BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOA KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ VI KHUẨN CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacilus acidophilus KHĨA ḶN TỚT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỢI – 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOA KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ VI KHUẨN CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA L acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân DS Ninh Thị Kim Thu Nơi thực hiện: Bộ mơn Cơng nghiệp dược HÀ NỢI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng long biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn đến TS Đàm Thanh Xuân DS Ninh Thị Kim Thu, DS Lê Ngọc Khánh người thầy đã tận tình hướng dẫn ch ỉ bảo cho từ những bước đầu tiên cho đến hoàn thiện khóa luận này Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Công Nghiệp Dược tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài, bảo thời gian làm thực nghiệm Nhân dịp này cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập tại trường Và cuối cùng là lời cảm ơn gửi tới gia đình , người thân và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tơi śt q trình h ọc tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Do thời gian làm thực nghiệm cũng kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày , tháng 5, năm 2013 Sinh viên NGUYỄN THỊ HOA Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Vai trò 1.1.3 Cơ chế tác dụng 1.1.4 Một số dạng chế phẩm thị trường 1.2 Phương pháp đông khô 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Các giai đoạn phương pháp đông khô 1.2.3 Ưu điểm phương pháp đông khô 1.2.4 Ứng dụng 1.2.5 Các tá dược bảo vệ thường dùng đông khô vi sinh vật 1.3 Alginat 10 1.3.1 Sơ lược alginat 10 1.3.2 Một số tính chất natri alginat 10 1.3.3 Ứng dụng 11 1.3.4 Một số hướng nghiên cứu sử dụng alginat sản xuất chế phẩm 12 probiotic thời gian gần Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 13 CỨU 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 13 2.1.1 Nguyên vật liệu sử dụng 13 2.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 13 2.1.3 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 13 2.1.4 Thiết bị 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1 Khảo sát khả sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ q 14 trình đơng khô tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus 2.2.2 Khảo sát khả bảo vệ vi sinh vật alginat sử dụng làm tá 15 dược độn 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp nhân giống 15 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối 15 2.3.3 Phương pháp đông khô 15 2.3.4 Phương pháp xác định hàm ẩm 16 2.3.5 Phương pháp xác định số lượng VSV phương pháp pha loãng 16 liên tục 2.3.6 Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall 18 Chương 3: Kết bàn luận 19 3.1 Khảo sát khả sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ trình 19 đông khô tạo nguyên liệu probiotic chứa L acidophilus ATCC 4653 3.1.1 Đánh giá thể chất nguyên liệu chứa vi sinh vật tạo 19 thành sau đông khô 3.1.2 Đánh giá hàm ẩm tốc độ hút ẩm mẫu đông khô vi sinh 22 vật với tá dược bảo vệ sữa gầy alginat 3.1.3 Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sống sót sau 24 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi đông khô 3.1.4 So sánh khả sống sót vi sinh vật ngun liệu đơng 28 khơ có khơng có kết hợp alginat sữa gầy 3.2 Khảo sát khả bảo vệ vi sinh vật alginat sử dụng làm tá 31 dược độn 3.2.1 Khảo sát khả bảo vệ vi sinh vật bột nguyên liệu probiotic 31 có alginat mơi trường acid dày KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT B subtilis : Bacillus subtilis Cfu (Colony- Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc FAO (Food and Agriculture Organization) : Tổ chức nông lương giới Glass : trạng thái nhiệt động q bão hòa khơng bền với độ nhớt cao HDL (High density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng cao HDSK : Hỗn dịch sinh khối IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn bơ sữa giới Kl/kl : Khối lượng/khối lượng Kl/tt : Khối lượng/thể tích L acidophilus : Lactobacillus acidophilus LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn lactic LDL (Low density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng thấp MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MT : Môi trường PPI (Proton Pump Inhibitor) : Ức chế bơm proton S boulardii : Saccharomyces boulardii Tt/kl : Thể tích/khối lượng VSV : Vi sinh vật WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế giới Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Bảng hóa chất dùng nghiên cứu 13 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 14 Bảng 3.1 Thể chất mẫu đông khô L acidophilus với tá 20 dược bảo vệ thời điểm sau đông khô Bảng 3.2 Kết đo hàm ẩm (%) số mẫu đông khô L 23 acidophilus với tá dược bảo vệ khác theo thời gian Bảng 3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót mẫu sau đông khô Bảng 3.4 Kết đo hàm ẩm mẫu đông khô với tá dược bảo vệ 29 26 hỗn hợp sữa gầy với alginat nồng độ Bảng 3.5 Số lượng vi sinh vật sống sót tính 1g bột sau đơng khơ 30 mẫu đông khô sử dụng kêt hợp alginat sữa gầy Bảng 3.6 Số lượng vi sinh vật sống sót tính 1g bột đơng khơ sau 33 thời gian ngâm môi trường acid HCl pH 1,2 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Chế phẩm probiotic cốm Hình 1.2 Chế phẩm probiotic dạng viên nang Hình 1.3 Chế phẩm dạng lỏng Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo acid α- L- guluronic acid β- D- 10 mannuronic Hình 3.1 Hình ảnh mẫu đơng khơ với nước cất Hình 3.2 Đồ thị biểu thị hàm ẩm mẫu sau đông khô sau 23 21 thời gian bảo quản Hình 3.3 Hình ảnh mẫu đơng khơ với alginat sau tháo khỏi 24 máy sau phút điều kiện khơng bảo quản Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ vi khuẩnL acidophilus sống sót 27 mẫu sau đơng khơ Hình 3.5 Biểu đồ thể số lượng vi sinh vật sống sót sau thử 33 môi trường acid HCl pH 1,2 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn probiotic biết đến nhóm vi sinh vật manglại nhiều lợi ích cho người như: chống nhiễm trùng đường tiêu hóa, cải thiện khả dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch…[20] Tuy nhiên hầu hết cácvi sinh vật có nhược điểm lớn độ ổn định Chúng dễ bị ảnh hưởng điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm [35] Khi sử dụng theo đường uống pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật yếu tố làm suy giảm số lượng sống sót ngăn cản việc thiết lập hệ vi sinh vật niêm mạc ruột Ngồi thơng số liên quan q trình sản xuất làm ảnh hưởng đến khả sống sót vi khuẩn probiotic [29] Do muốn đem lại tác dụng cho vật chủ cần phải tìm phương pháp gia tăng tỉ lệ sống sót khả chống chịu vi khuẩn probiotic trước điều kiện bất lợi sản xuất, bảo quản sử dụng Chính mà có nhiều nghiên cứu nhằm tìm chất có tác dụng bảo vệ vi sinh vật probiotic hướng nghiên cứu đáng ý thời gian gần sử dụng alginat tác nhân bảo vệ nhằm gia tăng tỉ lệ sống sót vi khuẩn probiotic Từ lí chúng tơi thực đề tài “Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn alginat trình tạo nguyên liệu probiotic chứa L acidophilus” nhằm mục tiêu sau: Khảo sát khả sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ q trình đơng khơ Lactobacillus acidophilus Khảo sát khả bảo vệ vi sinh vật alginat sử dụng làm tá dược độn cho dạng thuốc rắn Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 27 Trong đó: Mẫu 1: đơng khơ vi sinh vật với dịch li tâm Mẫu 2: đông khô vi sinh vật với nước cất Mẫu 3: đông khô vi sinh vật với sữa gầy Mẫu 2: đông khơ vi sinh vật với alginat Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượngvi khuẩnL acidophilus sống sót mẫu sau đông khô Kết bảng 3.3 cho thấy đông khô với tá dược dung dịch alginat 2% cho tỉ lệ vi sinh vật sống sót thấp nhiều so với đông khô thường dùng sữa gầy Tuy vậy, số liệu cho thấy alginat có tác dụng bảo vệ sử dụng làm tá dược đơng khơ với tỉ lệ sống sót mẫu cao gấp 27,14 lần so với mẫu đông khô khơng có tá dược bảo vệ (mẫu 2) Tác dụng bảo vệ vi sinh vật q trình đơng khơ giải thích sau: Dung dịch natri alginat nước có cấu trúc polymer nên tạo xung quanh bên tế bào mơi trường có độ nhớt tương tự giúp giảm thiểu biến đổi cấu trúc phân tử mức thấp [24] 28 Với sữa gầy có thành phần chủ yếu gồm lactose protein yếu tố định khả bảo vệ chúng Protein có sữa tạo mơi trường có độ nhớt cao giúp bảo vệ cấu trúc tế bào vi sinh vật, thành phần lactose tạo liên kết hydro đường - protein, liên kết giúp ổn định protein tế bào, giúp trì cấu trúc protein màng nước bị loại Sự ổn định màng tế bào protein cấu trúc liên kết hydro disaccharid gọi “lí thuyết thay nước”[13] Còn theo nghiên cứu khác protein sữa gầy tạo nên lớp áo bảo vệ thành tế bào Trong sữa gầy chứa nhiều chất tan muối phosphat, citrat có khả đệm giúp ổn định pH mẫu mà dung môi dần q trình đơng khơ [24] Như vậy, alginat có tác dụng bảo vệ Lactobacillus acidophilus trình đơng khơ Khi đơng khơ với tá dược alginat 2% cho tỉ lệ sống sót L.acidophilus 1.90% cao gấp 27,14 lần so với mẫu chứng đông khô với nước cất, cao gấp 7,91 lần so với mẫu đông khô với dịch li tâm Tuy nhiên tỉ lệ sống L.acidophilus mẫu đông khô với alginat sữa gầy đạt số lượng vi sinh vật 107 3.1.4 So sánh khả sống sót vi sinh vật ngun liệu đơng khơ có vàkhơng có kết hợp alginat sữa gầy Từ kết thí nghiệm 3.1.3 cho thấy alginat có tác dụng bảo vệ vi sinh vật trình đơng khơ, nhiên sử dụng làm tá dược đơng khơ tốc độ hút ẩm nguyên liệu tạo thành lớn làm cho nguyên liệu khó đảm bảo yêu cầu hàm ẩm Mặt khác nguyên liệu tạo thành sau đông khô L.acidophilus với alginat Do đóchúng tơi thực thí nghiệm đơng khơ vi sinh vật sử dụng kết hợp tá dược làdung dịchalginatcác nồng độ 1%, 2%, 5% sữa gầy 10% nhằm cải thiện thể chất mẫu đông khô với alginat  Mục tiêu: Sơ so sánhtỉ lệ sống sót vi sinh vật mẫu sử dụng tá dược độn sữa gầy 10% sử dụng sữa gầy có kết hợp thêm dung dịch alginat  Tiến hành: Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 29 Nuôi cấy vi sinh vật môi trường MRS 24h (theo phương pháp nêu mục 2.3.2.) Chuẩn bị dung dịch tá dược gồm có: dung dịch sữa gầy 10%, dung dịch sữa gầy 20% (kl/tt), dung dịch alginat có nồng độ 1%, 2%, 5% (kl/tt) (pha dung dịch, hấp tiệt khuẩn 115oC/ 20 phút, để nguội xuống khoảng 37 ÷ 40oC) Trộn sinh khối li tâm với mẫu dung dịch tá dược bảo vệ vừa chuẩn bị Đồng hóa máy lắc Vortex Đơng khơ mẫu thu (theo phương pháp nêu mục 2.3.3.) Tháo mẫu khỏi thiết bị đông khô, đo hàm ẩm (theo phương pháp nêu mục 2.3.4.), tiến hành xác định số lượng vi sinh vật có 1g nguyên liệu thu (Theo phương pháp pha loãng liên tục nêu mục 2.3.5.)  Kết nhận xét  Về thể chất Cả mẫu tạo bột nguyên liệu chất đồng nhất, tơi xốp, khô, màu đậm dần theo nồng độ alginat có mẫu Như việc thay đổi nồng độ alginat từ 1÷ 5% khơng làm ảnh hưởng đến thể chất mẫu  Hàm ẩm Bảng 3.4.Kết đo hàm ẩm mẫu đông khô với tá dược bảo vệ hỗn hợp sữa gầy với alginat nồng độ Tá dược Thời gian Nồng độ alginat bổ sung (%) 0h 2,47 ÷ 3,12 2,67 ÷ 3,54 3,09 ÷ 4,17 3,15 ÷ 4,21 Sau ngày 2,69 ÷ 4,16 2,87 ÷ 3,92 3,37 ÷ 4,56 3,45 ÷ 4,78 Sau tuần 2,81 ÷ 4,21 3,12 ÷ 4,35 3,62 ÷ 4,91 3,89÷ 5,18 Sau tuần 2,90 ÷ 4,27 3,28 ÷ 4,74 3,85 ÷ 5,04 4,01÷ 5,37 30 Hàm ẩm mẫu sau đơng khơ có kết hợp sữa gầy 20% alginat 1%, 2%, 5% đạt từ: 2,69% ÷ 4,21% giá trị gần tương đương với hàm ẩm mẫu đông khô vi sinh vật với tá dược sữa gầy 10% (hàm ẩm từ 2,47% ÷ 3,12%), đạt tiêu chuẩn hàm ẩm dạng thuốc bột Hàm ẩm sau thời gian bảo quản túi polyme kín mẫu vào khoảng 3,85 ÷ 5,37% mẫu đơng khơ với sữa gầy 10% có hàm ẩm 2,90 ÷ 4,27% Như xét thể chất hàm ẩm kết hợp alginat sữa gầy 10% ngun liệu tạo thành chất hàm ẩm tương đương với mẫu đông khô sử dụng sữa gầy, tỉ lệ alginat cao chế phẩm có màu đậm hàm ẩm lớn so với mẫu có hàm lượng alginat thấp (tuy nhiên thay đổi hàm ẩm mẫu không đáng kể)  Về số lượng vi sinh vật Lactobacillus acidophilus sống sót Số lượng vi sinh vật sống sót nêu bảng3.5.cho thấy mẫu kết hợp alginat 2% với dung dịch sữa gầy 10% cho tỉ lệ sống cao 22,94 x 108cfu/gso với 16,94 x 108 cfu/gcủa mẫu đông khô với sữa gầy 17,82 x 108cfu/g; 17,89 x 108cfu/g mẫu chứa 1% 5% alginat Tuy nhiên số lượng sống sót mẫu đơng khơ khơng có khác nhiều (cả mẫu chứa khoảng 109 VSV/1g) Số lượng VSV sống sót thể bảng sau: Bảng 3.5.Số lượng vi sinh vật sống sót tính 1g bột sau đông khôtrong mẫu đông khô sử dụng kết hợp alginat sữa gầy Nồng độ alginat bổ sung (%) Lần 8,51 x 108 14,50 x 108 29,40 x 108 23,92 x 108 Lần 21,89x 108 9,05x 108 34,52x 108 27,84x 108 Lần 20,42x 108 29,91x 108 4,90x 108 1,29x 108 Trung bình 16,94 x 108 17,82 x 108 22,94 x 108 17,89 x 108 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 31 Như kết hợp với sữa gầy 10% để đông khơ, natri alginat thể khả gia tăng tỉ lệ sống sót Lactobacillus acidophilus Nguyên nhân tỉ lệ natri alginat sử dụng thấp, thí nghiệm 3.1.3 ta thấy tác dụng bảo vệ vi sinh vật alginat nhỏ nhiều so với sữa gầy (khoảng 27 lần) Do kết hợp alginat với sữa gầy tạo hỗn hợp tá dược đông khô ta không thấy thay đổi lớn tỉ lệ sống sót Mà kết hợp tá dược làm cho trình bào chế trở lên phức tạp hơn, nguyên liệu tạo thành với mẫu có nồng độ alginat cao có màu sắc khơng đẹp, độ hút ẩm cao không nhiều Tuy nhiên thể chất, hàm ẩm, số lượng vi sinh vật sống sót mẫu phối hợp alginat với sữa gầy đạt giá trị tốt so với mẫu đông khô sử dụng riêng alginat 3.2 Khảo sát tác dụng bảo vệ Lactobacillus acidophilus natri alginatkhi sửdụng làm tá dược độn dạng thuốc rắn Các kết nghiên cứu nêu mục3.1.2 cho thấy alginat có tác dụng làm gia tăng tỉ lệ sống sót vi sinh vật q trình đơng khơ Tuy nhiên việc sử dụng tá dược bảo vệ đơng khơ vi sinh vật nhiều hạn chếvì sản phẩm tạo thành chất hàm ẩm khơng thích hợp Do chúng tơi thực thí nghiệm nhằm khảo sát khả bảo vệ natri alginat sử dụng làm tá dược độn chế phẩm chứa vi sinh vật Một phương pháp thử tác dụng bảo vệ phổ biến thử tác dụng bảo vệ tá dược sử dụng lên tỉ lệ sống sót vi sinh vật tiếp xúc với điều kiện acid dày Thí nghiệm tiến hành thử nghiệm mẫu: nguyên liệu đông khô với sữa gầy 10% tiến hành trộn đồng lượng bột đông khô với tá dược độnlà natri alginat, tinh bột -một tá dược độn dùng phổ biến để đối chứng 3.2.1 Khảo sát khả bảo vệ vi sinh vật bột ngun liệu probiotic có alginat mơi trường pH dày  Mục tiêu: Khảo sát khả bảo vệ vi sinh vật alginat vi sinh vật điều kiện acid dày 32  Tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật bình nón chứa 200ml mơi trường MRS lỏng 24h (theo phương pháp nêu mục 2.3.2) Thu gạn bỏ phần dịch trong, giữ lại khoảng 60ml HDSK phía đáy, tạo mẫu tiền đơng gồm: hỗn dịch sinh khối trộn đồng lượng với dung dịch sữa gầy 20% Đông khô mẫu (theo phương pháp nêu mục 2.3.4.) Thu sản phẩm, bảo quản túi polymer kín đặt lọ thủy tinh Đếm số lượng vi sinh vật có 1g ngun liệu bột đơng khơ trước thử môi trường acid pH 1,2 theo phương pháp xác định số lượng vi sinh vật pha loãng liên tục (được nêu mục 2.3.5.) Làm nhỏ bột đông khô túi bảo quản Cho mẫu vào bình nón chứa 100ml dung dịch HCl pH 1,2 (được pha theo phương pháp nêu mục 2.3.4.) Khuấy từ với tốc độ 50 vòng/ phút Các mẫu có thành phần sau: Mẫu a: Bột đơng khô Lactobacilus acidophilus với dung dịch sữa gầy 10% (Bột đông khô) Mẫu b: Bột đông khô + tinh bột Mẫu c: Bột đông khô + alginat Sau 1h, đồng hóa mẫu bình Nhanh chóng hút xác ml dịch bình tiến hành pha lỗng tiếp (theo phương pháp nêu mục 2.3.5) Sau khuấy từ 2h, đồng hóa lại dịch bình Nhanh chóng hút xác 1ml dịch bình tiến hành pha loãng (theo phương pháp nêu mục 2.3.5) Tiến hành tương tự với bình chứa mẫu lại Ủ tủ CO2 5% trong, sau 48h tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc Tính số lượng vi sinh vật sống sót (theo cơng thức nêu phần 2.3.5.)  Kết quả, nhận xét Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 33 Tỉ lệ VSV sống sót mẫu sử dụng alginat làm tá dược độn cho tỉ lệ %vi sinh vật sống sót sau 1h 2h cao khoảng 40 lần so với sử dụng tá dược độn tinh bột mẫu không sử dụng bột đông khơ Mẫu c cho số lượng VSV sống sót vào khoảng 107, mẫu a mẫu b cho số lượng VSV sống sót khoảng 105 đến 106 Tác dụng bảo vệ củaalginattrên vi sinh vậttrong điều kiện acid pH thấp dàycó thể giải thích sau: tiếp xúc với dung dịch acid pH thấp muối natri alginat chuyển thành dạng acid alginic không tan Acid alginic trương nở tạo lớp màng bao quanh bột đông khô chứa vi sinh vật, cách li vi sinh vật với điều kiện bất lợi môi trường xung quanh [30] Bảng 3.6 Số lượng vi sinh vật sống sót tính 1g bột đơng khơ sau thời gian ngâm môi trường acid HCl pH 1,2 0h Sau 1h Mẫu c Mẫu a Mẫu c Mẫu b Mẫu a Lần 1,0x 109 9,8 x 106 6,6 x 105 6,3x 105 4,1x 106 2,0x 105 1,9 x 105 Lần 1,9x 109 2,2 x 107 3,1 x 105 2,9x 105 1,3x 107 2,6x 105 2,6x 105 Lần 2,2x 109 2,4 x 107 4,6 x 105 4,7x 105 1,6x 107 4,0x 105 4,3x 105 SLTB 1,7x 109 1,9 x 107 4,8x 105 4,6x 105 1,1x 107 2,9x 105 2,9x 105 Chú thích: Mẫu b Sau 2h SLTB: số lượng tế bào trung bình 34 Hình 3.5 Biểu đồ thể số lượng vi sinh vật sống sót sau thử mơi trường acid HCl pH 1,2 Hai mẫu b a cho lần thử nghiệm cho số lượng VSV sống sót ngang Điều chứng tỏ việc bổ sung thêm tá dược độn tinh bột không giúp cải thiện số lượng VSV sống sót điều kiện acid dày So sánh kết thí nghiệm với kết nghiên cứu Latha Sabikhi năm 2010 đánh giá khả bảo vệ L.acidophilustrong chế phẩm probiotic phương pháp tạo vi nang với alginat Với nguyên liệu ban đầu chứa khoảng 109 cfu/g mẫu khơng bảo vệ có số lượng sống sót sau 1h, 2h điều kiện pH giảm xuống khoảng 105÷106 cfu/g (giảm khoảng 1000 lần) Ở nghiên cứu Latha Sabikhivới phương pháp tạo vi nang bảo vệ sau 1h pH số lượng Lactobacillus acidophilus LA1 giảm từ 107 cfu/g lúc ban đầu xuống khoảng 106 cfu/g(nghĩa giảm khoảng 10 lần), sau 2h điều kiện acid pH 1, số lượng VSV mẫu bao vi nang 105 cfu/g (giảm 100 lần so với ban đầu) Còn thí nghiệm có sử dụng alginat làm tá dược độn sau 1h môi trường acid HCl pH 1,2 số lượng vi sinh vật giảm từ 1,7 x 109 cfu/g xuống khoảng 1,9 x 107 cfu/g (tương đương khoảng xấp xỉ 100 lần), thời điểm sau 2h lượng vi sinh vật lại khoảng 1,1 x 107 cfu/g (giảm khoảng 155 lần so với ban đầu) Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 35 Tóm lại, kết thí nghiệm cho thấy mẫu nguyên liệu sử dụng natri alginat làm tá dược độn cho tỉ lệ sống sót mơi trường acid pH 1,2 cao so với mẫu thử với bột đơng khơ mẫu bột đơng khơ có sử dụng thêm tá dược độn tinh bột Từ sơ kết luận natri alginat sử dụng làm tá dược độn chế phẩm vi sinh với tỉ lệ cao (trong thí nghiệm 50%) cho hiệu làm gia tăng tỉ lệ sống sót L.acidophilus ATCC 4653 36 I KẾT LUẬN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Đề tài thu kết sau: Đã đánh giá tác dụng bảo vệ Lactobacillus acidophilus natri alginat sử dụng làm tá dược đông khô:  Khi sử dụng dạng dung dịch 2% natri alginatgia tăng số lượng sống sót L acidophilus so với mẫu đơng khơ với nước cất (khoảng 26 lần)  Thể chất sản phẩm thu sau đơng khơ có nhược điểm là: khó làm nhỏ nhanh bị hút ẩm trở lại  Khi kết hợp sữa gầy với natri alginat nồng độ 1%, 2%, 5% tạo nguyên liệu chất tốt tương đương với dùng riêng tá dược sữa gầy Nhưng tỉ lệ sống sót lại khơng có thấy khác biệt lớn mẫuđạt khoảng 109cfu/g Đã đánh giá tác dụng bảo vệ vi sinh vật alginatkhi sử dụng làm tá dược độn cho dạng thuốc rắn probiotictrong điều kiện tiếp xúc với môi trường acid HCl pH 1,2cho số lượng vi sinh vật sống sót khoảng (106 ÷ 107 cfu/g)cao khoảng 37 lần so với mẫu không sử dụng thêm tá dược độn mẫu bột đông khơ có kết hợp tá dược độn thường dùng tinh bột II ĐỀ XUẤT Do thời gian có hạn nên khóa luận chưa đề cập hết vấn đề có liên quan, chúng tơi đề xuất số hướng nghiên cứu sau:  Nghiên cứu tác dụng bảo vệ alginat sử dụng làm tá dược độn viên nang probiotic thay tá dược độn thường sử dụng  Nghiên cứu thêm tác dụng bảo L acidophiluscủa alginat khỏi ảnh hưởng muối mật Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Phụ lục: Một số hình ảnh Hình ảnh L.acidophilus có độ phóng đại 1000 lần Hình ảnh thể chất mẫu đơng khô với sữa gầy đông khô với alginat Pha dung dịch acid HCl pH 1,2 Chuẩn bị bình nón dung tích 1000ml, nước cất, dung dịch HCl đặc Dùng pipet 10ml hút xác 8,5 ml dịch HCl đặc cho vào cốc có mỏ có sẵn khoảng 900ml nước cất khuấy đều, đổ vào bình nón 1000ml, bổ sung nước vừa đủ tới vạch 1000ml, lắc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ y tế (2010), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học, Nhà xuất khoa học kĩ thuật Hà Nội Đào Thị Hạnh (2012), “Nghiên cứu bào chế cốm probiotic chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus”, Luận văn thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội, trang 7-12 Lê Gia Hy (2006), Vi sinh vật học đại cương (tập 2), Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam, Hà Nội Lê Thị Luyến (2010), Bệnh học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Ngô Đăng Nghĩa (1999), “Tối ưu hóa quy trình cơng nghệ sản xuất alginat natri từ rong mơ Việt Nam số ứng dụng số lĩnh vực sản xuất”, Luận án tiến sĩ, Trường đại học Thủy Sản Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, 33-65 Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học Dược, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Trường Đại học Dược Hà Nội, Quá trình thiết bị (2010) Tài liệu tiếng Anh 10 A Sibel Akalin, Siddik Gửnỗ, Selmin Dỹzel (1997), Influence of Yogurt and Acidophilus Yogurt on Serum Cholesterol Levels in Mice”, Journal of Dairy ScienceVolume 80, (Issue 11), Pages 2721–2725 11 Asma Sohail, Mark S Turner, Allan Coombes, Thor Bostrom, Bhesh Bhandari(2011), “Survivability of probiotic encapsulated in alginat gel microbeads using a novel impinging earosols method”, International Journal of Food Microbiology 145, pages 162-168 12 C Felley, P Michetti (2003), “Probiotics and Helicobacter pylori”, Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, Volume 17, Issue 5, Pages 785-791 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 13 C Morgan, G Vesey (2009), Freeze-Drying of Microorganisms, Elsevier, Australia 14 Coates D, Richardson G (1974),“A note on the production of sterile solutions ofsodium alginat” Can J Pharm Sci 9: 60–61 15 Drahoslava Lesbros-Pantoflickova, Ire`ne Corthe´sy-Theulaz, and Andre´ L Blum (2007), “Helicobacter pylori and Probiotics”, The Journal of Nutrition Volume 137 no 3, 812-818 16 Filomena Nazzaro, Florinda Fratianni, Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando, (2009), “Fermentative ability of alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions”, Journal of Functional Food 1, 319-323 17 Hartman AW et al “Viscosities of acacia and sodium alginat aftersterilization by cobalt-60” Journal of Pharmaceutical Sciences 1975; 64: 802–805 18 James W Anderson, MD and Stanley E Gilliland, PhD, (1999), “Effect of Fermented Milk (Yogurt) Containing Lactobacillus acidophilus L1 on Serum Cholesterol in Hypercholesterolemic Humans”, Journal of The American College of Nutrition Volume 18 no 1, 43-50 19 Jose´ A Medeiros, MD, PhD and Marta-Isabel Pereira, MD (2013), “The Use of Probiotics in Helicobacter pyloriEradication Therapy”, Journal of Clinical Gastroenterology Volume 47 - Issue 1, pages 1-5 20 Kaila Kailasapathy and James Chin (2000), “Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp”, Immunology and Cell Biology 78, 80–88 21 Karla Bigetti Guergoletto, “Dried Probiotics for Use in Functional Food Applications”, Food Industrial Processes – Methods and Equipment 22 Kumar M, Nagpal R, Kumar R, Hemalatha R, Verma V, Kumar A, Chakraborty C, Singh B, Marotta F, Jain S, Yadav H (2012), “Cholesterol-lowering probiotics as potential biotherapeutics for metabolic diseases”, PMC 23 Latha Sabikhi, R Dabu, D.K Thompkinson, Suman Kapila (2010), “Resistance of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus LA1 to Processing Treatments and Simulated Gut Conditions”, Food Bioprocess Technol 3, pages 586-593 24 Lim Chi Ming, Raha Abd Rahim, Ho Yin Wan,Arbakariya B Ariff (2009), “Formulation of Protective Agents for Improvement of Lactobacillus salivarius I 24 Survival Rate Subjected to Freeze Drying for Production of Live Cells in Powderized Form”, Food Bioprocess Technol 2, pages 431–436 25 M Abadias, A Benabarre, N Teixido, J Usall, I Vinas (2001), “Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake”, International Journal of Food Microbiology 65, 173-182 26 Manoj Kumar, Ashok Kumar, Ravinder Nagpal, Dheeraj Mohania, Pradip Behare1, Vinod Verma, Pramod Kumar, Dev Poddar, P K Aggarwal, C J K Henry, Shalini Jain & Hariom Yadav (2010), “Cancer-preventing attributes of probiotics: an update”, Internationat Journal Food Sciences and Nutrition;61(5):473-96 27 Martha I Alvarez-Olmos and Richard A Oberhelman (2001), “Probiotic Agents and Infectious Diseases:A Modern Perspective on a Traditional Therapy”, Probiotic Agents and Infectious Diseases • CID 2001:32 (1 June), 1567-1577 28 Mcfarlane G, Cummings JH (1999), “Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health?”,British Medical Journal, 318, pp 999–1003 29 Pramod Kumar Singh, Parneet Kaur Deol and Indu Pal Kaur (2012), “Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginat beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer”, Food Funct, 3, pp 83-90 30 Randolph Stanley Porubcan (2007), “Formulations to increase in vivo survival of probiotic bacteria and extend their shelf-life”, United States Patent No US 7,229,818 B2 31 Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn (2009),The Handbook of Pharmaceutical Excipients,Pharmaceutical Press Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 32 Stephen F Perry (1998), “Freeze-drying and cryopreservation of bacteria”, Molecular Biotechnology Volume 9, Issue 1, pp 59-64 33 Sunil Sazawal, Girish Hiremath, Usha Dhingra, Pooja Malik, Saikat Deb, Robert E Black (2006), “Efficacy of probiotics in prevention of acute diarrhoea:a metaanalysis of masked, randomised, placebo-controlled trials”, Lancet Infect 6: 374–82 34 Vandenbossche GMR, Remon J-P (1993),“Influence of the sterilization processon alginat dispersions” J Pharm Pharmacol 45: 484–486 35 Vilaichone RK, Mahachai V, Tumwasorn S, Nunthapisud P, Kullavanijaya P.(2002), “Inhibitory effect of Lactobacillus acidophilus on Helicobacter pylori in peptic ulcer patients: in vitro study”, Pubmed 36 WHO/FAO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria” 37 Youichi Tamai, Noriko Yoshimitsu, Yasuo Watanabe, Yuji Kuwabara, Seiichiro Nagai (1996), “Effects of milk fermented by culturing with various lactic acid bacteria and a yeast on serum cholesterol level in rat”,Journal of Fermentation and BioengineeringVolume 81, Issue 2, Pages 181–182 ... sử dụng alginat tác nhân bảo vệ nhằm gia tăng tỉ lệ sống sót vi khuẩn probiotic Từ lí chúng tơi thực đề tài Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn alginat trình tạo nguyên liệu probiotic chứa L acidophilus ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOA KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ VI KHUẨN CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA L acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người... kết hợp alginat sữa gầy 3.2 Khảo sát khả bảo vệ vi sinh vật alginat sử dụng làm tá 31 dược độn 3.2.1 Khảo sát khả bảo vệ vi sinh vật bột nguyên liệu probiotic 31 có alginat môi trường acid dày