu số mẫu chứng dị hợp tử đoạn gen lệch phải -3.7 gồm băng kích thước 1800bp tương ứng với băng 2 bình thường băng kích thước 2022bp đột biến -3.7 Mẫu số mẫu chứng bệnh nhân mắc HbH ( SEA/4.2), gồm băng kích thước 1349 bp đột biến đoạn gen SEA băng kích thước 1628 bp đột biến đoạn gen lệch trái -4.2, khơng có băng 2 Mẫu số mẫu chứng đồng hợp tử đột biến đoạn gen SEA/ SEA (Hb Bart’s), có băng có kích thước 1349 bp đột biến đoạn gen SEA/ SEA , khơng có băng 2 Tương tự mẫu chứng, mẫu 6, 7: mẫu bố mẹ dị hợp tử đột biến SEA; mẫu 8: mẫu thai nhi bình thường Mẫu mẫu khơng chứa ADN (Blank control) Hình 3.10 Hình ảnh điện di chẩn đốn trước sinh bệnh Hb Bart’s kỹ thuật C-ARMS PCR MK: Marker 100bp; M: giếng bị bệnh (mutation), N: giếng bình thường ( Normal)(1>3): Chứng (1): Bình thường; (2): Dị hợp đột biến (-HbCs/αα); (3) Dị hợp đột biến (-HbQs/αα); (4, 5): ADN bố mẹ bệnh nhân; (6): ADN thai nhi bình thường;(7): Chứng khơng có ADN Kết hình 3.10 cho thấy, mẫu số mẫu chứng người bình thường khơng mang đột biến, giếng bình thường có băng đột biến HbCS (183bp) HbQS (138bp), giếng đột biến không xuất băng Mẫu số 2, mẫu chứng dị hợp tử đột biến điểm -HbCS dị hợp tử đột biến điểm -HbQS, băng HbCS 55 HbQS xuất giếng (N), xuất giếng (M) Tương tự, mẫu số 4, 5, mẫu bố, mẹ thai nhi không bị đột biến Giếng mẫu không chứa ADN (Blank control) Kết chẩn đoán trước sinh cho 46 thai phụ thể qua bảng 3.5: Bảng 3.5: Tổng hợp kết chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia Nguy bệnh Số thai Kết chẩn đoán trước sinh N(%) Bình thường Dị hợp tử Thai bệnh Hb Bart’s 32 (100) (28.1) 12 (37.5) 11 (34.4) HbH 14 (100) (21.4) (50) (28.6) Tổng 46 (100) 12 (26.1) 19 (41.3) 15(32.6) Chẩn đoán trước sinh cho tổng số 46 sản phụ, có 32 sản phụ có nguy sinh phù thai Hb Bart’s, 14 sản phụ có nguy sinh mắc HbH Kểt chẩn đoán trước sinh phát tổng số 12 thai khoẻ mạnh (26,1%), 19 thai dị hợp tử (41,3%), 15(32,6%) thai mắc bệnh thể nặng Kết tương tự với kết nghiên cứu Đài Loan thống kê năm 102 thai chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia, phát 29,5% thai bình thường, 47,05% thai dị hợp tử 23,5% thai mắc bệnh [19] Tỷ lệ nghiên cứu Miền Bắc Thái Lan thống kê vòng 16 năm chẩn đốn trước sinh cho 846 thai có nguy mắc Thalassemia thể nặng, thai có nguy với bệnh Hb Bart’s 341/646 (40,3%) Kết phát có 27% thai bình thường, 47,5% thai dị hợp tử, 25,5% thai mắc Hb Bart’s Nghiên cứu khơng cơng bố chẩn đốn trước sinh thai có nguy mắc HbH [71] 3.4 Đối chiếu kết chẩn đoán trước sinh Đối chiếu kết chẩn đoán trước sinh bước cần thiết, giúp cho việc theo dõi, đánh giá, kịp thời đưa biện pháp nâng cao chất lượng, hướng tới việc đưa kết xác nhanh chóng Tuy nhiên, thực tế, bước khó để thực cách tồn diện với đối tượng tham gia chẩn đoán trước sinh, nhiều yếu tố khác Do đó, nghiên 56 cứu chúng tơi có 3/32 thai mắc Hb Bart’s thu thập máu cuống rốn trình đình thai, để đối chiếu với kết chẩn đoán trước sinh Các kết chẩn đoán sau sinh trước sinh hồn tồn phù hợp Hình 3.11 Hình ảnh phân tích Hemoglobin máu cuống rốn thu thập từ thai bị phù mắc Hb Bart’s (A): Công thức máu, (B): Điện di hemoglobin Trong hình 3.11 hình ảnh cơng thức máu phân tích Hemoglobin máu cuống rốn thai phụ đình thai Kết phân tích Hemoglobin cho thấy Hb Bart’s chiếm 100%, phù hợp với kết siêu âm thai bị phù kết chẩn đoán trước sinh thai nhi bị đoạn đồng hợp tử đột biến SEA/ SEA 57 KẾT LUẬN Trong nghiên cứu trên, ứng dụng thành cơng kỹ thuật phân tử chẩn đốn xác định bệnh nhi mắc bệnh Hb H chẩn đoán trước sinh bệnh Alpha thalassemia với kết sau: Xác định kiểu gen 47/47 (100%) bệnh nhi nghi ngờ mắc HbH: Kỹ thuật Multiplex Gap PCR C-ARMS PCR xác định 42/47 (89,6%) đó: kiểu gen ( SEA/-αHbCs) chiếm tỷ l ệ cao nhất: 27/47 (57,5%) Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến điểm gặp lại 5/47 (10,6%), kiểu gen ( SEA/-αc.2delT) đặc trưng cho kiểu gen người Việt Nam Chẩn đoán trước sinh α thalassemia cho 46 thai: Trong 46 thai chẩn đốn trước sinh có 32 thai có nguy mắc Hb Bart’s, 14 thai có nguy mắc HbH Kết chẩn đốn trước sinh phát hiện: thai khơng bị đột biến: 12/46 (26,1%); thai dị hợp tử: 19/46 (41,3%); thai bệnh: 15/46 (32,6%) Các trường hợp có đối chiếu kết chẩn đoán trước sinh với chẩn đốn sau sinh, với thai có định đình máu cuống rốn, cho kết phù hợp 58 KIẾN NGHỊ Phân tích gen  globin kỹ thuật sinh học phân tử phương pháp cần thiết để chẩn đoán xác định đột biến gen Alpha Thalassemia Các cặp vợ chồng có nguy sinh mắc Alpha Thalassemia thể nặng cần chẩn đoán trước sinh tư vấn di truyền 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Khắc Hân Hoan (2013), Nghiên cứu tầm soát chẩn đoán trước sinh bệnh Alpha Beta Thalassemia, Luận văn tiến sỹ, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Khắc Hân Hoan (2008), Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh beta thalassemia bệnh viện Từ Dũ, Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh., 12(1), tr 510 Nguyễn Cơng Khanh cộng (1984), Tình hình bệnh huyết sắc tố người dân tộc miền Bắc Huyết Học Truyền Máu, 2(1), tr 34-38 Trần Thị Thúy Minh (2015), Tỷ lệ mắc kiểu gen bệnh Alpha Beta Thalassemia trẻ em dân tộc Ê Đê M’Nông tỉnh Đăk Lăk, Luận Án Tiến sỹ Y học, ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Trầ n Thùy Ngân (2005), Xác đinh kiể u di truyề n của các đột biế n alpha thalassemia vùng dich ̣ tễ số t rét của tin ̉ h Bin ̀ h Phước bằ ng kỹ thuật PCR, Luận văn tố t nghiệp Cử nhân khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM, tr 31-33 Ngô Diễm Ngọc, Dương Bá Trực, Bùi Văn Viên T T T Hương (2013), Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen alpha globin bệnh alpha thalassemia, Tạp chí nghiên cứu y học, tr 14-18 Ngô Diễm Ngọc, L T T H., Ngô Thị Tuyết Nhung, T T T H Trần Danh Cường (2014), Chẩn đoán trước sinh bệnh alpha thalassemia, Tạp chí nghiên cứu y học, 89(4), tr 8-14 Ngơ Thị Tuyết Nhung (2015), Chẩn đoán bệnh HbH bệnh viện Nhi Trung Ương, Tạp chí Y học Việt Nam, tr Dương Bá Trực (1996), Đặc điểm lâm sàng huyết học bệnh HbH trẻ em Việt Nam, Bước đầu tìm hiểu tần suất bệnh alpha thalassemia Hà Nội, Luận án phó tiến sĩ khoa học Y Dược 60 Tiếng Anh 10 Ahmad R., M Saleem, N S Aloysious, et al (2013), Distribution of alpha thalassaemia gene variants in diverse ethnic populations in malaysia: data from the institute for medical research, Int J Mol Sci, 14(9), pp 18599-18614 11 Alla Joutovsky J H.N., Michael A Nardi (2004), HPLC Retention Time as a Diagnostic Tool for Hemoglobin Variants and Hemoglobinopathies: A Study of 60000 Samples in a Clinical Diagnostic Laboratory, Cllinical Chemistry, 50(5), pp 1736-47 12 Antonarakis S E., H H Kazazian, Jr and S H Orkin (1985), DNA polymorphism and molecular pathology of the human globin gene clusters, Hum Genet, 69(1), pp 1-14 13 Boonsa S., K Sanchaisuriya, G Fucharoen, et al (2004), The diverse molecular basis and hematological features of Hb H and AEBart's diseases in Northeast Thailand, Acta Haematol, 111(3), pp 149-54 14 Can Liao M P., Jin Han, Xin Yang, Li Zhen, Jian Li, Ru Li, Dong-Zhi Li (2014), Prenatal control of Hb Bart’s hydrops fetalis: a two-year experience at a mainland Chinese hospital The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine, 15 Cao A (2002), Carrier screening and genetic counselling in beta-thalassemia Int J Hematol, 76 Suppl 2, pp 105-113 16 Chan A Y., C C So, E S Ma, et al (2007), A laboratory strategy for genotyping haemoglobin H disease in the Chinese, J Clin Pathol, 60(8), pp 931-914 17 Charoenkwan P T R., Sae-Tung R, Thanarattanakorn P, Sanguansermsri T (2005), Molecular and clinical features of Hb H disease in northern Thailand, Hemoglobin, 29(2), pp 133-140 18 Chen F E., C Ooi, S Y Ha, et al (2000), Genetic and clinical features of hemoglobin H disease in Chinese patients, N Engl J Med, 343(8), pp 544-50 61 19 Cheng P J., D C Chu, C H Lee, et al (2003), Prenatal diagnosis of alphathalassemia of Southeast Asian deletion with non-radioactive southern hybridization Chang Gung Med J, 26(1),pp 20-5 20 Chui D H and J S Waye (1998), Hydrops fetalis caused by alphathalassemia: an emerging health care problem Blood, 91(7), pp 2213-22 21 Chong S S., C D Boehm, D R Higgs, et al (2000), Single-tube multiplexPCR screen for common deletional determinants of alpha-thalassemia, Blood, 95(1), pp 360-362 22 Cornelis L., Harteveld D R H (2010), Alpha Thalassemia, Orphanet journal of rare diseases, 1(4), pp 5-13 23 C.N Suemasu E M K., D.M Oliveira, M.A.C Bezerra, A.S Araújo, F.F Costa and M.F Sonati (2011), Characterization of alpha thalassemic genotypes by multiplex ligation-dependent probe amplification in the Brazilian population, Braz J Med Biol Res, 44(1), pp 16-22 24 Fucharoen S C Y., Ratanasiri T, Fucharoen G, Sanchaisuriya K (2003), Complex interaction of Hb Hekinan [alpha27(B8) Glu-Asp] and Hb E [beta26(B8) Glu-Lys] with a deletional alpha-thalassemia in a Thai family, Eur J Haematol, 70(5), pp 304-309 25 Harteveld C L., M Kleanthous and J Traeger-Synodinos (2009), Prenatal diagnosis of hemoglobin disorders: present and future strategies Clin Biochem, 42(18), pp.1767-79 26 Hoan N K H (2005), Thalassaemia and a model of prenvention in Vietnam A thesis of master of medicine, The University of Sydney Sydney,,pp 45-47 27 Harano T H K., Imai N, Ueda S, Seki M (1998), An electrophoretically silent hemoglobin variant, Hb Hekinan [alpha 27(B8)Glu Asp] found in a Japanese, Hemoglobin, 12(1), pp 61-65 28 Helene Puehringer H N., Hai- Yang Law, Walter Krugluger, Vip Viprakasit, Serge Pissard, Erol Baysal, Ali Taher, Chantal Farra, Amein Al-Ali, Suad AlAteeq and Christian Oberkanins (2007), Validation of a reverse-hybridization 62 StripAssay for the simultaneous analysis of common a-thalassemia point mutations and deletions Clin Chem Lab Med, 45(5), pp 605-610 29 He S., Q Zhang, D Li, et al (2014), Prevention and control of Hb Bart's disease in Guangxi Zhuang Autonomous Region, China, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 178(7), pp 138-41 30 He S Z Q., Chen BY, Huang P, Tang YQ, Wei Y, Chen QL, Zheng CG (2015), Genotypes and clinical features of 595 children with HbH disease in Guangxi, China Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi, 17(9), pp 908-911 31 Higgs D.R., M V., AO Wilkie, IM Pretorius, AP Jarman and DJ Weatherall ((2010), A review of the molecular genetics of the human alpha-globin gene cluster, Blood, 73(5), pp 1081-1104 32 Higgs D R (2013), The molecular basis of alpha-thalassemia, Cold Spring Harb Perspect Med, 3(1), pp 011718 33 Higgs D R (1993), Alpha-Thalassaemia., Baillieres Clin Haematol, 6(1), pp 117-50 34 Higgs D R., L Pressley, B Aldridge, et al (1981), Genetic and molecular diversity in nondeletion Hb H disease, Proc Natl Acad Sci U S A, 78(9), pp 5833-7 35 Higgs D R and W G Wood (2008), Long-range regulation of alpha globin gene expression during erythropoiesis, Curr Opin Hematol, 15(3), pp 176-83 36 Ho S S., S S Chong, E S Koay, et al (2007), Microsatellite markers within -SEA breakpoints for prenatal diagnosis of HbBarts hydrops fetalis, Clin Chem, 53(2), pp 173-9 37 John Old J T S., Renzo Galanello, Mary Petrou, Miachael Angastiniotis (2013), Prevention of Thalassemia and other Hemoglobin Disorders, Thalassemia international federation publications 38 J.Weatherall D (2010), Haemoglobin and the Inherited Disorders of Globin Synthesis, Postgraduate Haematology, Sixth edition, 6, pp 85-102 63 39 JM O (2003), Screening and genetic diagnosis of haemoglobin disorders, Blood Rev, 17(2),pp 43-53 40 Kutlar F., T V Adamkiewicz, R B Markowitz, et al (1998), An alpha-2 globin gene initiation codon mutation in a Vietnamese patient with Hb H disease, Ann N Y Acad Sci, 850(1), pp 398-400 41 Laosombat V., V Viprakasit, T Chotsampancharoen, et al (2009), Clinical features and molecular analysis in Thai patients with HbH disease, Ann Hematol, 88(12),pp 1185-92 42 Leung K Y., C P Lee, M H Tang, et al (2004), Cost-effectiveness of prenatal screening for thalassaemia in Hong Kong, Prenat Diagn, 24(11), pp 899-907 43 Lin T.-P C.-C L.-S C.-G C.-J T.-F (2002), PCR-Based Analysis of αThalassemia in Southern Taiwan, International Journal of Hematology, 4(2), pp 75-227 44 Liu JZ H H., Schouten JP, Wang LR, Fan XP, Duarte HB, Zhu CJ, Cai R, Xiao B, Wang QT (2008), Detection of alpha-thalassemia in China by using multiplex ligation-dependent probe amplification, Hemoglobin, 32(6), pp 561571 45 Ltd J W S (2014), Complications of HbH disease in adulthood British Journal of Haematology, 127(2),pp 127-146 46 Minnich V., S Na-Nakorn, S Chong-Chareonsuk, et al (1954), Mediterranean anemia; a study of thirty-two cases in Thailand, Blood, 9(1), pp 1-23 47 Merault G K L., Desfontaines L, Saint-Martin C, Blouquit Y, Rosa J, Galacteros F (1989), Hemoglobin Hekinan [alpha (2)27(B8)Glu Asp beta 2] detected in Guyana, Hemoglobin 13(4), pp 397-402 48 Milner P F., J B Clegg and D J Weatherall (1971), Haemoglobin-H disease due to a unique haemoglobin variant with an elongated alpha-chain, Lancet, 1(7702), pp 729-32 64 49 Morle F., J Starck and J Godet (1986), Alpha-thalassemia due to the deletion of nucleotides -2 and -3 preceding the AUG initiation codon affects translation efficiency both in vitro and in vivo, Nucleic Acids Res, 14(8), pp 3279-92 50 MRC-Holland (2011), SALSA MLPA kit P140-B4 HBA MRC-Holland Amsterdam, pp 1-7 51 Ottolenghi S., W G Lanyon, J Paul, et al (1974), The severe form of alpha thalassaemia is caused by a haemoglobin gene deletion, Nature, 251(5474), pp 389-92 52 Pichanun D M T., Klamchuen S, Butthep P, Winichagoon P, Fucharoen S, Svasti S (2010), Molecular screening of the Hbs Constant Spring (codon 142, TAA>CAA, α2) and Paksé (codon 142, TAA>TAT, α2) mutations in Thailand, Hemoglobin , 34(6),pp 582-586 53 Pornprasert S P S., Treesuwan K (2012), Unmasking Hb Paksé (codon 142, TAA>TAT, α2) and its combinations in patients also carrying Hb Constant Spring (codon 142, TAA>CAA, α2) in northern Thailand, Hemoglobin., 36(5),pp 491-496 54 Qiagen (2010), QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook (3rd ed.), pp 27-29 55 Saiki R K., P S Walsh, C H Levenson, et al (1989), Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes, Proc Natl Acad Sci U S A, 86(16), pp 6230-4 56 Sanger F., S Nicklen and A R Coulson (1992), DNA sequencing with chainterminating inhibitors 1977, Biotechnology, 24(1),pp 104-108 57 Singsanan S., G Fucharoen, O Savongsy, et al (2007), Molecular characterization and origins of Hb Constant Spring and Hb Pakse in Southeast Asian populations, Ann Hematol, 86(9), pp 665-9 58 Sriroongrueng W, Pornpatkul M, Panich V, Fucharoen S.(1997), Alphathalassemia incidence in southern Thailand by restriction endonuclease analysis 65 of globin DNA from placental blood at Songklanagarind Hospital, Southeast Asian J Trop Med Public Health, 3, pp.93-96 59 Shih HC S M., Chang YC, Peng CT, Chang TJ, Chang JG (2007), Hb Hekinan in a Taiwanese subject: a G >T substitution at codon 27 of the alpha1-globin gene abolishes an HaeIII site, Hemoglobin, 31(4), pp 495-498 60 Somsri Wiwanitkit V W (2014) Hemoglobin Pakse: prevalence and geographical distribution Asian Pac J Trop Dis, 4(5)-401-3 61 Souza A E., G L Cardoso, S Y Takanashi, et al (2009), Alpha-thalassemia (3.7 kb deletion) in a population from the Brazilian Amazon region: Santarem, Para Stat, Genet Mol Res, 8(2), pp 477-81 62 Splitt A M U., Windyga J, Kościelak J (2010) Application of mPCR and MLPA in diagnostics of alpha-thalassaemia Przegl Lek., 67(7)-460-464 63 Tri N A (2012), Viet Nam - Current Situation in Control Strategies and Health Systems in Asia, Health and Medicine 64 Tongsong T., P Charoenkwan, P Sirivatanapa, et al (2013), Effectiveness of the model for prenatal control of severe thalassemia, Prenat Diagn, 33(5), pp 477-83 65 Vichinsky E P (2005), Changing patterns of thalassemia worldwide, Ann N Y Acad Sci, 1054(1), pp 18-24 66 Viprakasit V T V., Pung-Amritt P, Petrarat S, Suwantol L, Fisher C, Higgs DR (2002), Clinical phenotypes and molecular characterization of Hb H-Paksé disease, hematologica, 87(2), pp 117-125 67 Waye J S., B Eng, M Patterson, et al (1997) Novel mutation of the alpha 2globin gene initiation codon (ATG >A-G) in a Vietnamese girl with Hb H disease Hemoglobin, 21(5)-469-72 68 White SJ V G., Kriek M, Wuyts W, Schouten J, Bakker B, et al (2004), Twocolor multiplex ligation-dependent probe amplification: detecting genomic rearrangements in hereditary multiple exostoses, Hum Mutat, 24(4), pp 86-92 66 69 Weatherall DG C J (2001), The Thalassaemia Syndromes, Fourth Edition, 4th edn Oxford: Blackwell Science, 70 Xu Y W., Y H Zeng, J Deng, et al (2009), Preimplantation genetic diagnosis for alpha-thalassaemia in China, J Assist Reprod Genet, 26(7), pp 399-403 71 Yamsri S., K Sanchaisuriya, G Fucharoen, et al (2010), Prevention of severe thalassemia in northeast Thailand: 16 years of experience at a single university center, Prenat Diagn, 30(6), pp 540-6 72 Yin XL, Zhang XH, Zhou TH,et al (2010), Hemoglobin H disease in Guangxi province, Southern China: clinical review of 357 patients, Acta Haematol,124(2), pp 86–91 73 Zao Y (2001), Alpha 2CD31AGG AAG Arg Lys causing non-deletional, Hemotologica, 86(3),pp 541-542 74 Zhao W W J., Webber BB, Kutlar A, Tamagnini GP, Kuam B, Huisman TH (1990), Hb Hekinan observed in three Chinese from Macau; identification of the GAG GAT mutation in the alpha 1-globin gene, Hemoglobin, 14(6), pp 627-635 67 ... Luận văn Ứng dụng kỹ thuật sinh h c phân tử phát đột biến gen α globin gây bệnh Hemoglobin H cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu khoa Di truyền Sinh h c phân tử, Bệnh viện Nhi Trung Ương... bệnh α thalassemia Vì vậy, chúng tơi tiến h nh nghiên cứu đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh h c phân tử phát đột biến gen α globin gây bệnh Hemoglobin H Mục tiêu đề tài: - Ứng dụng kỹ thuật sinh h c. .. khác kèm theo 1.3.3.3 Bệnh Hemoglobin H (HbH) Bệnh HbH thường gặp bệnh nhân mang dị h p tử kép hai đột biến gen α globin, có đột biến đoạn hai gen đột biến đoạn gen Ở bệnh nhân này, chuỗi α globin