BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ TẠO PHÔI SOMA VÀ TÁI SINH CHỒI CÂY MACCA (Macadamia) in vitro Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHAN THỦY QUYÊN Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ TẠO PHÔI SOMA VÀ TÁI SINH CHỒI CÂY MACCA (Macadamia) in vitro Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS TRẦN THỊ LỆ MINH PHAN THỦY QUYÊN KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM Tháng 6/2013 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, tất q thầy tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học trường Chân thành cảm ơn cô Trần Thị Lệ Minh đặc biệt cô Tô Thị Nhã Trầm tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Xin cảm ơn tất bạn sinh viên, anh chị môn Công nghệ Sinh học Cảm ơn chị Đỗ Ngọc Thanh Mai tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Xin cảm ơn tất bạn lớp DH09SH hỗ trợ giúp đỡ, động viên chia khó khăn tơi thời gian thực đề tài Con xin cảm ơn ba má người thân gia đình ln u thương, động viên tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng năm 2013 Sinh viên thực Phan Thủy Quyên i TÓM TẮT Macca loại khơ có nguồn gốc từ Australia mệnh danh “nữ hồng khơ” Khi dùng có tác dụng làm giảm cholesteron, phòng trị xơ cứng động mạch, có hàm lượng protein nhân đạt 9,2% gồm 20 loại axit amin có loại axit amin thiết yếu cho thể người Cây macca trồng thử nghiệm Việt Nam năm gần mang lại hiệu kinh tế cao Tuy nhiên, macca nhân giống phương pháp thủ công truyền thống chiết ghép, giâm cành gieo hạt nên chưa đáp ứng đủ nhu cầu số lượng giống, khả chống chịu bệnh dễ thối hóa giống (Allen, 1965) Giải pháp đặt thay nhân giống thủ công truyền thống phương pháp nuôi cấy mô Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn nên đề tài “Nghiên cứu tạo phôi soma tái sinh chồi macca (Macadamia) in vitro” thực Nội dung đề tài gồm tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian khử trùng mẫu đoạn thân macca, thí nghiệm tạo phôi từ sẹo, phát sinh chồi từ phôi đoạn thân macca in vitro Kết thí nghiệm đạt được, mẫu macca khử trùng tốt với NaOCl 50% thời gian 20 phút, mẫu đốt thân khử trùng tốt với NaOCl 50% thời gian 25 phút Mơi trường WPM có bổ sung mg/l BA, 0,3 mg/l IBA 0,1 mg/l Ki cho tỷ lệ tạo phôi tốt (61,67%) sau 28 ngày nuôi cấy Phôi nuôi cấy môi trường WPM có bổ sung 0,1mg/l IBA 2mg/l BA cho khả tái sinh chồi tối ưu (23,33%) Đối với mẫu thân macca in vitro môi trường WPM bổ sung mg/l BA, 0,5 mg/l TDZ 1,5 mg/l Ki cho kết tạo chồi tối ưu (đạt 100%) ii SUMMARY Macca which is one kind of dried fruit originated from Australia is called “the Queen of dried fruit” Using it can bring some useful effects such as reducing the amount of cholesteron, preventing arteriosclerosis There is also an amount of endonuclear protein reaching 9.2% including 20 kinds of amino acids, of which kinds are essential for human Macca place have been planted experimentally in Viet Nam in recent years and have had high economic result However, nowadays, macca plants are mainly multiplicated by traditional methods such as grafting, raising, or scattering seeds Therefore, there are not enough demand for breed plants, the capacity of against disease is bad, and it is easy to be dysgenic Solution is replacing traditional methods with growing tissue culture method Thus, the thesis “the study of somatic embryogenesis formation and shoot formation proliferation of macca (Macadamia) in vitro” is performed Study content: Investigatethe time of sterilization NaOCl 50% of macca leaf sample and macca nude sample, the ability of somatic embryogenesis formation, the ability of shoot of somatic embryogenesis and macca nude sample Some results of this thesis: Macca leaf sample is treatment achieved sterilized with NaOCl 50% in 20 minutes, macca shoot sample is best sterile in NaOCl 50% in 25 minutes Callus grown in WPM medium supplemented mg/l BA, 0.3 mg/l IBA and 0.1 mg/l Ki have the best rate of somatic embryogenesis formation (61.67%) after 28 days cultured Somatic embryogenesis grown in WPM medium supplemented 0.1 mg/l IBA and 1.5mg/l BA have the best ability of shoot (23.33%) The experiment surveying the ability of shoot of macca nude sample has the best result (100%) when macca shoot samples grown in WPM medium supplemented mg/l BA, 0.5 mg/l TDZ and 1.5 mg/l Ki Key words: macca, shoot, somatic embryogenesis iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Macca 2.1.1 Phân loại thực vật Macca 2.1.2 Nguồn gốc macca 2.1.3 Giá trị Macca 2.1.4 Đặc điểm thực vật học macca 2.1.5 Đặc điểm sinh học macca 2.1.6 Yếu tố môi trường sinh thái ảnh hưởng đến macca 2.2 Tình hình nghiên cứu macca giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình nghiên cứu macca giới 2.2.2 Tình hình nghiên cứu macca Việt Nam 2.3 Q trình phát sinh mơ sẹo thành hoàn chỉnh 2.3.1 Khái niệm tạo mô sẹo 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sư tạo mô sẹo 2.4 Q trình tạo phơi soma từ mơ sẹo 2.4.1 Khái niệm phôi soma iv 2.4.2 Đặc điểm tế bào sinh phôi 10 2.4.3 Các giai đoạn phát triển phôi soma 10 2.4.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến phơi soma 11 2.4.4.1 Ảnh hưởng auxin cảm ứng tạo phôi soma 11 2.4.4.2 Ảnh hưởng cytokinin môi trường có auxin đến q trình 12 2.5 Sự phát sinh chồi từ phôi soma 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu, trang thiết bị 14 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 14 3.2.2 Trang thiết bị dụng cụ 14 3.2.3 Môi trường nuôi cấy 14 3.2.4 Điều kiện nuôi cấy 14 3.3 Phương pháp nghiên cứu 14 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaOCl 50% đến khả sống 14 3.3.2 Ảnh hưởng BA, IBA Kinetin đến phát sinh phôi soma từ mô sẹo 16 3.3.3 Ảnh hưởng IBA BA lên tái sinh chồi từ phôi soma 17 3.3.4 Ảnh hưởng BA, TDZ Kinetin lên tái sinh chồi từ mẫu thân 17 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 18 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaOCl 50% đến khả sống 19 4.1.1 Vô trùng mẫu macca 19 4.1.2 Vô trùng mẫu đốt thân macca 20 4.2 Sự phát sinh phôi soma từ mơ sẹo có nguồn gốc từ 22 4.3 Sự tái sinh chồi từ phôi soma macca 26 4.4 Sự tái sinh chồi từ mẫu thân macca 28 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA : (C12H11) Benzyl adenine CW : Nước dừa G : Gram IBA : Indole-3-butyric acid Ki : Kinetin (6-furfurylaminopurine) L : Lít MS : Murashige Skoog (1962) MT : Môi trường NAA : α-naphtalen acetic acid NaOCl : Sodium hypochlorite NT : Nghiệm thức TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Khảo sát thời gian khử trùng NaOCl 50% đến tỷ lệ 15 Bảng 3.2 Khảo sát thời gian khử trùng NaOCl 50% đến tỷ lệ sống 15 Bảng 3.3 Khảo sát phát sinh phôi soma từ mẫu mô sẹo 16 Bảng 3.4 Khảo sát tái sinh chồi từ phôi soma 17 Bảng 3.5 Khảo sát tái sinh chồi từ mẫu thân macca 18 Bảng 4.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaOCl 50% đến tỉ lệ sống .20 Bảng 4.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaOCl 50 % đến tỉ lệ sống .21 Bảng 4.3 Khảo sát phát sinh phơi soma từ mẫu mơ sẹo có nguồn gốc từ 23 Bảng 4.4 Tái sinh chồi từ phơi soma phát sinh từ mơ sẹo có nguồn gốc từ 26 Bảng 4.5 Sự tái sinh chồi từ mẫu thân macca in vitro 28 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Trái macca Hình 4.1 Mẫu macca sau khử trùng với NaOCl 50% 20 Hình 4.2 Mẫu đoạn thân macca sau khử trùng với NaOCl 50% 21 Hình 4.3 Phơi hình thành từ mẫu mơ sẹo có nguồn gốc từ macca 24 Hình 4.4 Chồi cảm ứng từ phơi mơi trường khác .25 Hình 4.5 Chồi macca tái sinh từ phôi 27 Hình 4.6 Chồi cảm ứng từ đoạn thân sau 60 ngày nuôi cấy môi trường 30 viii 4.3 Sự tái sinh chồi từ phơi soma macca Trong q trình phân hóa, mơ sẹo khơng có tổ chức hình thành cấu trúc hình thái dẫn đến tạo chồi, rễ, cành hoa hồn chỉnh Q trình phân hóa thực cách thay đổi số chất chất điều hòa sinh trưởng môi trường nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1994) Việc bổ sung BA với nồng độ khác có ảnh hưởng khác lên tái sinh chồi từ phôi soma macca môi trường WPM bổ sung 0,1 mg/l IBA, kết thể cụ thể bảng 4.5 Bảng 4.4 Tái sinh chồi từ phôi soma phát sinh từ mô sẹo NT Môi BA trường (mg/l) D1 WPM Ngày cảm Tỷ lệ cảm ứng Màu sắc, hình dạng, ứng tạo chồi tạo chồi ( %) tính chất mẫu _ 0c Mẫu xốp, trắng, vàng đục, _ c phần mẫu bị hóa nâu Mẫu xốp, trắng, có phần D2 WPM 0,1 màu xanh, phần mẫu bị hóa nâu D3 WPM 0,5 0c _ Mẫu chắc, trắng, phần hóa nâu Mẫu xốp, có màu trắng vàng D4 WPM 1,0 11,67b 20 đục, phần hóa nâu ít, có phát sinh chồi Mẫu xốp, trắng, phần hóa nâu ít, D5 WPM 1,5 a 22 20,00 có phát sinh chồi, hình thái rõ ràng D6 WPM 2,0 23,33a 19 Mẫu khơ, có màu xanh, vàng nâu trắng, có phát sinh chồi ( _ ) ngày cảm ứng tạo chồi Các giá trị có kí tự theo sau cột khác có khác biệt mặt thống kê (P ≤ 0,01) 26 Kết cho thấy thời điểm khảo sát nghiệm thức có khác biệt mặt thống kê Trong nghiệm thức mơi trường WPM có bổ sung 0,1mg/l IBA 2mg/l BA cho tỷ lệ chồi tái sinh cao (23,33%), chồi xuất vào ngày thứ 19, chồi tái sinh sinh trưởng phát triển tốt, mẫu phơi khơ, xốp, có màu xanh, vàng nâu trắng Ở nghiệm thức D4, D5 có tái sinh chồi, số chồi không nhiều, chiếm 11,67% 20% số mẫu, chồi sinh trưởng, phát triển tốt, mẫu phơi xốp, có màu trắng vàng đục, phần hóa nâu Các nghiệm thức D1, D2, D3 khơng có tái sinh chồi (0%) Kết phù hợp với nhận định Lê Văn Hòa cộng (2012), hoạt tính cytokinin tăng lên q trình phát triển phơi yếu tố điều khiển trình sinh mạch giúp cho tạo chồi Vậy mơi trường thích hợp cho việc cảm ứng tạo chồi mơi trường WPM có bổ sung 0,1 mg/l IBA mg/l BA D1 D2 D3 D4 D5 D6 Hình 4.5 Chồi macca tái sinh từ phơi D1: WPM + 0,1mg/l IBA + mg/l BA; D2: WPM + 0,1mg/l IBA + 0,1 mg/l BA; D3:WPM + 0,1mg/l IBA + 0,5 mg/l BA; D4: WPM + 0,1mg/l IBA + mg/l BA; D5:WPM + 0,1mg/l IBA + 1,5 mg/l BA; D6: WPM + 0,1mg/l IBA + mg/l BA 27 4.4 Sự tái sinh chồi từ mẫu thân macca Phương pháp nhân chồi bên áp dụng cho nhiều loại thực vật, chồi cô lập môi trường dinh dưỡng chồi bên từ nách phát triển ảnh hưởng cytokinin với nồng độ cao Cytokinin giúp hạn chế ưu tính để chồi bên phát triển (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Thí nghiệm thực nhằm xác định hàm lượng cytokinin thích hợp cho việc nhân chồi macca, kết ghi nhận bảng 4.7 Bảng 4.5 Sự tái chồi từ mẫu thân macca in vitro NT Môi Ki trường (mg/l) E1 WPM Ngày cảm ứng Tỷ lệ cảm ứng tạo chồi 20 tạo chồi ( %) b 45,00 Màu sắc, hình dạng, tính chất mẫu Chồi phát triển tốt, có mẫu xuất chồi đoạn thân, có sẹo xuất phần gốc E2 WPM 0,1 32 46,67b Chồi phát triển tốt, có tượng tạo sẹo gốc E3 WPM 0,5 29 50,00b Chồi phát triển tốt, có tượng tạo sẹo gốc E4 WPM 1,0 40 51,67b Chồi phát triển tốt, có tượng tạo sẹo phần thân nhiều Chồi phát triển tốt, đoạn thân E5 WPM 1,5 100a 35 phát sinh ̶ chồi, có sẹo phần thân E6 WPM 44 46,67b Chồi nhỏ, khơng có sẹo phát sinh mẫu Các giá trị có kí tự theo sau khác cột giá trị có kí tự theo sau khác có khác biệt mặt thống kê (P≤0,01) 28 Kết sau tuần nuôi cấy đoạn thân macca môi trường WPM có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA, TDZ kinetin cho thấy tất nghiệm thức có tượng cảm ứng tạo chồi, nhiên tỷ lệ tạo chồi hình dạng chồi khác nhau, có khác biệt nghiệm thức mặt thống kê Đáng lưu ý nghiệm thứ E5, tất mẫu bố trí mơi trường WPM có bổ sung mg/l BA, 0,5 mg/l TDZ 1,5 mg/l Ki cảm ứng tạo chồi, chồi cảm ứng từ ngày thứ 35, đoạn thân phát sinh ̶ chồi, có sẹo phần thân Tuy nhiên, tăng nồng độ kinetin lên mg/l nghiệm thức E6 tỷ lệ tạo chồi lại giảm, đạt 46,67%, chồi nhỏ, cảm ứng từ ngày thứ 44, khơng có sẹo phát sinh mẫu Trên môi trường E4 chồi phát triển tốt, tỷ lệ tạo chồi đạt 51,67%, có tượng tạo sẹo phần thân nhiều nghiệm thức E5 Mơi trường nghiệm thức E1 có cảm ứng tạo chồi sớm (vào ngày thứ 20), 45% mẫu nhân chồi, chồi phát triển tốt, vươn thẳng, có mẫu xuất chồi đoạn thân, sẹo phần thân có sẹo xuất phần gốc Môi trường E2, E3 chồi phát sinh chậm môi trường E1 tượng tạo sẹo gốc giảm Ở nghiên cứu Nguyễn Thị Dung (2011), đoạn thân macca môi WPM bổ sung mg/l BA 0,5 mg/l TDZ cho kết khả quan trường tái sinh chồi, nhiên chồi thực chưa hình thành Qua kết thu từ thí nghiệm nhận thấy tăng nồng độ cytokinin, cụ thể thêm vào Ki, giúp cho việc cảm ứng chồi đạt hiệu hơn, việc tái sinh chồi từ mẫu đoạn thân macca nghiệm thức E5 (2mg/l BA; 0,5mg/l TDZ; 1,5 mg/l Ki) cho tỷ lệ tạo chồi tốt đạt 100% 29 E1 E2 E3 E4 E5 E6 Hình 4.6 Chồi cảm ứng từ đoạn thân sau 60 ngày nuôi cấy MT khác E1: WPM + 2mg/l BA + 0,5mg/l TDZ + mg/l Ki; E2: WPM + 2mg/lBA + 0,5mg/l TDZ + 0,1 mg/l Ki; E3: WPM + 2mg/l BA + 0,5mg/l TDZ + 0,5 mg/l Ki; E4: WPM + 2mg/l BA + 0,5mg/l TDZ + 1mg/l Ki; E5: WPM + 2mg/l BA + 0,5mg/l TDZ + 1,5 mg/l Ki; E6: WPM + 2mg/l BA + 0,5mg/l TDZ + mg/l Ki 30 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Mẫu macca khuyến cáo nên khử trùng NaOCl 50% thời gian 20 phút, mẫu thân thời gian phù hợp 25 phút Môi trường WPM bổ sung 1mg/l BA, 0,3 mg/l IBA 0,1 mg/l Ki cho hiệu tạo phôi cao (61,67%) thời điểm tuần sau cấy Mơi trường thích hợp cho tái sinh chồi từ phôi soma môi trường WPM bổ sung 0,1 mg/l IBA kết hợp với mg/l BA Sự tái sinh chồi từ đoạn thân nuôi cấy môi trường WPM bổ sung mg/l BA, 0,5 mg/l TDZ 1,5 mg/l Ki cho tỷ lệ tạo chồi cao nhất, đạt 100% sau tuần nuôi cấy 5.2 Đề nghị Tiến hành tạo rễ cho chồi macca có nguồn gốc từ phơi soma đoạn thân để tạo hoàn chỉnh giai đoạn in vitro Nghiên cứu dưỡng tự nhiên để khảo sát khả sinh trưởng macca in vitro với macca ghép macca nhân giống hạt 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đinh Trung Chánh, Bùi Thị Tường Thu Trần Văn Minh 2007 Ứng dụng công nghệ phôi soma công tác giống Trầm Hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte Hội nghị Khoa học Công nghệ Nguyễn Thị Dung 2011 Khảo sát ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng đến trình tạo sẹo phát sinh chồi macca (Macadamia) Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Trần Thị Dung 2006 Nuôi cấy mô tế bào thực vât Bài giảng môn Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Bích Đào 2001 Nghiên cứu thử nghiệm nhân giống số rừng phương pháp nuôi cấy mô (Bạch Đàn Europhylla, Hông, Giổi Xanh, Trầm Hương) Đề tài nghiên cứu cấp tỉnh, trung tâm ứng dụng tiến khoa học kỹ thuật Bình Định Lê Hồng Giang Nguyễn Bảo Tồn 2011 Sự hình thành mô sẹo, phôi Mỏ Quạ in vitro (Dischidia rafflesiana wall.) Tạp chí khoa học 20a: 61 – 67 Lê Văn Hòa, Nguyễn Văn Ây Phan Thị Ánh Tuyết 2012.Sự tạo phôi soma tái sinh chồi tre Rồng (Dendrocalamus giganteus wall.ex munro) từ ni cấy lớp mỏng tế bào Tạp chí khoa học 21b: 68 ̶ 77 Lê Văn Hồng 2008 Cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Ebook 566 trang Loebel.R 1986 Thực vật học Macadamia Nông nghiệp NSW Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên 2002 Công nghệ tế bào Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 10 Dương Công Kiên 2003 Nuôi cấy mô thực vật, tập Nhà xuất đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 11 Đồn Thị Mai 2000 Kết ban đầu nhân giống Bạch đàn lai phương pháp ni cấy mơ phân sinh Tạp chí Lâm nghiệp.10: 46 – 48 12 Đoàn Thị Mai 2005 Bước đầu ứng dụng công nghệ mô – hom nhân giống Trầm hương Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn 2: 57 – 67 13 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu, Đinh Trung Chánh Bùi Cách Tuyến 1998 Nhân giống Trầm hương qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tạp chí Khoa học cơng nghệ kỹ thuật Lâm nghiệp 11/12: 44 – 45 14 Dương Tấn Nhựt 2010 Một số phương pháp hệ thống nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật Nhà xuất nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh 15 Dương Tấn Nhựt 2011 Công nghệ sinh học thực vật: nghiên cứu ứng dụng, tập Nhà xuất Nông nghiệp, trang 120 – 130 16 Đặng Đinh Đức Phong 2011 Bản tin KH CN, số Viện Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp Tây Nguyên 17 Nguyễn Vũ Phong Huỳnh Thanh Khoa 2010 Nghiên cứu tạo phơi vơ tính tiêu (Piper colubrinum L.) Tạp chí cơng nghệ sinh học ,8(4) Trang 1839 – 1843 18 Nguyễn Đình Sỹ, Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Thị Quỳnh 2009 Nghiên cứu khử trùng, tạo chồi tạo rễ in vitro giống điều cao sản (Anacardium occidentaleL.) Hội nghị khoa học công nghệ Trang 440 – 445 19 Nguyễn Công Tạn 2002 Cây Mắc ̶ ca Nhà xuất nông nghiệp 32 20 Bùi Thị Tường Thu Trần Văn Minh 2007 Nuôi cấy tái sinh phôi soma Teak (Tectona Grandis Linn.F) Hội nghị Khoa học Cơng nghệ 21 Đồn Thị Ái Thuyền 2005 Nhân giống vơ tính hơng (Paulowvina fortunei Hemsi) phương pháp ni cấy mơ Tạp chí sinh học 09: 46 – 50 22 Nguyễn Văn Uyển 2001 Nhân giống vơ tính hơng (Paulownia fortune) phương pháp ni cấy mơ Tạp chí sinh học 23 (3): 46 ̶ 50 23 Bùi Trang Việt 2000 Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 24 Vũ Văn Vụ 1994 Sinh học thực vật Nhà xuất Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội, trang 182 – 237 Tài liệu tiếng Anh 25 Allan P 1969 Macadamia production overseas Farming South Africa 29 – 32 26 Mrs Allen 1965 The macadamia story USA xuất lần đầu Niên giám Xã hội Macadamia California XXXIII 27 Gitonga L N, Gichuki S T., Ngamau K, Muigai A.W.T, Kahangi E.M, Wasilwa L.A, Wepukhulul S Njogu N 2010 Effect of explant type, source and genotype on in vitro shoot regeneration in Macadamia (Macadamia spp.) Journal of agricultural biotechnology and sustainable developmen.Vol.2(7) 129 – 135 28 Lucy Gitonga, Esther Kahangi, Simon Gichuki, Ngamau K, Muigai AWT, Njeru ES, Njogu N Wepukhulu S 2008 Factors influencing in vitro shoot regeneration of Macadamia integrifolia 29 Gupta P.K., Durzan D.J 1986 Plantlet regeneration via somatic embryogenesis from subcultured callus of mature embryos of Picea abies (Norway spruce) In vitro Cenllular and Developmental Biology – Plant 22: 685 – 688 30 Hamilton R.A Fukunaga E.T 1959 Growing Macadamia nuts in Hawaii Hawaii Agricultural Experiment Station, Hawaii 31 Kenya 2008 In vitro and in vitro methods of propagation towards exsitu conservation of Macadamia (Macadamia spp.) 1-12 32 Latif, Sjafrul 2000 In vitro culture of ginger and macadamia Queensland University of Technology 33 Mulwa PMS, Bhalla PL 2000 In vitro shoot multiplication of Macadamia tetraphylla L.Johnson 1-5 34 Francisco R Quiroz – Figueroa, Rafael Rojas – Herrera, Rosa M Galaz-Avalos, Victor M.Loyola-Vargas 2006 Embryo production through somatic embryogenesis can be used to study cell differentiation in plants, Plant Cell Tiss Organ Cult 86: 285301 35 Richad M S Mulwa, Prem L Bhalla 2006 In vitro plant regeneration from immature cotyledon explants of macadamia (Macadamia tetraphylla L.Jonhson) 1281-1286 36 Saleeb, WF, Yermanos, D.M, Huszar, CK., Storery, W/b., and Habanauskas, CK 1973 The oil and protein in nuts of Macadamia tetraphyll L.Johnson, Macadamia integrifolia 453-456 Tài liệu internet 37 http://bauplepa.com/gallery.htm 33 PHỤ LỤC Bảng Thành phần môi trường WPM (Woody Plant Medium) Thành phần Khoáng đa lượng Khoáng vi lượng Vitamin Nồng độ (mg/l) NH4NO3 400 CaCl2.2H2O 96 Ca(NO3)2.4H2O 556 MgSO4.7H2O 370 K2SO4 990 KH2PO4 170 H3PO3 6,2 CuSO4.5H2O 0,25 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 MnSO4.H2O 22,3 Na2MoO4.2H2O 0,25 ZnSO4.7H2O 8,6 Myo-inositol 100 Glycine 2,0 Acid nicotinic 0,5 B1 0,5 B6 1,0 Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê tỷ lệ sống mẫu macca thí nghiệm Lần lặp lại Nghiệm thức Tỷ lệ trung bình (%) A1 70 80 100 83.33 A2 70 100 90 86,67 A3 80 75 100 85,00 A4 80 80 85 81,67 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm khử trùng mẫu macca bảng 4.1 Degrees of Sum of Freedom Mean Squares Square F-value Prob Between 41.667 13.889 Within 1300.000 162.500 0.085 Total 11 1341.667 Coefficient of Variation = 15.15% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng tỷ lệ sống mẫu bảng kết 4.1 Original Order Mean Mean = = Ranked Order 83.33 86.67 A A Mean = 86.67 A Mean = 85.00 A Mean = 85.00 A Mean = 83.33 A Mean = 81.67 A Mean = 81.67 A Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê tỷ lệ sống mẫu thân macca thí nghiệm Lần lặp lại Nghiệm thức Tỷ lệ trung bình (%) B1 40 50 40 43,33 B2 65 75 55 65,00 B3 75 65 90 76,67 B4 65 70 55 63,33 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm khử trùng mẫu thân macca bảng 4.2 Degrees of Freedom Sum of Squares Mean Square F-value Prob Between 1722.917 574.306 700.000 87.500 6.563 0.0150 Within Total 11 2422.917 Coefficient of Variation = 15.07% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng tỷ lệ sống mẫu thân bảng kết 4.2 Original Order Ranked Order Mean = 43.33 Mean = 65.00 Mean = Mean = B Mean = 76.67 A A Mean = 65.00 A 76.67 A Mean = 63.33 A 63.33 A Mean = 43.33 B Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê tỷ lệ tạo phơi từ mơ sẹo thí nghiệm Nghiệm thức Lần lập lại Tỷ lệ trung bình (%) C1 60 60 55 58,33 C2 65 60 60 61,67 C3 30 45 55 43,33 C4 40 25 20 28,33 C5 15 20 20 18,33 C6 0 0 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tạo phơi từ mô sẹo bảng 4.3 Degrees of Sum of Freedom Mean Squares Square F-value Prob Between 0.0000 Within 9111.111 1822.222 12 583.333 48.611 37.486 Total 17 9694.444 Coefficient of Variation = 19.61% Bảng 10 Bảng trắc nghiệm phân hạng tỷ lệ tạo phôi từ mô sẹo kết 4.3 Original Order Mean = 58.33 Ranked Order A Mean = 61.67 Mean = 43.33 Mean = Mean Mean Mean A = 58.33 A Mean = 61.67 B Mean = 43.33 B 28.33 BC Mean = 28.33 BC = 18.33 C Mean = 18.33 C = 0.0000 Mean = 0.0000 D A D Bảng 11 Số liệu dùng cho xử lý thống kê tỷ lệ tạo sẹo thí nghiệm Nghiệm thức Lần lập lại Tỷ lệ trung bình (%) C1 60 65 65 63,33 C2 65 60 65 63,33 C3 50 45 55 50,00 C4 45 55 60 53,33 C5 30 45 45 40,00 C6 35 35 30 33,33 Bảng 12 Bảng ANOVA thí nghiệm tạo mô sẹo bảng 4.3 Degrees of Sum of Freedom Mean Squares Square F-value Prob Between 0.0001 Within 2227.778 445.556 12 366.667 30.556 14.582 Total 17 2594.444 Coefficient of Variation = 10.93% Bảng 13 Bảng trắc nghiệm phân hạng tỷ lệ sẹo kết bảng 4.3 Original Order Ranked Order Mean = 63.33 A Mean = 63.33 A Mean = 63.33 A Mean = 63.33 A Mean = 50.00 AB Mean = 53.33 AB Mean = 53.33 AB Mean = 50.00 AB Mean = 40.00 BC Mean = 40.00 BC Mean = 33.33 C Mean = 33.33 C Bảng 14 Số liệu dùng cho xử lý thống kê tỷ lệ tạo chồi thí nghiệm Nghiệm thức Lần lập lại Tỷ lệ trung bình (%) D1 0 0 D2 0 0 D3 0 0 D4 10 15 10 11,67b D5 20 15 25 20,00a D6 20 25 25 23,33a Bảng 15 Bảng ANOVA thí nghiệm tạo chồi bảng 4.5 Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.0000 Within 1729.167 345.833 12 83.333 6.944 49.800 Total 17 1812.500 Coefficient of Variation = 28.75% Bảng 16 Bảng trắc nghiệm phân hạng tỷ lệ tạo chồi kết bảng 4.5 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 C Mean = 23.33 A Mean = 0.0000 C Mean = 20.00 A Mean = 0.0000 C Mean = 11.67 Mean = 11.67 Mean = 0.0000 C Mean = 20.00 A Mean = 0.0000 C Mean = 23.33 A Mean = 0.0000 C B B Bảng 17 Số liệu dùng cho xử lý thống kê tỷ lệ tạo chồi từ đoạn thân thí nghiệm Nghiệm thức Lần lập lại Tỷ lệ trung bình (%) E1 40 50 45 45,00 E2 45 45 50 46,67 E3 50 50 50 50,00 E4 55 50 50 51,67 E5 100 100 100 100 E6 45 50 45 46,67 Bảng 18 Bảng ANOVA thí nghiệm tạo chồi bảng 4.7 Degrees of Sum of Freedom Mean Squares Square F-value Prob Between 0.0000 Within 6850.000 1370.000 12 100.000 8.333 164.400 -Total 17 6950.000 Coefficient of Variation = 5.09% Bảng 19 Bảng trắc nghiệm phân hạng tỷ lệ tạo chồi kết bảng 4.7 Original Order Ranked Order -Mean = 45.00 B Mean = 100.0 Mean = 46.67 B Mean = 51.67 B Mean = 50.00 B Mean = 50.00 B Mean = 51.67 B Mean = 46.67 B Mean = 100.0 Mean = 46.67 B Mean = 46.67 Mean = 45.00 B A B A ... VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ TẠO PHÔI SOMA VÀ TÁI SINH CHỒI CÂY MACCA (Macadamia) in vitro. .. sát phát sinh phôi soma từ mẫu mơ sẹo có nguồn gốc từ 23 Bảng 4.4 Tái sinh chồi từ phôi soma phát sinh từ mơ sẹo có nguồn gốc từ 26 Bảng 4.5 Sự tái sinh chồi từ mẫu thân macca in vitro ... tài Nghiên cứu tạo phôi soma tái sinh chồi macca (Macadamia) in vitro thực 1.2 Yêu cầu Khảo sát thời gian khử trùng mẫu đoạn thân macca NaOCl 50%; tạo phôi từ mẫu mô sẹo macca, từ tạo chồi