BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC F G KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BẢO QUẢN TINH TRÙNG CHĨ CỦA MỘT SỐ MƠI TRƯỜNG PHA CHẾ TINH Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : BÙI THỊ THANH HOÀI Niên khóa : 2005 – 2009 Tháng 07/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC F G KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BẢO QUẢN TINH TRÙNG CHĨ CỦA MỘT SỐ MƠI TRƯỜNG PHA CHẾ TINH Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực ThS CHU THỊ KIỀU OANH BÙI THỊ THANH HOÀI Tháng 07/2010   ii LỜI CẢM ƠN Mãi khắc ghi công lao dạy bảo, truyền đạt kiến thức quý thầy cô trường Đại học Nông Lâm TP.HCM suốt quãng đời sinh viên Thành kính ghi ơn ThS Chu Thị Kiều Oanh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên cung cấp tài liệu thiết thực cho lĩnh vực Chân thành cảm ơn thầy TS Lê Đình Đơn, Lê Thị Mai Hương thầy cô môn Công nghệ Sinh học, thầy cô anh chị làm việc Viện Công nghệ Sinh học Môi trường trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM tận tình giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Cảm ơn thầy PGS TS Nguyễn Ngọc Hải, ThS Trần Thị Bích Liên, ThS Nguyễn Thị Thu Năm, hết lòng giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm sống vô quý báu theo suốt đời Chân thành cảm ơn thầy cô khoa Chăn nuôi thú y, BSTY Hồng Thanh Hải, Lê Thị Hà, TS Nguyễn Tất Tồn, KS Ngơ Bá Duy, ThS Hồ Thị Nga ln tận tình giúp đỡ, bảo chia sẻ kinh nghiệm cho suốt trình thực tập Gởi lời cảm ơn sâu sắc đầy yêu thương tới người bạn tốt: Đỗ Ngọc Quyên, Đào Thị Ngọc Hiền, Huỳnh Thị Minh Tâm, Huỳnh Đức Định, Nguyễn Văn Lâm, Hồ Văn Cường, Võ Khánh Hưng, Bùi Văn Thơng ln chia sẻ khó khăn, động viên suốt trình làm đề tài để tơi có kết hơm Cảm ơn người bạn lớp DH05SH, lớp DH05KM, anh chị lớp TC06AV, DH04SH sát cánh suốt năm học trường Mãi cảm tạ công lao bố mẹ sinh thành, dưỡng dục, hết lòng hy sinh đời điểm tựa cho để trưởng thành Cảm ơn hai em luôn động viên, gánh vác công việc gia đình suốt quãng thời gian chị Hai học Cảm ơn anh cho em điểm tựa em thất bại   iii TÓM TẮT Thụ tinh nhân tạo chó dần phổ biến hiệu từ liều tinh đạt chất lượng thụ tinh giúp nhân nhanh cải thiện di truyền đàn chó, đồng thời bảo vệ sức khỏe cho chó đực lẫn chó mùa giao phối Sử dụng tinh chó tươi bảo quản mơi trường nhiệt độ 50C thụ tinh nhân tạo đơn giản, dễ thực với điều kiện vật chất có trại chó giống tốn chi phí vận chuyển, chi phí bảo quản so với tinh viên đông lạnh Đánh giá tinh dịch qua tiêu thể tích tinh dịch thu nhận pha hai thể tích tinh dịch toàn phần, hoạt lực, nồng độ, tỷ lệ tinh trùng sống chết, kỳ hình tinh ngun chó khai thác tay nhóm chó nhỏ 15 kg Đánh giá khả bảo quản tinh trùng ba môi trường bảo quản Tris – glucose, Tris – fructose EDTA tiến hành bảo quản 40C mẫu tinh thu đạt yêu cầu Tỷ lệ chó khai thác tinh 76,67%, tỷ lệ mẫu tinh đạt yêu cầu TTNT 84,72% Tỷ lệ mẫu tinh đạt yêu cầu tăng dần theo thứ tự lần lấy1, 2, 3, 6, 4, 5, tương ứng với tỷ lệ số mẫu đạt 50%, 75%, 91,67%, 91,67%, 100%, 100% Thể tích tinh dịch trung bình thu pha hai 1,42 ml, thể tích tồn phần 3,66 ml, hoạt lực trung bình đạt 0,92, nồng độ 336,71 x 106 tinh trùng/ml, tỷ lệ kỳ hình 6,33%, tỷ lệ sống acrosome tinh ngun 89,29%, tích số VAC bình quân 433,86 x 106 tinh trùng, số liều tinh trung bình cho mồi lần xuất 2,16 liều Thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh (t5) giảm dần theo thự tự ba môi trường Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA tương ứng với thời gian bảo quản 68,98 > 61,92 > 49,36 Sức sống tuyệt đối tinh trùng khả thụ tinh (Sa5) ba môi trường giảm dần theo thứ tự Tris – glucose (4159,14) > Tris – fructose (4001,68) > EDTA (2971,41) Tại thời điểm hoạt lực 0,5 tỷ lệ tinh trùng sống acrosome ba môi trường bảo quản tinh giảm theo thứ tự Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA tương ứng với kết 71,41% > 64,68% > 58,50% Như vậy, khả bảo quản tinh trùng ba môi trường theo thứ tự giảm dần Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA   iv SUMMARY The use of chilled, extended semen – stored at 40C – in dog breeding is becoming increasingly popular as preparation and transport is less expensive and regulations are often less complicated than for frozen semen Behind that, artificial insemination can prevent the spread of sexual diseases and decrease stress for female dogs in copulation season when many bitches are estrous at the same time Canine semen was collected and examed for volume of second (sperm-rich) fraction, total volume, acttivity, total sperm count, morphology and acrosome integrity before it stored at 40C Chilled semen was preserved in three extenders: Tris – glucose, Tris – fructose, EDTA, adding of egg yolk Conservation of these media was evaluated for activity, and acrosome integrity at the fixed time 7.00 AM and 15.00 PM every day until 50% conservation rate of motile spermatozoa was observed Dog semen was collected 76.67% of total number of dogs; 84.72% quality semen samples for artificial insemination Chilled semen was examed for results: average volume of second fraction – 1.42 ml; total volume – 3.66 ml, percentage of abnormal morphology – 6.33%, acrosome integrity – 89.29%; activity – 0.92, concentration – 336.71 x 106 cell/ml, , VAC – 433.86 x 106 cell, semen dosage – 2,16 The proportion of “t5” (the viability time of sperm) in three extenders are classified in decreasing order as follows: Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA with the following rates (mean ± SD): 68.98 ± 8.80 > 61.92 ± 9.27 > 49.36 ± 9.45 (hours), respectively The proportion “Sa5” (the absolute viability of spermatozoa) in the three extenders was also desreased in the order: Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA with (mean ± SD) 4405.29 ± 434.96 > 4001.68 ± 576.47 > 2922.826 ± 375.06, respectively The percentage of live and intact acrosome spermatozoa was ordered: Tris – glucose (71.41 ± 4.48%) > Tris – fructose (64.68 ± 2.73%) > EDTA (58.50 ± 1.94%)   v MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách bảng xi Danh sách hình xii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử phát triển thụ tinh nhân tạo 2.2 Sơ lược cấu tạo quan sinh dục đực chó 2.2.1 Bìu dái 2.2.2 Dịch hoàn 2.2.3 Phó dịch hồn 2.2.4 Ống dẫn tinh 2.2.5 Các tuyến sinh dục phụ 2.2.6 Dương vật, bao dương vật, xương dương vật ống dẫn tiểu 2.3 Tinh dịch tinh trùng 2.3.1 Đặc tính tinh 2.3.2 Sơ lược cấu tạo tinh trùng   vi 2.3.2.1 Đầu tinh trùng 10 2.3.2.2 Cổ thân tinh trùng .11 2.3.2.3 Đuôi tinh trùng 11 2.3.3 Các đặc tính tinh trùng 12 2.3.3.1 Đặc tính sinh vật học tinh trùng 12 2.3.3.2 Đặc tính tiến thẳng 13 2.3.3.3 Đặc tính chạy ngược dòng .13 2.3.3.4 Đặc tính tiếp xúc 14 2.3.3.5 Đặc tính tiếp xúc với hóa chất 14 2.3.3.6 Đặc tính tiếp xúc với điện 14 2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sức sống tinh trùng 14 2.3.4.1 Nhiệt độ 14 2.3.4.2 Nước 15 2.3.4.3 Các chất có tính sát trùng 15 2.3.4.4 Ánh sáng 15 2.3.4.5 Khơng khí 15 2.3.4.6 Vật dơ bẩn, vi trùng 16 2.4 Khai thác tinh chó 16 2.4.1 Chế độ lấy tinh 16 2.4.2 Khai thác tinh chó .16 2.4.2.1 Khai thác tinh âm đạo giả .17 2.4.2.2 Khai thác tinh chó tay .17 2.5 Môi trường bảo quản tinh dịch 18 2.5.1 Các yêu cầu môi trường nhiệt độ bảo quản .18 2.5.1.1 Áp suất thẩm thấu (Posm) .19 2.5.1.2 pH lực đệm môi trường .19   vii 2.5.1.3 Các chất điện giải không điện giải môi trường 20 2.5.1.4 Độ nhớt môi trường 20 2.5.1.5 Dưỡng chất môi trường 20 2.5.1.6 Nhiệt độ lạnh trình bảo quản 20 2.5.2 Các môi trường bảo quản tinh tươi chó .22 2.5.3 Tác dụng thành phần môi trường bảo quản 23 2.5.3.1 Tác dụng chất đệm 23 2.5.3.2 Tác dụng lòng đỏ trứng gà 23 2.5.3.3 Vai trò kháng sinh .24 2.5.3.4 Tác dụng nước cất .24 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Địa điểm, thời gian thực đề tài 25 3.2 Vật liệu 25 3.2.1 Dụng cụ .25 3.2.2 Hóa chất 25 3.3 Phương pháp tiến hành khai thác bảo tồn tinh dịch 25 3.3.1 Đối tượng khai thác tinh dịch .25 3.3.2 Khai thác tinh dịch chó tay 25 3.3.3 Đánh giá tinh dịch 27 3.3.3.1 Đánh giá mắt thường 27 3.3.3.2 Đánh giá phòng thí nghiệm 28 3.3.4 Môi trường bảo quản tinh 32 3.3.5 Đánh giá khả bảo quản tinh trùng môi trường 33 3.3.5.1 Thời gian sống sức sống tinh trùng sau tiến hành bảo quản 33 3.3.5.2 Tỷ lệ tinh trùng sống acrosome 34 3.4 Phương pháp xử lý số liệu .34   viii Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Kết khai thác tinh chó tay 35 4.2 Đánh giá tinh dịch 35 4.2.1 Đánh giá thể tích tinh dịch thu khai thác tay 37 4.2.2 Đặc điểm tinh nguyên chó kiểm tra phòng thí nghiệm 39 4.2.3 Tích số VAC số liều tinh lần xuất 41 4.3 Khả bảo quản tinh trùng số môi trường 41 4.3.1 Thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh (t5) 41 4.3.2 Sức sống tuyệt đối khả thụ tinh (Sa5) 42 4.3.3 Tỷ lệ tinh trùng sống acrosome thời điểm hoạt lực 0,5 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị 46 Tài liệu tham khảo .48   ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A : Activity (hoạt lực) BES : N, N - bis (2 - hydroxyethyl) - aminoethane - sulfonic acid C : Concentration (nồng độ) EDTA : Ethylene diamine tetra acetic acid K : Kỳ hình Sa : Sức sống tuyệt đối tinh trùng Sa5 : Sức sống tuyệt đối tinh trùng khả thụ tinh SC : Sống acrosome SD : Standard deviation (độ lệch chuẩn) t : Thời gian tinh trùng trì hoạt lực a t5 : Thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh Tris : (hydroxymethyl) – aminomethane TTNT : thụ tinh nhân tạo V : Thể tích (ml) Vpha2 : Thể tích tinh dịch pha thứ hai Vtp : Thể tích tinh dịch pha tồn phần VAC : Tích số ba tiêu gồm thể tích tinh dịch pha hai (Vpha 2) x hoạt lực (A) x nồng độ (C)   x thời gian Còn mẫu tinh đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn quy định TTNT, theo dõi biến đổi hoạt lực tinh trùng qua mốc thời gian 3.3.5 Đánh giá khả bảo quản tinh trùng môi trường Ngay sau tiến hành pha lỗng tinh khai thác từ nhóm chó chọn, tinh tiến hành đánh giá hoạt lực ghi nhận lúc giờ, thời gian kiểm tra hoạt lực ấn định vào hai thời điểm ngày sáng 15 chiều Tinh dịch sau pha loãng môi trường bảo quản trữ tủ mát 40C Thể tích tinh dịch thu từ 0,8 – 3,2 ml nên tiến hành bảo quản vào ống eppendorf kiểm tra hoạt lực cách trộn tinh trùng môi trường pipette 10 – 100 µl hút khoảng 50 µl nhỏ lên lam kính Phần lại bảo quản tiếp thể tích tinh dịch thu pha hai Nếu thể tích tinh dịch thu pha hai nhiều, bảo quản nhiều eppendorf, sử dụng để khảo sát hoạt lực 0,5 3.3.6 Thời gian sống sức sống tinh trùng sau tiến hành bảo quản Theo Nguyễn Tấn Anh Nguyễn Quốc Đạt (1997), sức sống tuyệt đối tinh trùng tính theo cơng thức: Sa = at Trong đó: Sa: số sức sống tuyệt đối tinh trùng a: sức hoạt động thực tế tinh trùng khoảng thời gian hai lần kiểm tra (lần trước lần sau thời điểm cần tính) t: thời gian mà tinh trùng trì sức hoạt động a Thời gian tính theo cơng thức tn = (Tn+1 – Tn-1)/2 Trong đó: tn: thời gian mà tinh trùng có sức hoạt động thực lần kiểm tra Tn+1: thời gian bảo quản từ lúc bắt đầu thí nghiệm đến lần kiểm tra sau Tn-1: thời gian bảo quản từ lúc bắt đầu thí nghiệm đến lần kiểm tra trước Ngay lúc bắt đầu thí nghiệm, n = nên Tn-1 = Do đó, ta có: tn = (Tn=1)/2 Khi kết thúc thí nghiệm, Tn+1 = Do đó, ta có: tn = (Tn – Tn-1)/2 Trong trình theo dõi sức sống tinh trùng, thường người ta quan tâm nhiều đến số sức sống tuyệt đối tinh trùng khả thụ tinh (Sa5), tương   34 ứng với thời gian sống tinh trùng khả thụ tinh (t5), tức tính đến tinh trùng sức hoạt động tiến thẳng đến 0,5 3.3.6.1 Tỷ lệ tinh trùng sống acrosome Trong q trình bảo quản chúng tơi theo dõi Sa5 t5 100 mẫu theo dõi thêm tỷ lệ sống acrosome thời điểm hoạt lực 0,5 Tiến hành: thời điểm xác định hoạt lực 0,5 bảo quản hai môi trường tối ưu, lấy giọt tinh đem nhuộm kỹ thuật nhuộm Kovács, để xác định tỷ lệ sống acrosome sau bảo quản Xem mẫu vật kính 100, đếm tinh trùng có phần đầu bắt màu hồng mịn phần có màu trắng số 100 tinh trùng đếm 3.4 Phương pháp xử lý số liệu Kết thu được xử lý phương pháp thống kê sinh học theo thống kê mô tả, trắc nghiệm F Excel 2003   35 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khai thác tinh chó tay Với phương pháp khai thác tinh chó tay, chúng tơi tiến hành khai thác tinh 16 chó đực độ tuổi – năm tuổi có trọng lượng < 15 kg Ở nhóm hầu hết chó ta (chó cỏ), có chó cảnh (giống chó Nhật, giống chó nhỏ Chiwawa, ) chiếm tỷ lệ 37,5% Trong trình khai thác tinh lặp lại lần tuần, có chó khơng lấy tinh lần khai thác chiếm 23,33%, có 12 chó cho khai thác tinh đạt tỷ lệ khai thác 76,67% Bảng 4.1 Khai thác tinh chó với phương pháp lấy tinh tay Nhóm chó Tổng số chó Số chó khai thác Số chó khơng khai tinh thác tinh % Con % Con % Chó cảnh 37,5 83,33 16,67 Chó ta 10 62,5 70 30 Tính chung 16 12 76,67 23,33 P 0,50 Bảng 4.1 cho thấy khơng có khác biệt ý nghĩa khai thác tinh nhóm chó ta với nhóm chó cảnh với p > 0,05 Tuy nhiên, chó ta thường ni thả tự do, chăm sóc, dưỡng, tính hoang dã cao: nhút nhát, khó cầm cột, làm quen, vuốt ve, âu yếm để tạo tình nguyện tham gia phản xạ xuất tinh, nên tỷ lệ khai thác tinh thấp Còn chó cảnh ni chăm sóc kỹ hơn, thân thiện hơn, khôn ngoan, biết lời nên dễ gây hưng phấn kích thích lấy tinh tay, người lấy tinh lấy mà khơng cần phụ tá dễ tạo phản xạ xuất tinh cho lần lấy tinh sau 4.2 Đánh giá tinh dịch Với 12 chó đực khai thác tinh dịch trình lấy tinh tay thu nhận 72 mẫu, có 61 mẫu tinh đạt yêu cầu đặt ra: tích pha thứ hai đạt từ 0,8 – 2,2 ml, hoạt lực lớn 0,7 tỷ lệ kỳ hình nhỏ 15%, chiếm 84,72% mẫu tinh khai thác Những mẫu tinh chia nhỏ bảo quản   36 môi trường Tiến hành kiểm tra định kỳ theo mốc thời gian cố định vào lúc sáng 15 chiều Kết thu nhận tinh dịch trình bày qua bảng 4.2 Bảng 4.2 Tỷ lệ mẫu tinh thu nhận đạt yêu cầu thụ tinh nhân tạo Nhóm chó Số mẫu tinh đạt yêu cầu Số mẫu tinh bị loại thải Mẫu % Mẫu % Chó cảnh 26 86,67 13,33 Chó ta 35 80,95 19,05 Tính chung 61 84,72 11 15,28 p 0,4097 Từ bảng 4.2 cho thấy khơng có khác biệt ý nghĩa tỷ lệ mẫu tinh đạt yêu cầu hai nhóm chó p > 0,05 Có 11 mẫu tinh bị loại thải, chiếm 15,28%, mẫu tinh lấy từ chó cảnh ni nhốt lâu ngày, có hội giao phối tự với chó nên tinh trùng bị dồn nén lâu làm cho tỷ lệ kỳ hình cao, ảnh hưởng đến tỷ lệ số mẫu tinh đạt yêu cầu mẫu tinh thất bại lần lấy tinh chó ta tích thu nhỏ 0,8 ml Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tinh đạt yêu cầu tăng lần khai thác sau tỷ lệ kỳ hình giảm rõ rệt Kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Tỷ lệ mẫu tinh đạt không đạt theo số lần khai thác Nhóm chó   Chó cảnh Khơng Chó ta Khơng Tính chung Khơng % Đạt % 50 50 75 25 11 91,67 8,33 12 100 0 Lần 5 12 100 0 Lần 11 91,67 8,33 Tổng cộng 26 35 61 84,72 11 15,28 Đạt Chỉ tiêu Đạt Lần 3 Lần Lần Lần đạt đạt 37 đạt Với 61 mẫu đạt yêu cầu, qua phân tích theo thứ tự số lần khai thác, nhận thấy tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu tăng dần theo thứ tự: 1, 2, 3, 6, 4, tương ứng với tỷ lệ số mẫu đạt 50%, 75%, 91,67%, 91,67%, 100%, 100% Từ số liệu thu thập được, so sánh với kết thu Thái Thị Mỹ Hạnh (2005), chúng tơi thấy có tương đồng Số mẫu thu nhận tăng dần lần thứ nhất, thứ hai thứ ba, tăng cao lần thứ tư thứ năm giảm lần thứ sáu Điều giải thích rằng, lần khai thác đầu, chó đực chưa kịp làm quen với việc khai thác tinh tay Do đó, chưa đạt hưng phấn hồn tồn để chó đực xuất tinh trọn vẹn pha hai Bên cạnh đó, lần lấy tinh đầu người kỹ thuật viên chưa hoàn tồn nắm bắt tính con, đồng thời thao tác chưa thực thành thạo, chưa đáp ứng tốt giai đoạn hưng phấn chó đực Mặt khác, lần lấy đầu, chất lượng tinh dịch bị ảnh hưởng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao có số chó đực trước chưa khai thác giao phối chưa đến mùa sinh sản Ở lần lấy tinh sau, chó đực dần quen với cách lấy tinh tay, đồng thời có phản xạ lấy tinh lần sau người lấy tinh làm động tác chuẩn bị lấy tinh biểu nhảy chồm lên người lấy tinh tượng nhảy chồm lên thể chó trước lúc giao phối Ở lần lấy tinh thứ 6, có giảm nhẹ số lượng mẫu đạt Theo Thái Thị Mỹ Hạnh (2005), giải thích ảnh hưởng tác động mùa giao phối, thường cuối mùa xuân hay mùa thu, phẩm chất tinh dịch tinh dịch chứa chủ yếu tinh Do lúc không rộ lên giống chó làm giảm hưng phấn sản xuất tinh chó đực 4.3 Đánh giá thể tích tinh dịch thu khai thác tay Khi tiến hành khai thác tinh chó tay thu 61 mẫu tinh đạt yêu cầu Kết thể tích tinh dịch thu pha thứ hai thể tích tồn phần trình bày bảng 4.4   38 Bảng 4.4 Thể tích tinh dịch chó thu tiến hành khai thác tinh chó tay Nhóm chó Số mẫu thu Vpha Vtoàn phần Vpha 2/Vtoàn phần (%) Chó cảnh 26 1,37 ± 0,06 3,58 ± 0,16 38,22 Chó ta 35 1,45 ± 0,06 3,72 ± 0,15 38,7 Trung bình 61 1,42 ± 0,04 3,66 ± 0,11 38,56 0,51 0,194 0,51 p Qua bảng 4.4, thấy thể tích tinh dịch thu pha thứ hai thể tích tinh dịch tồn phần hai nhóm chó khơng có khác biệt p > 0,05 Thể tích tinh thu nhận trung bình pha hai 1,42 ml thể tích tinh tồn phần 3,66 ml, khơng có khác biệt ý nghĩa thể tích tinh dịch thu hai nhóm Cũng giải thích tương đồng hai nhóm chó thuộc nhóm chó nhỏ 15 kg lực sản xuất tinh trùng ln phụ thuộc vào trọng lượng hai dịch hoàn (Hosken, 1996) Điều phù hợp với Evans Christensen (1979), mức tương quan trọng lượng hai dịch hoàn trọng lượng thể 0,064% Thể tích tinh dịch thu pha hai dao động từ 0,5 – ml (Turner, 1996), 2,1 ± 0,1 ml (Yildiz ctv, 2002), – ml (Iguer Verstegen, 2001), – ml (Hosken, 1996), so sánh với kết thu từ thí nghiệm ta thấy, khơng có khác biệt ý nghĩa thể tích Kết phù hợp với kết khai thác tinh chó Thái Thị Mỹ Hạnh (2005), với thể tích tinh dịch thu nhận pha thứ hai 1,64 ml; thể tích tinh dịch tồn phần 3,66 ml nhóm chó nhỏ 15 kg Qua bảng 4.4 nhận thấy thể tích tinh dịch pha hai chiếm trung bình 38,56% thể tích tinh dịch tồn phần, tỷ lệ cao kết thu nhận tinh dịch Hosken (1996) Hosken, thu thể tích tinh dịch pha hai dao động từ – ml, chiếm 10% thể tích tinh dịch tồn phần Điều giải thích Hosken dùng âm đạo giả để khai thác tinh dịch tạo kích thích tổng hợp đủ mạnh liên tục, tạo hưng phấn tồn diện kéo dài cho chó đực suốt pha trình xuất tinh nên thể tích tinh tồn phần thu chứa lượng tinh nhiều hơn, mà chủ yếu dịch tiết từ tuyến tiền liệt tinh tiết chủ yếu pha ba pha bốn, so sánh thể tích pha hai, thấy khơng có khác biệt ý nghĩa thể tích so với lấy tinh tay   39 4.3.1 Đặc điểm tinh nguyên chó kiểm tra phòng thí nghiệm Đặc điểm tinh nguyên kiểm tra sau xác định thể tích tinh dịch Kết trình bày qua bảng 4.5 Bảng 4.5 Đặc điểm tinh nguyên chó Nhóm chó A n C (106 tinh K SC trùng/ml (%) (%) Ā SD Ā SD Ā SD Ā SD Chó cảnh 26 0,91 0,05 333,92 34,10 5,85 2,45 90,11 4,30 Chó ta 35 0,93 0,05 338,79 66,50 6,68 2,90 88,68 4,44 61 0,92 0,05 336,71 54,74 6,33 2,73 89,29 4,40 Tính chung P 0,302 0,000 0,194 0,441 Đặc điểm hoạt lực qua bảng 4.5, chúng tơi thấy khơng có khác biệt ý nghĩa đặc điểm hoạt lực tinh trùng hai nhóm chó với p > 0,05 Hoạt lực trung bình kiểm tra 0,92 Kết tương đương với kết báo cáo Thái Thị Mỹ Hạnh (2005), 0,95 nhóm chó nhỏ 15 kg Đồng thời cho kết tương tự với kết Iguer Vestegen (2001), khảo sát chó Beagle có độ tuổi – năm, cho hoạt lực trung bình dao động từ 85 – 95%; Shahiduzzaman (2007) khảo sát 11 chó từ – năm tuổi giống chó khác có kết hoạt lực trung bình từ 85 – 95% Nồng độ tinh trùng bảng 4.5 cho thấy có khác biệt có ý nghĩa nồng độ tinh trùng thu hai nhóm chó Nhóm chó cảnh cho nồng độ tinh trùng 333,92 ± 34,1 x 106 tinh trùng/ml, nhóm chó ta 338,79 ± 66,5 x 106 tinh trùng/ml Nồng độ tinh trùng trung bình 336,71 ± 54,74 x 106 tinh trùng/ml Kết kết Thái Thị Mỹ Hạnh (2005), thu kết 346,92 ± 32,11 x 106 tinh trùng/ml nhóm chó nhỏ 15 kg nồng độ trung bình hai nhóm chó từ nhỏ 15 kg đến lớn 30 kg 318,69 ± 35,00 x 106 tinh trùng/ml; Iguer Vestegen (2001), thu nồng độ 342 ± 25 x 106 tinh trùng/ml; nhiều kết Shahiduzzaman (2007) 264,7 ± 26,8 x106 tinh trùng/ml; Kutzler (2005) tiến hành   40 khai thác tinh chó phương pháp âm đạo giả 381,7 ± 104,6 x 106 tinh trùng/ml, điện 243,4 ± 60,5 x 106 tinh trùng/ml Qua bảng 4.5, nhận thấy khơng có khác biệt ý nghĩa tỷ lệ kỳ hình tinh trùng hai nhóm chó thí nghiệm Tỷ lệ kỳ hình trung bình thí nghiệm 6,33% chủ yếu kỳ hình Kết phù hợp với kết luận Iguer Verstegen (2001), Shahiduzzaman (2007), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình chó nhỏ 15%; kết nghiên cứu Thái Thị Mỹ Hạnh (2005), tỷ lệ kỳ hình nhóm chó nhỏ 15 kg 6,72% Perez đưa tỷ lệ kỳ hình tinh trùng chó trung bình 8,7% kỳ hình chiếm tỷ lệ cao 4,3%, kỳ hình cổ 2,2% kỳ hình đầu 2,2% Hình 4.1 Kỳ hình tinh trùng chó Tỷ lệ sống acrosome thể qua bảng 4.5 cho thấy khơng có khác biệt ý nghĩa hai nhóm p > 0,05 Ở đây, hai tiêu quan tâm có ảnh hưởng định đến khả thụ tinh tinh trùng tỷ lệ sống acrosome Kết cho tỷ lệ sống acrosome nhóm chó cảnh 90,11%, nhóm chó ta 88,68%, tỷ lệ sống acrosome trung bình 89,29% Điều giải thích mẫu tinh nhóm chó ta nhiều nhóm chó cảnh lần lấy đầu chưa vào mùa giao phối nên tỷ lệ tinh trùng chết ảnh hưởng đến kết lần sau Tuy nhiên, kết cao kết Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) thu tỷ lệ sống acrosome 87,96% cho nhóm chó nhỏ 15 kg tỷ lệ sống acrosome trung bình nhóm thí nghiệm 87,04%   41 4.3.2 Tích số VAC số liều tinh lần xuất Bảng 4.6 Tích số VAC số liều tinh lần xuất Nhóm chó Số mẫu VAC Số liều tinh (106 tinh trùng/lần) (liều/lần) Chó cảnh 26 413,58 ± 65,13 2,07 Chó ta 35 448,93 ± 98,57 2,24 Trung bình 61 433,86 ± 87,09 2,16 p 0,018 VAC tích ba tiêu: thể tích tinh dịch pha hai x hoạt lực x nồng độ tinh trùng Qua bảng 4.6, chúng tơi nhận thấy tích số liều tinh hai nhóm khơng có khác biệt ý nghĩa với p > 0,001 VAC trung bình 433,86 ± 87,09 x 106 tinh trùng/lần Từ tích số VAC thu chia cho x 106 tinh trùng chúng tơi có số liều tinh bình qn lần xuất tinh chó 2,16 liều Kết thu nhỏ kết Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) với số liều tinh trung bình 3,1 liều, số liều tinh nhóm chó nhỏ 15 kg 2,38 liều, nhóm chó lớn cho số liều tinh lên đến 3,65 liều Do Thái Thị Mỹ Hạnh thực nhiều nhóm chó có trọng lượng lớn, cho tích số VAC cao nên kết tích số VAC trung bình cao 4.4 Khả bảo quản tinh trùng số môi trường Khả bảo quản môi trường thể hai tiêu cần theo dõi thời gian sống khả thụ tinh sức sống tuyệt đối khả thụ tinh tinh trùng 4.4.1 Thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh (t5) Những mẫu tinh đạt yêu cầu chia nhỏ bảo quản môi trường Tris – glucose, Tris – fructose, EDTA nhiệt độ 40C Kết thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh môi trường thể qua bảng 4.7 Bảng 4.7 Thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh (t5) Môi trường Tris – glucose Tris – fructose EDTA Số mẫu 100 100 100 T5 (giờ) 68,98 ± 8,80 61,92 ± 9,27 49,36 ± 9,45 P   0,373 42 Qua bảng 4.7, nhận thấy khác biệt không ý nghĩa thời gian bảo quản bảo quản tinh ba môi trường Tris – glucose, Tris – fructose, EDTA với p > 0,05 tương ứng với thời gian bảo quản 68,98; 61,92 49,36 So sánh với kết Iguer Verstegen (2001) bảo quản tinh dịch chó môi trường Tris – glucose, Tris – fructose, EDTA cho kết thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh 13,1; 9,7 ngày, thấy kết Iguer cao nhiều Điều giải thích yếu tố: nhiệt độ, khí hậu mơi trường, điều kiện phòng thí nghiệm tác động đến kết thí nghiệm So sánh với kết Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) bảo quản tinh dịch chó môi trường Tris – glucose, EDTA cho thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh 65,24 19,96 Với kết thu được, môi trường Tris – glucose môi trường EDTA cho thời gian bảo quản lâu kết Thái Thị Mỹ Hạnh Điều giải thích thí nghiệm Thái Thị Mỹ Hạnh dùng nhiều nhóm chó khác nhau, có trọng lượng chênh lệch lớn, dao động từ nhỏ 15 kg đến lớn 30 kg nên phẩm chất tinh dịch không đồng nhất; nồng độ, hoạt lực chênh lệch lớn ảnh hưởng đến chất lượng tinh ban đầu Bảng 4.7 thể thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh Nhưng dựa vào tiêu mà kết luận môi trường tốt mơi trường khác mơi trường cho thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh lâu, số tinh trùng trì hoạt lực mức thời gian ngắn Do đó, để so sánh tính tối ưu mơi trường, ngồi việc theo dõi thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh phải theo dõi tiêu sức sống tuyệt đối tinh trùng đến thời điểm hoạt lực 0,5 4.4.2 Sức sống tuyệt đối khả thụ tinh (Sa5) Bảng 4.8 Sức sống tuyệt đối (Sa5) tinh trùng chó Mơi Tris – glucose Tris – fructose EDTA Số mẫu 100 100 100 Sa5 4405,29 ± 434,96 4001,68 ± 576,47 2922,826 ± 375,06 trường p   0,000 43 Qua bảng 4.8, nhận thấy số sức sống tuyệt đối tinh trùng ba mơi trường có khác biệt ý nghĩa với p < 0,001 Sức sống tuyệt đối tinh trùng giảm dần ba môi trường bảo quản Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA tương ứng với kết 4159,14 > 4001,68 > 2971,41 Kết tương tự với Iguer Verstegen (2001) Điều giải thích S Ponglowhapan (2004) môi trường bảo quản, tinh trùng tiêu thụ đường glucose nhiều tiêu thụ đường fructose có nồng độ Vì đường cung cấp lượng cho vận động tinh trùng Kết cho sức sống tuyệt đối tinh trùng môi trường cao kết Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) với sức sống tuyệt đối Sa5 Tris – glucose EDTA 4230,3 1994,8 Điều giải thích thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh dài nên kéo theo sức sống tuyệt đối tăng theo 4.4.3 Tỷ lệ tinh trùng sống acrosome thời điểm hoạt lực 0,5 Bảng 4.9 Tỷ lệ tinh trùng sống acrosome thời điểm hoạt lực 0,5 Mơi trường Số mẫu SC (%) Tris – glucose 100 71,41 ± 4,48 Tris – fructose 100 64,68 ± 2,73 EDTA 100 58,50 ± 1,94 P 0,000 Qua bảng 4.9, chúng tơi nhận thấy có khác biệt ý nghĩa tỷ lệ tinh trùng sống acrosome ba môi trường bảo quản với p < 0,001 Tại thời điểm hoạt lực 0,5 tỷ lệ tinh trùng sống acrosome ba mơi trường bảo quản giảm dần theo thứ tự Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA tương ứng với kết 71,41% > 64,68% > 58,50%   44 Hình 4.2 Tinh trùng chó sau nhuộm Kovács Từ ba bảng 4.7, 4.8 bảng 4.9, nhận thấy khả bảo quản tinh trùng chó mơi trường xếp theo thứ tự Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA Kết phù hợp với kết Iguer Verstegen (2005)   45 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Căn vào kết đạt được, số kết luận rút ra: - Tỷ lệ chó thu tinh dịch 76,67%, tỷ lệ mẫu tinh đạt yêu cầu TTNT 84,72% Tỷ lệ mẫu tinh đạt yêu cầu tăng dần theo thứ tự: 1, 2, 3, 6, 4, tương ứng với tỷ lệ số mẫu đạt 50%, 75%, 91,67%, 91,67%, 100%, 100% Do đó, dùng tay để khai thác tinh dịch mà không cần đến âm đạo giả - Thể tích tinh dịch trung bình thu pha hai 1,42 ml, thể tích tồn phần 3,66 ml, hoạt lực trung bình đạt 0,92, nồng độ 336,71 x 106 tinh trùng/ml, tỷ lệ kỳ hình 6,33%, tỷ lệ sống acrosome tinh nguyên 89,29%, tích số VAC trung bình 433,86 x 106 tinh trùng Cho thấy tinh dịch chó thu có hoạt lực tinh trùng mạnh, nồng độ tinh trùng cao, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ít, tỷ lệ tinh trùng sống acrosome tinh nguyên cao Vì vậy, sử dụng tinh dịch từ phương pháp lấy tinh tay TTNT với số liều tinh pha lỗng trung bình cho lần xuất 2,16 liều - Thời gian tinh trùng sống khả thụ tinh ba môi trường bảo quản tinh giảm dần theo thứ tự Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA, tương ứng với thời gian bảo quản 68,98 > 61,92 > 49,36 sức sống tuyệt đối khả thụ tinh giảm dần ba môi trường bảo quản Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA tương ứng với kết 4159,14 > 4001,68 > 2971,41 - Tại thời điểm hoạt lực 0,5 tỷ lệ tinh trùng sống acrosome ba mơi trường bảo quản tinh giảm theo thứ tự Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA tương ứng với 71,41% > 64,68% > 58,50% Từ kết thu được, kết luận khả bảo quản tinh trùng chó mơi trường theo thứ tự tốt giảm dần Tris – glucose > Tris – fructose > EDTA 5.2 Đề nghị - Sử dụng tinh bảo quản môi trường để kiểm tra mức độ bảo quản thực tế môi trường tỷ lệ đậu thai tiến hành thụ tinh cho chó   46 - Đối với trại chó giống nên áp dụng phương pháp TTNT cho chó để nhân nhanh giống tốt, giảm căng thẳng cho chó đực đến mùa giao phối, hạn chế bệnh tật cho chó cái, giảm chi phí vận chuyển tăng hiệu suất nhân giống mùa chó lên giống hàng loạt - Tiến hành bảo quản tinh chó đơng lạnh, từ so sánh hiệu tinh đông lạnh với tinh tươi bảo quản 40C   47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Tấn Anh Nguyễn Quốc Đạt 1997 Thụ tinh nhân tạo gia súc – gia cầm Nhà xuất Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Duệ 2004 Ảnh hưởng nước cất kháng sinh môi trường pha chế tinh lên sức sống khả gây thụ thai tinh trùng heo Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Trần Tiến Dũng 2002 Sinh sản gia súc Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Thái Thị Mỹ Hạnh 2005 Khảo sát khả khai thác tinh chó khả bảo quản số môi trường pha chế tinh Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Thân Văn Hiển 2008 Nghiên cứu khả sản xuất đực Lai Ly L19 nuôi tỉnh Bắc Giang Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên (http://www.Irc-tnu.edu.vn) Đỗ Văn Thu, Nguyễn Anh, Nguyễn Tuấn Anh 2008 Nghiên cứu ảnh hưởng số loại đường lên phẩm chất tinh dịch chó q trình đơng lạnh Tạp chí Khoa Học Công Nghệ tập 46, số 3, 2008: 31 – 38 Đỗ Văn Thu, Nguyễn Anh, Lê Thành Đô, Nguyễn Anh Tuấn 2007 Kết nghiên cứu số tiêu sinh học tinh dịch chó Phú Quốc Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn số 12 +13 – tháng + 7/2007: 122 – 123 Đỗ Văn Thu, Lê Thành Đô, Nguyễn Anh 2005 Nghiên cứu môi trường bảo tồn tinh dịch cừu nhiệt độ 50C Tạp chí Sinh học tháng – 2005: 90 – 91 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI A.K.M Shahiduzzaman, C Linde-Forsberg 2007 Induced immotility during long-term storage at +50C does not prolong survival of dog spermatozoa Theriogenology 68: 920 – 933 10 M Iguer-ouada, J.P Verstegen 1999 Long-term preservation of chilled canine semen: effect of commercial and laboratory prepared extenders Theriogenology 55: 671 – 684 11 Michelle Anne Kutzler 2005 Semen collection in the dog Theriogenology 64: 747 – 754 12 Suppawiwat Ponglowhapan, Birgitta Essén-Gustavsson, Catharina Linde Forsberg 2004 Influence of glucose and fructose in the extender during long-term storage of chilled canine semen Theriogenology 62: 1498 – 1517 13 Tsukasa Okano, Tetsuma Murase, Makoto Asano and Tsubota 2004 Effects of final dilution rate, sperm concentration and times for cooling and glycerol equilibration on post-thaw characteristics of canine spermatozoa Theriogenology 66: 1359 – 1364   48 ... MỘT SỐ MƠI TRƯỜNG PHA CHẾ TINH Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực ThS CHU THỊ KIỀU OANH BÙI THỊ THANH HOÀI Tháng 07/2010   ii LỜI CẢM ƠN Mãi khắc ghi công lao dạy bảo, truyền đạt kiến thức quý... Thành kính ghi ơn ThS Chu Thị Kiều Oanh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên cung cấp tài liệu thi t thực cho lĩnh vực Chân thành cảm ơn thầy TS Lê Đình Đơn, Lê Thị Mai Hương thầy cô môn Công... kinh nghiệm sống vô quý báu theo suốt đời Chân thành cảm ơn thầy cô khoa Chăn ni thú y, BSTY Hồng Thanh Hải, Lê Thị Hà, TS Nguyễn Tất Tồn, KS Ngơ Bá Duy, ThS Hồ Thị Nga ln tận tình giúp đỡ, bảo