TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC NI CẤY DỊNG TẾ BÀO SF9 CỦA SÂU KHOANG (Spodoptera frugiperda) GVHD TS Nguyễn Hữu Đức Học viên Nguyễn Hữu Giới Nguyễn Thị Minh Hiền Nguyễn Thị Nhã Phạm Thị Hải Đỗ Thị Thủy Đinh Thị Thanh Tâm Lê Duy Trung HÀ NỘI – Tháng 3/2014 NỘI DUNG SF9 gì? Mục đích ni cấy Các phương pháp nuôi cấy tế bào SF9 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy tế bào Kết luận Tài liệu tham khảo SF9  Được tạo từ dòng tế bào IPLB-Sf-21-AE Cherry Smith trường ĐH Texas A &M Dòng tế bào IPLB-Sf-21-AE phân lập từ năm 1970 từ mơ buồng trứng nhộng lồi Spodotera frugipera  Đặc điểm: + Kích thước tế bào nhỏ, đồng giúp việc hình thành lớp đơn mảng + Phát triển tốt lớp đơn +Thích ứng với mơi trường huyết Mục đích • Dòng tế bào Sf9 dễ bị nhiễm virus, có mặt nhiều nhân Autographa california (AcNPV baculovirus), sử dụng vecto biểu với tất baculovirus • Tế bào Sf9 thường sử dụng để tách lan truyền baculoviral tái tổ hợp để sản xuất protein tái tổ hợp Nuôi cấy tế bào Sf9 Giải đông tế bào Môi trường Cấy truyền tế bào lớp đơn Các yếu tố ảnh hưởng Nuôi cấy huyền phù tế bào Đông lạnh tế bào Mơi trường Rã đơng tế bào • Lấy tế bào khỏi lớp Nito lỏng băng khô rã đông nước ấm 37oC không phút • Tế bào sau rã đông đưa vào ống ly tâm ly tâm 2000v/phút – 10 phút Sau ly tâm gạn lấy dịch đưa vào môi trường nuôi cấy tủ ấm 27 oC để tế bào bám dính 30 - 45 phút • Sau tế bào bám dính loại bỏ mơi trường (sử dụng DMSO) • Ni tế bào mơi trường • Sau 24h thay mơi trường làm cho khả sống lại tế bào đạt 70 % Tiếp tục nuôi tủ ấm khí tế bào hình thành lớp đơn sau tiến hành cấy truyền Cấy chuyền tế bào lớp đơn Các bước tiến hành Vật liệu thiết bị Một số lưu ý Cấy truyền tế bào lớp đơn Vật liệu  Các bình tế bào sơ cấp  Môi trường nuôi cấy Grace TNM-FH  Dụng cụ thí nghiệm: ống vơ trùng 15ml, pipet, đầu cơn, tủ ấm 37oC, bình ni  Dung dịch đệm DPBS (Phosphate Buffered Saline Dulbecco) không chứa Ca, Mg phenol đỏ  Trypsin Các bước thực  Loại bỏ mơi trường cũ từ bình tế bào sơ cấp  Rửa TB dung dịch DPBS (khoảng 2ml cho 10cm2 diện tích bề mặt)  Rửa để loại bỏ dung dịch DPBS  Bổ sung Trypsin khoảng 0,5ml cho 10cm2 bề mặt  Ủ bình mơi trường nhiệt độ phòng phút  Quan sát kính hiển vi thấy TB tách < 90% TB tăng thời gian ủ, Kiểm tra sau 30s Khi >90% TB tách thí nghiêng bình để TB nước Bổ sung tương đương thể tích mơi trường tăng sinh trước ủ ấm Loại bỏ môi trường bề mặt lớp tế bào pipet nhiều lần 10 Các bước thực  Chuyển TB vào bình tam giác 15ml ly tâm 2000xg – 10 phút  Cho lượng nhỏ dịch huyền phù TB vào môi trường nuôi cấy loại bỏ mẫu để đếm  Xác định tổng số TB  Pha loãng dịch huyền phù với mật độ phù hợp cho dòng TB Dùng pipet lấy lượng thích hợp cho vào bình ni cho vào tủ ấm 11 Một số lưu ý 12 Nuôi cấy huyền phù tế bào 13 Vật liệu thiết bị  Tế bào Sf9 lớp đơn  Mơi trường ni cấy Grace TNM-FH  Bình spinner  Tủ ấm 27oC  Máy khuấy từ Than h khuấ y 14 Cánh quạt thẳng đứng Các bước tiến hành  Các TB lớp đơn pha log đạt mật độ x106 TB /ml  Loại bỏ TB từ bình, đếm TB để đảm bảo khả tồn TB 95%  Giống tiếp phải sạch, không nhiễm đạt mật độ x 106 TB/ml  Ủ bình spinner nhiệt độ 27oC khuấy liên tục 80 – 90 rpm  Khi TB đạt mật độ 2-2,5 x106 TB /ml bổ sung thêm mơi trường để pha lỗng để mật độ TB đạt 1x106 TB /ml khoảng 24 – 72 h Cần kiểm tra mật độ khả sống cử TB hàng ngày Khi TB đạt mật độ cho phép chuyển sang bình spinner tích lớn 15 Các lưu ý  Lưu giữ TB mật độ TB đạt 2-2,5 x106 TB /ml phải đảm bảo mật độ Tb không lớn 4x106 TB /ml phải giữ mật độ TB pha log x106 TB /ml  Không cần thay đổi môi trường nuôi TB Cần loại bỏ TB bổ sung thêm mơi trường để pha lỗng đến mật độ TB thích hợp cung cấp thêm dinh dưỡng  Duy trì TB 27oC tránh chỗ ẩm  Sử dụng chất có hoạt tính bề mặt để giảm phá vỡ TB lực quay cánh quạt Pluronic® F-68 (BASF) với nồng độ 0,1 % 16 Đông lạnh TB  Đông lạnh TB nồng độ cao Mật độ TB đông lạnh 1x107 TB/ml khả sống 90%  Luôn sử dụng môi trường đông lạnh khuyến cáo Mơi trường đơng lạnh có chứa chất bảo quản lạnh DMSO glycerol  Sử dụng ống trữ lạnh để lưu giữ TB Các ống giữ nitơ lỏng pha khí nitơ lỏng  Các thiết bị phải vô trùng 17 Vật liệu  Dịch nuôi cấy chứa TB sinh trưởng pha log  Môi trường đông lạnh chứa 60% môi trường Grace 30% FBS 10% DMSO  Các chất dùng bảo quản lạnh DMSO glycerol  Các ống vô trùng dùng lần 15ml – 50 ml  Các ống trữ lạnh vô trùng  Các thiết bị điều chỉnh lạnh buồng isopropanol  Thùng chứa ni tơ lỏng 18 Các bước tiến hành  Chuẩn bị môi trường đông lạnh giữ – 8oC sử dụng Đối với TB lớp đơn, nhẹ nhành tách TB khỏi bình ni cấy Xác định TB tổng số, tùy theo mật độ TB mong muốn để tính tốn lượng môi trường đông lạnh Ly tâm dịch huyền phù TB 1000- 2000xg – 10 phút Gạn lấy dịch  Đưa dịch vào môi trường đông lạnh với mật độ thích hợp Phân chia dịch huyền phù TB vào ống trữ lạnh Đông lạnh TB thiết bị điều chỉnh nhiệt độ làm lạnh ,giảm nhiệt độ khoảng 1oC phút Ngoài đạt ống trữ lạnh chứa TB buồng isopropanol giữ -80oC qua đêm Chuyển tế bào đông lạnh vào nitơ lỏng, lưu trữ chúng giai đoạn khí nitơ lỏng 19 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy TB sf9 20 Kết luận  Tế bào Sf9 có kích thước đồng đều, dễ thao tác, hình thành tốt lớp đơn mảng TB  Các dòng tế bào trùng Sf9 dòng tế bào dễ ni cấy, khơng cần CO2 thích hợp với mơi trường có bổ sung huyết 21 Tài liệu tham khảo  O'Reilly, D R., Miller, L K., and Luckow, V A (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (New York, N Y.: W H Freeman and Company)  Vaughn, J L., Goodwin, R H., Tompkins, G J., and McCawley, P (1977) The Establishment of Two Cell Lines from the Insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) In Vitro 13, 213-217  Wickham, T J., Davis, T., Granados, R R., Shuler, M L., and Wood, H A (1992) Screening of Insect Cell Lines for the Production of Recombinant Proteins and Infectious Virus in the Baculovirus Expression System Biotechnol Prog 8, 391-396 22 CÁM ƠN SỰ CHÚ Ý LẮNG NGHE CỦA THẦY GIÁO VÀ CÁC BẠN 23 ... % 16 Đông lạnh TB  Đông lạnh TB nồng độ cao Mật độ TB đông lạnh 1x107 TB/ml khả sống 90%  Luôn sử dụng môi trường đông lạnh khuyến cáo Mơi trường đơng lạnh có chứa chất bảo quản lạnh DMSO glycerol... Grace 30% FBS 10% DMSO  Các chất dùng bảo quản lạnh DMSO glycerol  Các ống vô trùng dùng lần 15ml – 50 ml  Các ống trữ lạnh vô trùng  Các thiết bị điều chỉnh lạnh buồng isopropanol  Thùng chứa... trường đơng lạnh với mật độ thích hợp Phân chia dịch huyền phù TB vào ống trữ lạnh Đông lạnh TB thiết bị điều chỉnh nhiệt độ làm lạnh ,giảm nhiệt độ khoảng 1oC phút Ngoài đạt ống trữ lạnh chứa