BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC [\ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2 Ở NGƯỜI VIỆT NAM Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHAN THỊ PHƯƠNG THANH Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC [\ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2 Ở NGƯỜI VIỆT NAM Hướng dẫn khoa học TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY Sinh viên thực PHAN THỊ PHƯƠNG THANH CN NGUYỄN VĂN HƯNG Tháng năm 2010 LỜI CẢM ƠN Trong sống, thành đạt đóng góp cơng sức nhiều người, tơi khơng nằm ngồi quy luật Đầu tiên, xin gửi đến ba mẹ gia đình với lời thiêng liêng nhất, người ln hy sinh con, dành cho tình cảm tốt đẹp để ni dạy nên người Em xin chân thành cảm ơn xin gửi lời tri ân sâu sắc Ban Giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh tất quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học vừa qua Em xin chân thành cảm ơn cô Lê Huyền Ái Thúy, anh Nguyễn Văn Hưng truyền đạt kiến thức hướng dẫn, bảo nhiệt tình cho em kiến thức q báu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Giáo sư Maria Jędrzejowsk, giáo sư Monica Stravarachi, giáo sư Wang Wenlan, giáo sư Zilfalil Bin Alwin cung cấp nguồn vật liệu thí nghiệm hướng dẫn cho em để em hồn thành tốt đề tài Em xin cảm ơn Ban Giám Đốc toàn thể anh chị công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á tận tình hướng dẫn giúp đỡ em nhiều thời gian thực khóa luận Xin gửi đến bạn làm khóa luận lời cảm ơn giúp đỡ chia sẻ khó khăn đóng góp ý kiến với tơi suốt thời gian qua Chúc tất bạn thực đề tài thành công tốt đẹp Xin cảm ơn tất bạn chia sẻ tâm sự, giúp đỡ, động viên khích lệ tơi nhiều suốt khoảng thời gian thực đề tài năm tháng học tập mái trường Xin chân thành cảm ơn Phan Thị Phương Thanh i TÓM TẮT Teo tủy sống (SMA) bệnh di truyền gen lặn NST thường, gây rối loạn thần kinh, tế bào thần kinh kiểm soát vận động tủy sống người bệnh chết dần đi, dẫn đến vận động bị thối hóa teo dần Đây bệnh đột biến đồng hợp lặn gen SMN1 94% bệnh nhân Gen SMN2 có độ tương đồng cao với gen SMN1, có mặt tất bệnh nhân bù đắp cho thiếu hụt gen SMN1 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có tương quan số lượng gene SMN2 mức độ trầm trọng bệnh Số gene SMN2 nhiều triệu chứng giảm Do đó, chúng tơi xây dựng quy trình real-time PCR nhằm xác định số lượng gene SMN2, từ dự đốn mức độ bệnh, triệu chứng tuổi thọ bệnh nhân Đề tài sử dụng phương pháp real-time PCR với mẫu dò Taqman dựa nucleotide khác biệt SMN1 với SMN2 Hệ mồi mẫu dị sử dụng từ cơng trình nghiên cứu Curet ctv (2007) khảo sát yếu tố ảnh hưởng lý thuyết thực nghiệm bao gồm khả hoạt động, nhiệt độ lai, độ nhạy hiệu suất khuếch đại Hệ mồi- mẫu dò đạt điều kiện cần thiết thử nghiệm nghiên cứu 32 mẫu bệnh phẩm gồm 20 mẫu bệnh phẩm người Ba Lan, mẫu bệnh phẩm người Malaysia mẫu bệnh phẩm đại trà người Việt Nam Kết thu cho thấy hệ mồi –mẫu dị sử dụng có độ đặc hiệu cao chuyên biệt cho gen SMN2 Số gen SMN2 xác định phương pháp 2-ΔΔCt sử dụng beta-actin làm gen tham chiếu Kết thử nghiệm hoàn toàn phù hợp với số liệu đưa Như hệ mồi – mẫu dò phương pháp Realtime PCR mà đề tài nghiên cứu đem lại kết mong đợi đạt hiệu cao việc xác định số lượng gen SMN2 ii SUMMARY Constructing real-time PCR process determining the copy number of SMN2 gene in Vietnamese The spinal muscular atrophies (SMAs) comprise a group of autosomal-recessive disorders characterized by progressive weakness of the lower motor neurons SMA affects the nerves in an area of the spinal cord called the anterior horn The nerve cells become damaged, breaking the link between the brain and the muscles SMA caused by homozygous absence of SMN1 (survival motor neuron gene) in 94% of patients SMN2- the highly homologous gene, is present in all patients, but it can not compensate for loss of SMN1.The copy number of SMN2 influence to serious disease level Therefore, we construct Real-time PCR process to determine the copy number of SMN2 gene to predict disease level, symptom and longevity of SMA patients We developed a reliable quantitative real-time PCR method with Taqman probe based on differ nucleotide between SMN1 and SMN2 Primer and probe is used from research project of Curet (2007) is tested in theory and experiment including the active ability, hybrid temperature, the sensitivity and amplification efficiency of the process The primer- probe system obtain satisfactory results will be studied in 32 clinical samples including 20 Polish patient samples, Malaysian patient samples and Vietnamese samples The result show primer-probe system has high specificity for SMN2 gene The copy number of SMN2 gene was determined by 2-ΔΔCt method and beta-actin was used as a reference gene The copy number of SMN2 gene in accordance with data provided Hence, the primer- probe system in real-time PCR process to determine the copy number of SMN2 gene has come up to our expectations The development of genetic techniques in the treatment of SMA will be more meaningful when we determine the number of SMN2 gene copies by real -time PCR method Key words: SMA, SMN2, Real-time PCR, Vietnamese, Taqman iii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Danh mục từ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Chương 1: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung đề tài Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Đại cương teo tủy sống 2.1.1 Sơ lược bệnh teo tủy sống 2.1.2 Các dạng bệnh teo tủy sống 2.1.3 Tình hình bệnh teo tủy sống giới Việt Nam 2.1.3.1 Trên giới 2.1.3.2 Việt Nam 2.1.4 Tính di truyền bệnh teo tủy sống 2.1.5 Nguyên nhân di truyền học bệnh teo tủy sống 2.1.6 Chẩn đoán SMA 2.1.7 Chữa trị bệnh teo tủy sống 2.2 Phản ứng Real-time PCR 2.2.1 Đại cương PCR 2.2.1.1 Nguyên tắc PCR 2.2.1.2 Thành phần PCR 10 2.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR 10 2.2.1.4 Số lượng chu kỳ PCR 12 2.2.1.5 Thiết bị dụng cụ cho PCR 12 2.2.1.6 Các ưu điểm hạn chế PCR 12 iv 2.2.1.7 Quá trình PCR 14 2.2.2 Phương pháp Real-time PCR 15 2.2.2.1 Các kiểu phản ứng Real-time PCR 15 2.2.2.2 Một số lưu ý thực Real-time PCR 17 2.2.2.3 Allele Specific Real-time PCR 19 2.2.2.4 Định lượng phản ứng Real-time PCR gen tham chiếu 19 Chương 3: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Vật liệu 21 3.1.1.Vật liệu sinh học 21 3.1.2 Dụng cụ hóa chất 21 3.1.2.1 Dụng cụ 21 3.1.2.2 Hóa chất 21 3.2 Phương pháp 22 3.2.1 Phương pháp tách chiết DNA 22 3.2.1.1 Nguyên tắc tách chiết 22 3.2.1.2 Tiến hành tách chiết 22 3.2.2 Phương pháp thiết kế - đánh giá primer 23 3.2.2.1 Thiết kế primer phần mềm Annhyb 23 3.2.2.2 Thiết kế primer phần mềm Clustal 24 3.2.3 Phương pháp Taqman Real-time PCR 24 2.3.1 Nguyên tắc kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe 24 3.2.3.2 Phản ứng Singleplex Taqman Real-time PCR 26 3.2.3.3 Phản ứng Multiplex Taqman Real-timePCR 26 3.2.4 Phương pháp định lượng tương đối dựa vào gen tham chiếu 26 3.2.4.1 Phương pháp Livak 26 3.2.4.2 Phương pháp Plaffl 27 Chương 4: Kết thảo luận 28 4.1 Kết 28 4.1 Kết lý thuyết 28 4.1.1.1 Kết chạy phần mềm Clustal 28 4.1.1.2 Kết chạy phần mềm Annhyb 32 4.1.1.3 Kết khảo sát tính đặc hiệu primer công cụ BLAST 34 v 4.1.1.4 Kết khảo sát cấu trúc thứ cấp hệ primer-probe 34 4.1.2 Kết thực nghiệm 36 4.1.2.1 Khảo sát khả khuếch đại hệ primer-probe 36 4.1.2.2 Kết khảo sát khả khuếch đại cho multiplex real-time PCR 38 4.1.2.3 Kết khảo sát nhiệt độ lai độ đặc hiệu hệ primer- probe 42 4.1.2.4 Kết khảo sát độ nhạy cho hệ primer- probe 42 4.1.2.5 Kết khảo sát hiệu suất khuếch đại 48 4.1.2.6 Kết xác định số lượng mẫu bệnh phẩm 49 4.2 Thảo luận 51 Chương 5: Kết luận đề nghi 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 Tài liệu tham khảo 52 Phụ lục vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool (chương trình BLAST) Bp Base pair (cặp base) DNA Deoxyribonucleic acid DNTP Deoxynucleoside triphosphat DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography FL Full length IDT Intergrated DNA Technology (công ty IDT) NCBI National Centre for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SMA Spinal Muscular Atrophy (teo tủy sống) SMN Survival Muscular Neurone SMNΔ7 Survival Muscular neurone (SMN thiếu exon 7) SNP Single nucleotide polymorphism snRNPs Small nuclear ribonucleo proteins TAE Tris acid-EDTA Taq Thermus aquaticus Tm Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các type bệnh teo tủy sống Bảng 3.1 Sự tương quan tỷ số 2-∆∆Ct số lượng .25 Bảng 4.1 Trình tự primer probe sử dụng cho gen SMN2 beta-actin 26 Bảng 4.2 Cấu trúc thứ cấp hệ primer probe cho gen SMN2 33 Bảng 4.3 Cấu trúc thứ cấp hệ primer probe cho gen beta-actin 34 Bảng 4.4 kết khảo sát hoạt động hệ primer- probe cho gen SMN2 .34 Bảng 4.5 Kết khảo sát hoạt động hệ primer- probe cho gen beta-actin 35 Bảng 4.6 Kết khảo sát phản ứng singplex gen SMN2 36 Bảng 4.7 Kết khảo sát phản ứng singplex gen beta-actin 37 Bảng 4.8 Kết khảo sát gen SMN2 beta-actin phản ứng multiplex 38 Bảng 4.9 Kết khảo sát nhiệt độ lai độ đặc hiệu cho gen SMN2 39 Bảng 4.10 Kết khảo sát nhiệt độ lai độ đặc hiệu cho gen beta-actin 40 Bảng 4.11 Kết khảo sát độ nhạy cho gen SMN2 41 Bảng 4.12 Kết khảo sát độ nhạy cho gen beta-actin 42 Bảng 4.13 Kết định lượng số mẫu chứng 45 Bảng 4.14 Kết định lượng số mẫu bệnh phẩm 46 viii Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng xây dựng thành cơng quy trình Real-time PCR xác định gen SMN2 gây bệnh teo tủy sống người Việt Nam dựa cơng trình nghiên cứu Curet ctv (2007) với kết sau: ¾ Xây dựng thành công phản ứng Multiplex Real-time PCR xác định số gen SMN2 dựa vào phương pháp định lượng tương đối gen tham chiếu ¾ Độ nhạy quy trình chúng tơi xây dựng đạt mức x102 sao/ml mẫu 5.2 Đề nghị Do giới hạn thời gian điều kiện sở vật chất, đề tài nhiều hạn chế Để đề tài hồn thiện hơn, chúng tơi có số đề nghị: ¾ Khảo sát thêm thông số khác nồng độ mồi, nồng độ probe, MgCl2 tối ưu cho phản ứng Realtime PCR ¾ Tiếp tục hồn thiện xây dựng quy trình Real-time PCR xác định số lượng gen SMN2 quần thể người Việt Nam song song với quy trình Real-time PCR xác định số lượng gen SMN1 để có kết luận khách quan type, mức độ tình trạng bệnh ¾ Ứng dụng nhiều mẫu bệnh phẩm nhằm cho kết đầy đủ mặt thống kê số lượng gen SMN2 cá nhân, vùng, miền cụ thể 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC Trần Diệp Tuấn 2008 Góp phần khảo sát chế di truyền bệnh teo tủy sống type I (Werdnig- hoffmann) Tạp chí y Học TP Hồ Chí Minh Phạm Hùng Vân 2009 PCR real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Aleksandar Radoni, Stefanie Thulke, Ian M.Mackay, Olfert Landt, Wolfgang Siegert and Andreas Nitsche 2004 Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR In: Bio chemical and Biophysical Research Communications: 856-862 Aniko Szabo, Charles M Perou, MehmetKaraca, Laurent Pereard, John F Quacenbush and Phulip S Bernard 2004 Statiscal modeling for selecting housekeeper genes Genome Biology Athanasios I.Tsirikos and Alexander D.L.Baker 2006 Spinal muscular atrophy: Classification, aetiology,and treatment of spinal deformity in children andadolescents Current Orthopaedics 20: 430–444 Bach JR and Bianchi C 2003 Prevention of pectus excavatum for children with Spinal Muscular Atrophy Type Am J Physis Med Rehad: 815 -819 Hendrickson B C, Donohoe C, Akmaev V R, 2005 Differences in SMN1 allele frequencies among ethnic groups within North America J Med Genet 9: 641–644 Brunhilde Wirth, Lars Brichta and Eric Hahnen 2004 Spinal Muscular Atrophy : From Gene to Therapy Pediatric Neurology 1: 121-133 Bradley J.Turner, NicholasJ.Parkinson, Kay E.Davies and Kevin Talbot.2009 Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model Neurobiology of Disease vol.4: 511- 517 Charlotte J.Sumner 2006 Therapeutics Development for Spinal Muscular Atrophy NeuroRx: 235-245 Elisabeth Deindl, Kerstin Boengler, Niels van Royen and Wolfgang Schaper Differential expression of GAPDH and β-actin in growing collateral arteries Molecular and Cellular Biochemistry 1-2 : 139-146 10 Francesca Gabanella, Claudia Carissimi, Alessandro Usiello and Livio Pellizzoni The activity of the spinal muscular atrophy protein is regulated during development and cellular differentiation 2005 HumanMolecularGenetics 23: 3629–3642 11 IlsaGómez-Curet, Karyl G Robinson, Vicky L Funganage, Thomas O Crawford, Mena Scavina and Wenlan Wang 2007 Robust quantification of the SMN gene copy number by real-time TaqMan PCR Neurogenetics 48: 271-278 12 Joshua S Yuan, Ann Reed, Feng Chen and C Neal Stewart Jr 2006 Stastiscal analysis of Real-time PCR data BMC Bioinformatics 7: 85 13 Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders 2009 Real-Time PCR: Current Technology and Applications Caister Academic Press, London, England 14 Leslie Morrison, Marion Main, Thomas O Crawford, Anthony Trela and Participants of the International Conference Ching H Wang, Richard S Finkel, Enrico 52 S Bertini, Mary Schroth, Anita Simonds, Brenda Wong, Annie Aloysius 2007 Consensus Statement for Standard of Care in Spinal Muscular Atrophy, J Child Neurol 22: 1027- 1049 15 Mikael Kubista, Jose Manuel Andrade, Martin Bengtsson, AminForootan, Jiri Jona, KristinaLinda, RadekSindelka, RobertSjo, Bjorn Sjogreen, Linda Stroambom, Anders Stahlberg and Neven Zoric 2006 The real-time polymerase chain reaction Molecular Aspects of Medicine 27: 95- 125 16 Neil J.Gibson 2005 The use of real-time PCR methods in DNA sequence variation analysis Clinica Chimica Acta 363: 32-47 17 Pearn J Incidence 1998 Prevalence and gene frequency studies of chronic childhood spinal muscular atrophy J Med Genet 15: 409 18 Sibylle Jablonka,Wilfried Rossoll, Bertold Schrank and Michael Sendtner The role of SMN in spinal muscular atrophy Jneurol 1: 37- 42 19 Shuji Ogino, Robert Wilson 2004 Spinal Muscular Atrophy: molecular genetics and diagnosis Expert Rev Mol Diagn 4: 15- 29 20 Sun- Yung, Peter gunning, Roger Eddy, Phyllis Ponte, John Leavitt, Thomas Shows and Larry Kedes 2005 Evolution of the Functional Human 3-Actin Gene and Its Multi-Pseudogene Family: Conservation of Noncoding Regions and Chromosomal Dispersion of Pseudogenes Molecular and Cellular Biology: 2720- 2732 21 Iannaccone Susan T 2005 Feline Spinal Muscular Atrophy Pediatric Research 57: 323- 353 22 Tanja Pascale Neuvians, Isabella Gashaw,Christian Georg Sauer, Christianvon Ostau, Sabine Kliesch Martin Bergmann, Axel Hacker and Rainer Grobholz 2005 Standardization strategy for quantitative PCR in human seminoma and normal testis Journal of Biotechnology 2: 163- 171 23 Thomas Rasmussment, Tim Svenstrup Poulsen, Lone Honore and Hansrik Johsen.Quantitation of minimal residual diasease in multiple metyloma using an allen specific real-time PCR assay.Experimental hematology 9: 1039- 1045 24 Umrao R.Monani 2005 Spinal Muscular Atrophy: A Deficiency in a Ubiquitous Protein a Motor Neuron- Specific Disease Neuron 25 Vivian Chan, Ben Yip, Irene Yam, Patrick Au, Che-kit Lin, Virginia Wong, TaiKwong Chan 2004 Carrier incidence for Spinal muscular atrophy in southern Chinese J Neurol 6: 885 -895 25 Yi Ning Su, Chia- Cheng Hung, Hung Li, Chien- Nan Lee, Wen- Fang Cheng, PoNien Tsao, Ming- Cheng Chang, Chia Li Yu, Wu- Shiun Hsieh, Win –Li Lin and SuMing Hsu 2005 Quantitative Analysis of SMN1 and SMN2 Genes Based on DHPLC: A Highly Efficient and Reliable Carrier – Screening Test Human mutation 25: 460467 26 Zhenxi Zhang, Francesco Lotti, Kimberly Dittmar, Ihab Younis, Lili Wan, mumtaz Kasim and Gideon Dreyfuss 2008 SMN Deficiency Causes Tissue-Specific Perturbations in the Repertoire of snRNAs and Wide spread Defects in Splicing Cell 13: 585- 600 53 CÁC THAM KHẢO TỪ INTERNET http://www.bio.davidson.edu http://www.curesma.org http://www.fsma.org http://www.gene-quantification.de http://www.mdausa.org 54 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng trình tự gen download từ NCBI Trình tự Mã số NCBI Mã số gi Số bp SMN1 NG_008691 >gi|209413713|ref|NG_008691.1| 35.072 Exon7,8 AH006635S8 >gi|1314344|gb|U43883.1| 1.266 SMN2 NG_008728 >gi|209447078|ref|NG_008728.1| 35.073 Beta-actin M10277 >gi|177967|gb|M10277.1| 3.646 PHỤ LỤC KẾT QUẢ BLAST PRIMER TRÊN NCBI Kết Blast trình tự hệ mồi – mẫu dò SMN2 trang web NCBI Hình1 Kết Blast trình tự mồi xi SMN2 trang web NCBI Hình Kết Blast trình tự mồi ngược SMN2 trang web NCBI Hình Kết Blast trình tự mẫu dị SMN2 trang web NCBI Kết Blast trình tự hệ mồi – mẫu dò beta-actin trang web NCBI Hình Kết Blast trình tự mồi xi beta-actin trang web NCBI Hình Kết Blast trình tự mồi ngược beta-actin trang web NCBI Hình Kết Blast trình tự mẫu dị beta-actin trang web NCBI ... MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC [\ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2 Ở NGƯỜI VIỆT NAM Hướng dẫn khoa học TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY Sinh viên thực... lượng gene SMN2 mức độ trầm trọng bệnh Số gene SMN2 nhiều triệu chứng giảm Do đó, chúng tơi xây dựng quy trình real-time PCR nhằm xác định số lượng gene SMN2, từ dự đốn mức độ bệnh, triệu chứng... multiplex Taqman Real-time PCR Trong khn khổ khóa luận, chúng tơi xây dựng quy trình multiplex phản ứng Taqman Real-time PCR Điều có ý nghĩa lớn việc xác định số lượng gen SMN2 gen tham chiếu Trong