Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường các tế bào có khả năng xâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác của cơ thể. Là quá trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu quả từ sự tích lũy tăng dần của đột biến gen, đột biến ngoài gen và kết quả bất thường trong con đường tín hiệu nội bào Wnt. Số bệnh nhân bị CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo thời gian. Những năm gần đây, đã có nhiều phương pháp mới, tiến bộ áp dụng điều trị CRC như: liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích, liệu pháp sử dụng các hạt nano, …. Mặc dù có các phương pháp điều trị mới với nhiều hứa hẹn, nhưng kết quả vẫn chỉ là kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tiên lượng bệnh nhân CRC đã di căn sống trên 5 năm chỉ dưới 20%. Sự phát triển của sinh học phân tử đã cho chúng ta hiểu biết hơn về cơ chế bệnh ung thư và virus. Các nhà khoa học đã tạo ra các chủng virus có khả năng lây nhiễm và ly giải chọn lọc các tế bào ung thư, kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng ung thư. Sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị ung thư là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành. OV có nhiều lợi thế hơn so với các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như: giảm độc tính tác dụng phụ, có khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư, là một phương thức tự khuếch đại các hoạt động kháng u bằng cách virus tự nhân lên ly giải tế bào u lan rộng. Hiện nay, với sự phát triển về sinh học phân tử, các nhà khoa học có thể thiết kế bộ gen của virus nhằm tăng khả năng lây nhiễm và ly giải tế bào ung thư đặc hiệu cũng như kiểm soát được mức độ virus nhân lên trong cơ thể. Liệu pháp sử dụng các chủng virus vaccine sởi (MeV) và virus vaccine quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người đã được chứng minh có hiệu quả. Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng các virus này bằng các con đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều loại ung thư như: u lympho tế bào T ở da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng… đã được báo cáo là có kết quả khả quan (bảng 1.1). Trong nhiều năm qua, các chương trình tiêm chủng mở rộng với quy mô toàn cầu bằng MeV và MuV sống, giảm độc lực cũng đã rất thành công, thiết lập 1 hồ sơ an toàn rộng khắp thế giới. Các chủng MeV và MuV rất khó gây bệnh trở lại vì hầu hết mọi người đều đã được chủng ngừa. Bên cạch đó, hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ. Sử dụng MeV và MuV điều trị ung thư là liệu pháp có tiềm năng đang được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước phát triển. Nhưng cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu đánh giá hiệu quả sử dụng phối hợp MeV và MuV điều trị ung thư đại tràng người. Nghiên cứu phối hợp MeV với MuV kháng ung thư đại tràng người trên thực nghệm sẽ mở đầu cho việc đi sâu nghiên cứu, áp dụng một phương pháp mới điều trị ung thư đại tràng người. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm” với mục tiêu sau: 1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro. 2. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ DUY CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên tăng bất thường tế bào có khả xâm lấn hay lan rộng vào phận khác thể Là trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu từ tích lũy tăng dần đột biến gen, đột biến gen kết bất thường đường tín hiệu nội bào Wnt Số bệnh nhân bị CRC số ca tử vong CRC tăng theo thời gian Những năm gần đây, có nhiều phương pháp mới, tiến áp dụng điều trị CRC như: liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích, liệu pháp sử dụng hạt nano, … Mặc dù có phương pháp điều trị với nhiều hứa hẹn, kết kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tiên lượng bệnh nhân CRC di sống năm 20% Sự phát triển sinh học phân tử cho hiểu biết chế bệnh ung thư virus Các nhà khoa học tạo chủng virus có khả lây nhiễm ly giải chọn lọc tế bào ung thư, kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng ung thư Sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị ung thư phương thức biến chép virus thành vũ khí tiêu diệt tế bào ung thư không ảnh hưởng đến tế bào lành OV có nhiều lợi so với phương pháp điều trị ung thư truyền thống như: giảm độc tính tác dụng phụ, có khả áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư, phương thức tự khuếch đại hoạt động kháng u cách virus tự nhân lên ly giải tế bào u lan rộng Hiện nay, với phát triển sinh học phân tử, nhà khoa học thiết kế gen virus nhằm tăng khả lây nhiễm ly giải tế bào ung thư đặc hiệu kiểm soát mức độ virus nhân lên thể Liệu pháp sử dụng chủng virus vaccine sởi (MeV) virus vaccine quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người chứng minh có hiệu Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng virus đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều loại ung thư như: u lympho tế bào T da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng… báo cáo có kết khả quan (bảng 1.1) Trong nhiều năm qua, chương trình tiêm chủng mở rộng với quy mơ tồn cầu MeV MuV sống, giảm độc lực thành cơng, thiết lập hồ sơ an tồn rộng khắp giới Các chủng MeV MuV khó gây bệnh trở lại hầu hết người chủng ngừa Bên cạch đó, hầu hết nghiên cứu lâm sàng tiền lâm sàng chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư an tồn tác dụng phụ Sử dụng MeV MuV điều trị ung thư liệu pháp có tiềm quan tâm nghiên cứu nhiều nước phát triển Nhưng chưa có nghiên cứu sâu đánh giá hiệu sử dụng phối hợp MeV MuV điều trị ung thư đại tràng người Nghiên cứu phối hợp MeV với MuV kháng ung thư đại tràng người thực nghệm mở đầu cho việc sâu nghiên cứu, áp dụng phương pháp điều trị ung thư đại tràng người Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người virus vaccine sởi quai bị thực nghiệm” với mục tiêu sau: Đánh giá khả gây độc tế bào chết tế bào theo chương trình (apoptosis) phối hợp virus vaccine sởi quai bị dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro Đánh giá hiệu kháng u phối hợp virus vaccine sởi quai bị mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung OV gần công nhận phương pháp điều trị ung thư có nhiều hứa hẹn OV virus tự nhiên virus biến đổi gen, có khả nhân lên giết chết tế bào ung thư cách chọn lọc mà không làm tổn hại tế bào bình thường xung quanh Khác với liệu pháp gen, OV không đơn chất mang gen trị liệu, tác nhân thuốc điều trị ung thư Giả thuyết nhiễm virus kháng ung thư bắt đầu phát khối u bị thoái triển sau nhiễm virus [1] Năm 1949, có 22 bệnh nhân bị bệnh Hodgkin điều trị chế phẩm chiết xuất từ huyết mơ có chứa virus viêm gan, kết cho thấy virus làm thoái triển khối [2] Từ năm 1950 đến 1980, thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư thực chủng virus hoang dã virus tự nhiên, giảm độc lực, bao gồm virus viêm gan, virus West Nile, virus dengue adenovirus… [3] Tuy nhiên, loại virus chưa thực chứng minh hiệu điều trị, chưa kiểm sốt độc tính với thể mức độ virus nhân lên tế bào ung thư Hiện nay, OV công nhận phương pháp điều trị ung thư Để tăng cường cho virus nhân lên ly giải đặc hiệu tế bào ung thư, nhà nghiên cứu lựa chọn loại virus không gây bệnh cho người lại có khả nhằm đích tế bào ung thư, biến đổi gen virus để tăng cường khả nhằm đích tế bào ung thư Đại diện cho chiến lược virus chủng reolysin, biến thể reovirus, có thuộc tính ly giải tế bào u thơng qua hoạt hóa tín hiệu RAS, hạn chế mức độ gây độc cho tế bào bình thường Vào năm 1994, Mineta T cộng chúng minh chủng virus herpes simplex hrR3 đột biến mang gen lacZ Esckerichia coli, có khả điều trị khối u não in vivo hiệu nhiều so với chủng hoang dã [4] Tác giả theo dõi chủng virus nhân lên tốt tế bào ung thư não khơng có độc tính với tế bào lành Phát mở lĩnh vực thiết kế biến đổi gen OV làm tăng hiệu ly giải tế bào u OV phát triển mạnh mẽ suốt ba thập kỷ qua, phát quan trọng trình hoạt động ly giải tế bào ung thư OV có khả tạo miễn dịch đặc hiệu chống khối u [5] Hiện nay, vấn đề công nhận tính quan trọng liệu pháp OV Có hai chủng virus biến đổi gen chấp thuận để tiếp thị dạng thuốc: Oncorine (H101) hay ONYX-015, Adenovirus bị đoạn gen E1B, quan có thẩm quyền phê duyệt cho điều trị ung thư đầu, cổ ung thư thực quản Trung Quốc năm 2005 [6] Cho đến nay, việc sử dụng Oncorine lâm sàng hạn chế Hai T-Vec, chủng virus herpes biến đổi gen, cục quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ chấp thuận cho điều trị u tế bào hắc tố vào tháng 10 năm 2015, sau phê duyệt Châu Âu vào tháng năm 2016 Úc vào tháng năm 2016 [7] Nhiều thử nghiệm T-Vec lâm sàng cơng ty dược phẩm thực tồn giới nhằm mở rộng ứng dụng thị trường Trong số chủng virus ly giải tế bào ung thư, chủng MeV MuV cho thấy có nhiều tiềm chống ung thư Đến nay, MeV MuV chứng minh có khả kháng nhiều loại tế bào ung thư có CRC in vitro, in vivo lâm sàng giai đoạn khác Ngồi tính lựa chọn đặc hiệu tế bào ung thư, MeV MuV kích hoạt mạnh đáp ứng miễn dịch vật chủ góp phần quan trọng vào hiệu ly giải tế bào ung thư [8], [9] 1.2 Ung thư đại trực tràng 1.2.1 Tình hình ung thư đại trực tràng CRC gánh nặng sức khỏe lớn cho cộng đồng Trên giới, loại ung thư phổ biến thứ ba nam giới phổ biến thứ hai nữ giới, nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong liên quan đến ung thư Trong năm 2017, ước tính có khoảng 95.520 trường hợp ung thư đại tràng 39.910 trường hợp ung thư trực tràng chẩn đoán Mỹ Trong số liệu cho thấy ung thư đại tràng nam giới (47.700 trường hợp) nữ giới (47.820 trường hợp) nhau, ung thư trực tràng nam giới (23.720 trường hợp) lại cao nữ giới (16.190 trường hợp) Tỷ lệ mắc bệnh cao thổ dân Alaska (91/100.000 người), người Mỹ gốc Phi (49/100.000 người), thấp người Mỹ gốc Á người dân đảo Thái Bình Dương (32/100.000 người) Ước tính có 27.150 bệnh nhân nam giới 23.110 nữ giới chết CRC vào năm 2017 [10] Tỉ lệ mắc CRC đa dạng tuổi, chủng tộc, sắc tộc kiểu mắc Ở nước thu nhập cao, tỉ lệ ung thư đại tràng cao ung thư trực tràng tăng khởi phát sau tuổi 50 đặc trưng ung thư trực tràng Tỷ lệ mắc CRC có xu hướng trẻ hóa người mắc Tỉ lệ mắc CRC tiếp tục giảm người từ 50 tuổi trở lên (giảm 32% kể từ năm 2000) Có xu hướng sàng lọc CRC có hiệu quả, ngăn ngừa CRC sớm cách phát loại bỏ polyp tiền ung thư Tỷ lệ mắc CRC giảm nhanh người từ 65 tuổi trở lên khối u nằm đại tràng xa Trong tỷ lệ giảm chậm người từ 50-64 tuổi khối u trực tràng (giảm 9% tỷ lệ mắc khối u trực tràng nam giới từ 50-64 tuổi giảm không đáng kể phụ nữ độ tuổi này; giảm 38% nam giới 41% nữ giới độ tuổi từ 65 tuổi trở lên) Tỷ lệ mắc CRC người từ 50 tuổi trở lên giảm hầu hết tiểu bang Mỹ, với mức giảm 5% hàng năm từ năm 2009-2013 bảy tiểu bang (Nebraska, Maine, Rhode Island, Delaware, Massachusetts, South Dakota California) Đáng ý, bang có tỷ lệ mắc cao như: bang Kentucky, Mississippi Louisiana Trái ngược hoàn toàn với xu hướng tỷ lệ mắc CRC người từ 50 tuổi trở lên, tỷ lệ mắc người 50 tuổi tiếp tục tăng, tăng 22% từ năm 2000-2013 Tương tự mơ hình tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong CRC giảm 34% người từ 50 tuổi trở lên giai đoạn 2000-2014, lại tăng 13% người 50 tuổi [10] Năm 2012, liệu từ GLOBOCAN cho thấy tỉ lệ mắc CRC cao Australia, New Zealand, Europe, Bắc Mỹ, tỉ lệ mắc thấp tìm thấy Châu Phi Trung Nam Châu Á Tỉ lệ mắc CRC khu vực khác địa lý thay đổi chế độ ăn uống, môi trường tiếp xúc kết hợp với nhạy cảm di truyền có từ trước khu vực [11] Tình trạng kinh tế xã hội thấp liên quan với việc gia tăng nguy phát triển CRC, nguy CRC tăng lên nơi tình trạng kinh tế xã hội thấp Các nguy có khả thay đổi như: không hoạt động thể chất, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, béo phì… chiếm tỉ lệ đáng kể [12] Các yếu tố khác, đặc biệt mạng lưới y tế dự phòng CRC nước điều kiện kinh tế thấp góp phần đáng kể làm tăng tỉ lệ bị CRC 1.2.2 Nguyên nhân ung thư đại trực tràng Ung thư xác định biến đổi DNA tế bào gây DNA chất nhân tế bào chứa đựng gen điều khiển chức tế bào Hiện nay, hiểu biết biến đổi DNA làm cho tế bào bình thường chuyển thành ung thư rõ ràng Trong DNA có gen với chức điều khiển tăng trưởng tế bào, chia tách, chết tế bào, có gen gây ung thư gen ức chế khối u… Đáng ý, trình hình thành ung thư đột biến DNA làm cho gen gây ung thư hoạt động làm bất hoạt gen ức chế khối u Ngoài ra, thay đổi số gen khác có vai trò gây CRC 1.2.2.1 Đột biến gen di truyền Bệnh đa polyp tuyến hội chứng Gardner: đột biến di chuyền gen coli gây polyp tuyến (APC), gen ức chế khối u, bình thường trì tế bào tăng trưởng giới hạn kiểm soát Những người bị đột biến gen này, kìm hãm phát triển khối u tế bào bị “tắt”, đó, hình thành hàng trăm polyp đại tràng Theo thời gian, đột biến gen xảy tế bào polyp hình thành ung thư Hội chứng Lynch: biến đổi gen hỗ trợ sửa chữa DNA Đột biến gen mã hóa enzyme sửa chữa DNA làm cho DNA bắt cặp sai, dẫn đến phát triển ung thư Hội chứng Peutz-Jeghers: biến đổi di truyền gen ức chế khối u, làm chúng không hoạt động kết hình thánh khối u 1.2.2.2 Các đột biến gen mắc phải Một số đột biến gen xảy thời gian sống không truyền qua hệ, chúng có tế bào sinh từ tế bào gốc bị đột biến Trong hầu hết trường hợp bị CRC, đột biến gen mắc phải gây ung thư nhiều so với đột biến gen di truyền Các yếu tố nguy CRC đóng vai trò quan trọng việc tạo đột biến mắc phải Khơng có đột biến gen đơn gây CRC, hầu hết đột biến xảy gen ức chế khối u hay gen gây ung thư, dẫn đến tế bào đại trực tràng tăng sinh khơng kiểm sốt, đột biến xảy sau gen khác gây CRC 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh ung thư đại trực tràng 1.2.3.1 Gen, vi môi trường di truyền ngoại gen (epigenetic) Các chế bệnh sinh CRC vấn đề phạm vi rộng lĩnh vực sinh học ung thư CRC hậu từ tích lũy biến đổi gen di truyền ngoại gen làm biến đổi tế bào biểu mơ tuyến bình thường thành ung thư tuyến Các tế bào biểu mơ tuyến bị thay đổi cấu hình gen ngoại gen để có khả xâm lấn, di quan xa, chủ yếu đến gan phổi Tuy nhiên, chế phân tử CRC chưa hiểu biết đầy đủ Nhiều mơ hình phân tử khác đề xuất cho chế bệnh sinh CRC Đầu tiên, mơ hình Loeb khẳng định q trình phát triển khối u kích thích bất ổn định gen, tạo số lượng lớn đột biến ngẫu nhiên chọn lọc đột biến Kế tiếp sau đó, cơng trình Nowell vai trò sai lệch nhiễm sắc thể tạo khối u dẫn đến giả thuyết kiểu gen riêng lẻ ung thư vòng chọn lọc vơ tính Cả giả thuyết phù hợp với giả thuyết tạo khối u nhiều bước Fould Trong thập kỷ qua, nghiên cứu mơ hình Darwin Vogelstein tiến triển u tuyến thành ung thư biểu mô tuyến, với cơng trình nghiên cứu gen ung thư đại trực tràng di truyền không polyp người cung cấp nhiều hiểu biết chế bệnh sinh CRC Những nghiên cứu đưa chứng polyp ống nhỏ polyp tuyến hỗn hợp dạng tiền ung thư, chúng tiến triển thành ung thư biểu mô tuyến xâm lấn Tiến lĩnh vực nghiên cứu CRC, nhà khoa học chứng minh phân nhóm nhỏ polyp tiền ác tính polyp có cưa, dễ biến đổi thành CRC [13], [14] Tuy nhiên, kết thu từ mơ hình biến đổi gen gây CRC đưa gen bị đột biến hình thành CRC, khó khăn cho việc chứng minh tích lũy đột biến gen trường hợp CRC lẻ tẻ Rất liệu giả thuyết biến đổi gen mơ lão hóa để giải thích cho gia tăng theo cấp số nhân tỷ lệ mắc CRC tương xứng với tuổi cao Hiện nay, có nhiều giả thuyết chế phân tử gây CRC, chế liên quan đến đột biến di truyền biến đổi ngoại gen Ví dụ, polyp có cưa liên quan đến bất ổn trình tự lặp ngắn (MSI) DNA gia tăng q trình methyl hóa làm bất thường ngoại gen, cytosine adenosine DNA Trong polyp ống nhỏ thường gặp biến đổi gen ức chế khối u đồng thời với bất ổn nhiễm sắc thể khác gây Hơn nữa, tiến cơng nghệ sinh học, giải trình tự gen cho thấy có hàng ngàn thay đổi phân tử hệ gen CRC, 10 có tập hợp nhỏ thay đổi số gây CRC Mặc dù tồn phân nhóm chế phân tử gây CRC, chưa thể xác định xác phân nhóm theo kiểu mô học hay lâm sàng Ngược lại, thay đổi ngồi gen, kiểu hình methyl hóa đảo CpG có nhiều đóng góp chế bệnh sinh CRC [14] Ngồi kiện tăng methyl hóa DNA thường xảy vùng khởi động gen ức chế khối u, điều tiết ngoại gen CRC bao gồm biến đổi histone sau dịch mã, chủ yếu acetyl hóa, methyl hóa histone, chúng đóng vai trò quan trọng việc điều hòa biểu gen gây ung thư gen ức chế khối u Đột biến gen gây CRC: Giống loại bệnh ung thư khác, quan điểm trước cho CRC phát sinh từ hậu tích lũy đột biến gen ức chế khối u gen gây ung thư, chức cân nội gây biến đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư Phân tích trình tự gen CRC, người ta xác định có khoảng 13.000 gen đột biến hệ gen CRC, có khoảng 69 đột biến gen điều khiển đề xuất đột biến có vai trò hình thành CRC [15] Bộ gen ung thư chứa hàng ngàn đột biến, đến nay, nhà khoa học chưa xác định đột biết có vai trò định hình thành ung thư (đột biến điều khiển) đột biến hậu trình (đột biến kéo theo) Một số nghiên cứu phạm vi rộng CRC chứng minh phần lớn đột biến kéo theo vơ hại, khơng có lợi chọn lọc Chỉ có số đột biến điều khiển yếu tố quan trọng gây CRC chọn lọc Những đột biến điều khiển ảnh hưởng đến loạt chức tế bào từ tăng sinh, di cư, biệt hóa, độ bám dính, chết tế bào, ổn định sửa chữa DNA CRC phân chia theo nhóm, tùy thuộc vào loại hình bất ổn định gen mà chúng hiển thị Bất ổn nhiễm sắc thể đặc trưng tính bội khơng chỉnh, tăng số lượng nhiễm sắc thể nhiễm sắc thể Trong ổn định vùng vi vệ tinh DNA xác định diện đột biến chèn đột biến đứt đoạn hay 160 136 Bottone M.G., Santin G., Aredia F., et al (2013) Morphological features of organelles during apoptosis: An overview Cells, 2:294-305 137 Johansson A.C., Appelqvist H., Nilsson C., et al (2010) Regulation of apoptosis-associated lysosomal membrane permeabilization Apoptosis, 15:527-540 138 Kroemer G., Petit P., Zamzami N., et al (1995) The biochemistry of programmed cell death Federation of American societies for experimental biology journal, 9:1277-1287 139 Candé C., Cecconi F., Dessen P., et al (2002) Apoptosis-inducing factor (AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death Journal of cell science, 115:4727-4734 140 Yang L., Liu Y., Wang M., et al (2016) Quercetin-induced apoptosis of HT-29 colon cancer cells via inhibition of the Akt-CSN6-Myc signaling axis Molecular medicine reports, 1-8 141 Waziri P.M., Abdullah R., Yeap S.K., et al (2016) Clausenidin induces caspase-dependent apoptosis in colon cancer Biomedicine central complementary and alternative medicine, 16:1-12 161 MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung 1.2 Ung thư đại trực tràng 1.2.1 Tình hình ung thư đại trực tràng 1.2.2 Nguyên nhân ung thư đại trực tràng 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh ung thư đại trực tràng 1.3 Liệu pháp virus vaccine sởi quai bị điều trị ung thư đại trực tràng người 22 1.3.1 Sinh học virus sởi quai bị 22 1.3.2 Virus vaccine sởi quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng 24 1.3.3 Các chế virus vaccine sởi quai bị ly giải tế bào ung thư đại trực tràng 27 1.4 Các nghiên cứu virus vaccine sởi quai bị điều trị ung thư lâm sàng 35 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Đối tượng nghiên cứu 38 162 2.1.1 Động vật 38 2.1.2 Chất liệu nghiên cứu 38 163 2.1.3 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Phương pháp ni cấy tăng sinh dòng tế bào 40 2.2.2 Phương pháp tăng sinh chuẩn độ virus vaccine sởi quai bị từ nguồn virus vaccine 42 2.2.3 Phương pháp đánh giá virus vavccine sởi quai bị ly giải tế bào thử nghiệm 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide 45 2.2.4 Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi quai bị đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình tế bào hoại tử phương pháp dòng chảy 48 2.2.5 Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình hoại tử phương pháp phân tích tế bào dòng chảy 51 2.2.6 Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) 54 2.2.7 Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT29 dùi chuột thiếu hụt miễn dịch tính kích thước khối u 55 2.2.8 Phương pháp điều trị chuột nude virus vaccine sởi quai bị 56 2.2.9 Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị virus vaccine sởi quai bị chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 56 2.2.10 Phương pháp phẫu tích lấy mơ u lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 57 2.2.11 Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi quai bị phương pháp phân tích tế bào dòng chảy 59 2.2.12 Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 61 2.2.13 Phương pháp phân tích kết 62 164 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 65 3.1 Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi quai bị 65 3.1.1 Tăng sinh dòng tế bào HT-29 Vero 65 3.1.2 Tăng sinh virus vaccine sởi quai bị từ nguồn virus vaccine 66 3.2 Chuẩn độ virus vaccine sởi quai bị theo phương pháp TCID50 67 3.3 Virus vaccine sởi quai bị ly giải trực tiếp dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro 68 3.3.1 Tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi quai bị tạo hợp bào in vitro 68 3.3.2 Kết đánh giá hiệu ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 virus vaccine sởi quai bị nghiệm pháp 3- (4,5Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide 69 3.3.3 Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình hoại tử sau nhiễm virus vaccine sởi quai bị in vitro.73 3.4 Virus vaccine sởi quai bị kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép chuột thiếu hụt miễn dịch 90 3.4.1 Kết ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 90 3.4.2 Kết điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 virus vaccine sởi quai bị 91 3.4.3 Tỉ lệ tế bào miễn dịch lách chuột thiếu hụt miễn dịch nhóm nghiên cứu sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 96 3.4.4 Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 99 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 101 4.1 Tăng sinh dòng tế bào Vero tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro 101 4.1.1 Tăng sinh dòng tế bào Vero 101 4.1.2 Ni cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 102 165 4.2 Tăng sing virus vaccine sởi, quai bị Chuẩn độ TCID50 103 166 4.3 Virus vaccine sởi quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro 107 4.3.1 Virus vaccine sởi quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cách tạo hợp bào in vitro 107 4.3.2 Đánh giá khả ly giải tế bào HT-29 virus vaccine sởi quai bị nghiệm pháp - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 diphenyl tetrazolium bromide 109 4.3.3 Virus vaccine sởi quai bị ly giải tế bào HT-29 thơng qua kích hoạt đường tế bào chết theo chương trình in vitro 112 4.4 Virus vaccine sởi quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chuột thiếu hụt miễn dịch 123 4.4.1 Đánh giá độc tính virus vaccine sởi quai bị chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 123 4.4.2 Virus vaccine sởi quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chuột thiếu hụt miễn dịch 125 4.4.3 Virus vaccine sởi quai bị kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chuột thiếu hụt miễn dịch.128 4.4.4 Kết siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 ghép chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 134 KẾT LUẬN 140 Phối hợp virus vaccine sởi quai bị có hiệu ly giải trực tiếp kích hoạt đường chết tế bào apoptosis in vitro dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 140 Phối hợp virus vaccine sởi quai bị có hiệu kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép chuột nude 139 KHUYẾN NGHỊ 142 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN 143 TÀI LIỆU THAM KHẢO 144 167 DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT APC Adenomatous polyposis coli (Coli polyp tuyến) AIF Apoptosis inducing factor (yếu tố tạo chết tế bào theo chương trình) CEA Carcinoembryonic Antigen (kháng nguyên ung thư biểu mô phôi) CIMP CpG island methylator phenotype (kiểu hình methyl hóa đảo CpG) CPE Cytopathic effect (hiệu ứng gây độc tế bào) CpG Cytosine – Guanine nucleotide CRC Colorectal Cancer (ung thư đại trực tràng) DAMP Damage-Associated Molecular Pattern (kiểu phân tử liên quan đến tổn thương) DC Dedritic Cell (tế bào đuôi gai) DNA Deoxyribonucleic acid F Fusion (hòa màng) HN Hemagglutinin neuraminidase H Hemagglutinin HNPCC Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (ung thư đại trực tràng di truyền không Polyp) IFN Interferon IL Interleukin LINE-1 (Long interspersed nuclear elements-1) yếu tố nhân kích thước dài rải rác LLC Lewis Lung Cancer (ung thư phổi chuột) MeV Mealse vaccine virus (virus vaccine sởi) MHC Major Histocompatibility Complex (phức hợp tương hợp mơ chính) 168 MMR Mismatch Repair (sửa chữa ghép đôi không xứng) MOI Multiplicity of infection MSI Microsatellite Instability (bất ổn trình tự lặp ngắn DNA) MTT 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide MuV Mumps vaccine virus (virus vaccine quai bị) NIS Sodium-Iodine Symporter (chất mang iod natri) NK Natural Killer (giết tự nhiên) OV Oncolytic Virus (virus ly giải tế bào ung thư) PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern (kiểu phân tử liên quan đến tác nhân gây bệnh) PBS Phosphate buffered saline (dung dịch muối đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PFU Plaque forming units (Số hạt virus nhiễm vào tế bào) RNA Ribonucleic acid ROS Reactive Oxygen Species (các gốc tự chứa oxy hoạt động) TCID Tissue Culture Infectious Dose (liều nhiễm mô nuôi cấy) TGFβ Transforming Growth Factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β) TNF Tumor necrotic factor (yếu tố hoại tử khối u) Wnt Wingless-related integration (tên đường truyền tín hiệu vào nội bào thông qua thụ thể bề mặt tế bào) 169 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các thử nghiệm lâm sàng MeV MuV………………………36 3.1 Kết tạo khối u tế bào HT-29 đùi chuột nude………… …90 3.2 Kết theo dõi sức khỏe chuột sau điều trị MeV MuV 92 170 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 KếT MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 69 Kết MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 70 Kết MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 71 So sánh kết MTT nhóm MuV+MeV ngày 3, 71 So sánh kết MTT nhóm MeV ngày 3, 72 So sánh kết MTT nhóm nhiễm MuV ngày 3, 72 Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ngày thứ nhiễm MeV, MuV 74 Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ngày thứ nhiễm MeV, MuV 74 Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ngày thứ nhiễm MeV, MuV 75 Tỉ lệ tế bào HT-29 hoại tử ngày thứ nhiễm MeV, MuV 76 Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ngày thứ nhiễm MeV, MuV 78 Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ngày thứ nhiễm MeV, MuV 78 Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ngày thứ nhiễm MeV, MuV 79 Tỉ lệ tế bào hoại tử ngày thứ nhiễm MuV, MeV 80 Tỉ lệ tế bào apoptosis ngày thứ nhiễm MeV, MuV 82 Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ngày thứ nhiễm MeV, MuV 82 Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ngày thứ nhiễm MeV, MuV 83 Tỉ lệ tế bào hoại tử ngày thứ nhiễm MeV, MuV 84 So sánh tỉ lệ tế bào chết apoptosis ngày thứ 3, nhiễm MeV, MuV 86 3.20 So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm ngày 3, nhiễm MeV, MuV 88 3.21 So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn ngày 3, nhiễm MeV, MuV 89 3.22 Thay đổi trọng lượng chuột sau điều trị MeV, MuV 92 3.23 Kết kích thước khối u (mm3) sau điều trị MeV, MuV 93 3.24 So sánh thời gian sống trung bình nhóm chuột sau điều trị MeV MuV 94 Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.25 Kết tỉ lệ chuột sống sau điều trị MuV, MeV 95 3.26 Kết tỉ lệ tế bào miễn dịch lách chuột nude sau điều trị MeV MuV 98 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 1.2 1.3 Tên hình Trang 2.1 2.2 Gia đình Paramyxoviridae 23 MeV, MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào CRC 25 MeV, MuV ly giải tế bào CRC trực tiếp qua trung gian miễn dịch…………………………………………………………………30 Vai trò sialidase MeV, MuV hoạt hóa tế bào lympho T gây độc tế bào u 35 Các máy sử dụng cho nghiên cứu………………………… ………39 Nuôi cấy tăng sinh tế bào phòng thí nghiệm 40 2.3 Sơ đồ nhiễm MeV, MuV để chuẩn độ TCID50 43 2.4 2.5 2.6 2.7 Sơ đồ pha loãng nồng độ MeV, MuV 44 Sơ đồ nhóm nhiễm MeV, MuV làm nghiệm pháp MTT 47 Bộ Kit làm nghiệm pháp MTT 47 Sơ đồ nhiễm MeV, MuV theo nhóm đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis tế bào hoại tử in vitro 49 Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy phần mềm BD FACS Diva đánh giá tỉ tế bào apoptosis tế bào hoại tử 53 1.4 2.8 2.9 Buồng nuôi chuột nude 54 2.10 Ghép u tế bào HT-29 đo kính thước u đùi chuột nude 56 2.11 Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy phần mềm BD FACS Diva đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch lách chuột nude 61 3.1 Tế bào HT-29 bám đáy phát triển……………………………….65 3.2 Tế bào Vero bám đáy phát triển 65 3.3 Tế bào Vero nhiễm MeV, MuV 66 3.4 Kết nhuộm xanh methylen chuẩn độ TCID50 67 3.5 Hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro 68 3.6 Biến đổi hình thái tế bào HT-29 chết theo chương trình 73 3.7 Kết phân tích dòng chảy tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 77 173 Hình 3.8 Tên hình Trang Kết phân tích dòng chảy tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 81 3.9 Kết phân tích dòng chảy tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 85 3.10 Kết ghép u tế bào HT-29 da đùi chuột nude 91 3.11 Lách tế bào lách chuột nude nhóm nghiên cứu 96 3.12 Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 bình thường 99 3.13 Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị MeV, MuV 99 174 ... ung thư, bao gồm CRC [40] 23 1.3 Liệu pháp virus vaccine sởi quai bị điều trị ung thư đại trực tràng người 1.3.1 Sinh học virus sởi quai bị Virus sởi quai bị virus thuộc thành viên họ Paramyxoviridae... nay, với phát triển sinh học phân tử, nhà khoa học thiết kế gen virus nhằm tăng khả l y nhiễm ly giải tế bào ung thư đặc hiệu kiểm soát mức độ virus nhân lên thể Liệu pháp sử dụng chủng virus vaccine. .. autophagy, kèm theo giải phóng túi syncytiosome giống exosome biểu kháng nguyên tế bào u cao Hợp bào chết tạo syncytiosome nhiều đáng kể so với tế bào chết nguyên nhân khác Syncytiosome y u tố