Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Bộ môn chọn giống thực vật BÀI BÁO CÁO MÔN HỌC CHỌN GIỐNG CÂY CHÈ Ở VIỆT NAM Giáo viên hướng dẫn: Lưu Thị Thanh Tú Nhóm báo cáo: Lê Việt Pháp 1015797 Nội dung báo cáo: A Giới thiệu chung chè B Các phương pháp chọn giống chè C Thành tựu chọn giống chè Việt Nam D Kết luận 35 CHỌN GIỐNG CÂY CHÈ A Giới thiệu chung: I Nguồn gốc: Cây chè cư dân Bách Việt vùng lúa nước Đông Nam Á phát làm dược liệu từ thời vua Thần Nông Sau lan truyền khắp giới đường tơ lụa – trà phía bắc Trung Hoa, đường trà mã đạo phía nam Trung Hoa đường gia vị biển Đông Nam Á Nam Á sang châu Âu châu Mỹ Cây chè nhà bác học thực vật học Thụy Điển Carl Von Linneous định tên khoa học Camélia sinensis từ năm 1753 Nhưng chưa có ý kiến thống nhà khoa học vùng nguyên sản chè Vùng nguyên sản chè giới chưa đến hồi kết thúc sau 200 năm tranh luận, vấn đề bí hiểm có giá trị lịch sử – khoa học Vì mà nảy sinh nhiều giả thuyết nguồn gốc chè giới nhà khoa học giới (1753 – 1976) Thuyết Trung Quốc Năm 1753, Carl Von Linnaeus, nhà thực vật học Thuỵ Điển thu thập phân loại tiêu mẫu chè giống Trung Quốc lần xác định tên khoa học chè Thea (Camelia) sinensis, phân thành thứ (variétas) chè: Thea bohea (chè đen) Thea viridis (chè xanh) Từ xác nhận Trung Quốc vùng nguyên sản chè giới Thực theo khoa học đại phân loại thứ chè khơng xác, chè xanh đen chế biến từ nguyên liệu khác công nghệ chế biến Thuyết Ấn Độ Năm 1823, Robert Bruce, học giả người Anh, phát số chè hoang dã dãy núi Sadiya, vùng Assam (Ấn Độ) cao tới 17 – 20 m, thuộc loài thân gỗ lớn (đại kiều mộc), khác hẳn chè thân bụi (quán mộc) Linnaeus thu thập Trung Quốc Sau nhà học giả Anh Samuel Baildon (1878), John H.Blake (1903), E.A Brown Ibbetson (1912) đưa thuyết Ấn Độ vùng nguyên sản chè giới, kho tài liệu cổ Trung Quốc khơng ghi nhận chè cổ thụ Trong đất nước Trung Quốc chưa tìm thấy chè cổ thụ lớn Ấn Độ Từ học giả Anh kết luận giống chè Trung Quốc Nhật Bản trồng nhập từ Ấn Độ Thuyết dị nguyên 36 Năm 1918, Cohen Stuart (Java), nhà phân loại thực vật Hà Lan, khảo sát thu thập mẫu tiêu chè Vân Nam, Bắc Việt Nam Bắc Myanmar Kết tìm thấy chè thân gỗ lớn khu vực miền núi phía Nam phía Tây Vân Nam Dựa vào kết điều tra trên, Cohen Stuart đưa thuyết hai nguồn gốc chè (nhị nguyên thuyết): chè to (đại diệp chủng) có nguồn gốc phía Đông cao nguyên Tây Tạng, chè nhỏ (tiểu diệp chủng) có nguồn gốc phía Đơng Đơng Nam Trung Quốc loài chè thuộc loại hình khác Thuyết chiết trung Năm 1951, Đào Thừa Trân (Trung Quốc), tổng kết ý kiến nhà khoa học thành thuyết: thuyết Trung Quốc, thuyết Ấn Độ, thuyết nhị nguyên thuyết chiết trung Thuyết chiết trung thuyết trung dung, xếp hai thuyết Trung Quốc Ấn Độ, nhiều nhà thực vật học tán thành Thuyết cho rằng, nôi tự nhiên chè khu vực gió mùa Đơng Nam Á, Lào, Myanmar, Vân Nam Bắc Việt Nam phát chè hoang dại Các điều kiện đất đai, khí hậu, lượng mưa khu vực thích hợp với sinh trưởng chè, hợp thành vườn chè nguyên thuỷ Hơn nữa, chè hoang dại mọc nhiều bờ sông lớn Lan Thương, Kim Sa Giang (tên gọi sông Mê Kông cao nguyên Tây Tạng), Phú Long Giang, Salouen, Irravađi, Bramapoutrơ… Các sông lớn bắt nguồn từ dãy núi phía Nam cao nguyên Tây Tạng, vùng nguyên sản chè vùng núi cao nguyên Tây Tạng Thuyết Việt Nam Năm 1976, Demukhatze viện sỹ thông viện hàn lâm khoa học Liên Xơ nghiên cứu tiến hố chè cánh phân tích chất cafein chè mọc hoang dã chè người trồng vùng khác giới có vùng chè cổ Việt Nam (suối Giàng, Nghĩa Lộ, Lạng Sơn, Nghệ An, …) Tác giả kết luận : Cây chè cổ Việt Nam tổng hợp chất cafein đơn giản nhiều chè Vân Nam Trung Quốc chất cafein phức tạp chè Vân Nam nhiều chè Việt Nam Do tác giả đề xuất sơ đồ tiến hoá chè sau : Camelia- chè Việt Nam – chè Vân Nam to – chè Trung Quốc – chè Assam ấn Độ Qua phân tích nhiều nhà khoa học cho Việt Nam nơi chè Thuyết vùng khí hậu gió mùa Đơng Nam Á 37 Năm 2008, Đỗ Ngọc Quỹ đưa thuyết vùng nguyên sản chè giới Dựa tư liệu nước nhà khoa học tự nhiên, sử học xã hội học công bố đến nay, nhóm ơng rút kết luận nguồn gốc chè sau đây: Cây chè có nguồn gốc vùng khí hậu gió mùa Đông Nam Á, bao gồm vùng Tây Nam Trung Quốc, Bắc Myanmar, Bắc Lào Bắc Việt Nam ngày Giả thuyết nhiều nhà khoa học Việt Nam ủng hộ II Phân loại học nguồn germplast chè Việt Nam: Cơ sở phân loại: Để phân loại chè, người ta dựa sở:  Cơ quan sinh dưỡng: loại thân bụi thân gỗ, hình dạng tán, hình dạng kích thước loại lá, số đơi gân  Cơ quan sinh sản: độ lớn cánh hoa, số lượng đài hoa, vị trí phân nhánh đầu nhị  Đặc điểm sinh hoá: chủ yếu dựa vào hàm lượng tanin Phân loại: Trong thập kỷ qua có nhiều tác giả phân loại chè, Cohen Stuart 1916, Wight Barua 1939, Kitamura 1950, Sealy 1958 Trong cách phân loại Cohen Stuart nhiều người biết đến sử dụng Theo nhà thực vật học người Hà Lan Cohen Stuart 1919, tác giả dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, không gian phân bố, đối chiếu với nguồn gốc để chia chè thành loại , là: o Chè Trung Quốc nhỏ (Chine microphylla): thuộc loại bụi, mọc chậm có nhiều thân mọc từ lên, nhỏ cứng, đọt chè nhỏ, diện tích bé thích hợp với loại chè đòi hỏi ngoại hình đẹp o Chè Trung Quốc to (Chine macrophylla): thuộc loại thân gỗ nhỏ, trung bình, suất khá, đọt chè từ nhỏ đến trung bình sử dụng cho chế biến chè xanh chè đen o Chè Tuyết (Shan): thuộc loại thân gỗ vừa, to, đọt dài, có nhiều lơng tuyết chế biến cần lưu ý cường độ thời gian vò để giữ lại tối đa tuyết đọt tạo hấp dẫn tự nhiên cho sản phẩm o Chè Ấn Độ (Assamica): thuộc loại thân gỗ lớn, to, bóng láng, sinh trưởng mạnh vùng nhiệt đới, đọt to, hàm lượng tanin cao thích hơp cho chế biến chè đen theo phương pháp truyền thống Orthodox phương pháp CTC (Crushing – Tearing – Curling) 38 Nguồn tài nguyên chè Việt Nam Hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ nguồn tài nguyên di truyền cay chè nước ta, theo nghiên cứu sơ Viện Di Truyền Nơng Nghiệp Việt Nam nước ta tính đến năm 2007 có khoảng 165 giống chè bao gồm giống truyền thống, giống nhập nội, giống lai nước… Dưới bảng thống kê 96 giống chè với đánh giá đặc điểm thân lá: 39 Bảng Chỉ tiêu đánh giá hình thái giống chè 40 Bảng Thống kê 96 giống chè nước ta III Giá trị dinh dưỡng chè: Các thành phần dinh dưỡng trà gồm có axit amin, vitamin, chất khoáng, hydratcarbon, protid lipid Axit amin Thành phần chủ yếu tổ chức tế bào người protid; axit amin đơn vị cấu thành protid Có tới 25 loại axit amin thể người, có loại mà thể người tổng hợp được, phải dựa vào nguồn thức ăn bổ sung bên 41 Hàm lượng axit amin tự trà 2-5% Axit amin có tác dụng sinh lý tốt với người trợ tim, lợi tiểu, nở giãn huyết quản… Vitamin Trong chè tươi có nhiều loại vitamin hòa tan lipid vitamin hòa tan nước Vitamin hòa tan lipid (như A1, A2, D1, D2, D3, D4, K1, K2) vitamin hòa tan nước (như B1, B2, B6, B12, PP, pantotenic, C, P) Đối với loại vitamin hòa tan nước, hãm trà với nước sơi, chiết xuất tới 80% vitamin * Vitamin C Hàm lượng vitamin C (hay ascorbic axit) có nhiều trà; 100g trà khơ có 100-500mg vitamin C, cao chanh, dứa, táo cam quít Vitamin C dễ bị phân giải chất oxy hóa khử, đặc biệt nhiệt độ cao có khim loại nặng Cu [đồng], Fe [sắt]; công đoạn lên men sấy khô trình chế biến trà đen bị phá hủy nhiều; trà xanh bị phá hủy nên có nhiều vitamin C trà đen Vitamin C có tác dụng cầm máu, thúc đẩy oxy hóa lipid, tiết cholesterol chống bệnh cao huyết áp xơ cứng động mạch Vitamin C tham gia q trình oxy hóa khử thể người, xúc tiến tác dụng giải độc, có lợi cho việc tiết kim loại thể Vitamin C gây trở ngại cho trình hình thành u căng xe; thường xuyên uống trà làm chậm q trình phát triển u căng xe thể Hàm lượng vitamin Ccaanf thiết cho người lớn 60mg/ngày; cần uống 3-4 chén trà/ngày đủ nhu cầu * Vitamin B chè có nhiều loại; tác dụng, hàm lượng nhu cầu loại thể người khác Vitamin B1 (Thianin) có tác dụng trì thơng thường trằng cách thúc đẩy trao đổi vật chất hệ thống thần kinh, tim phổi tiêu hóa; giảm chứng bị viêm thần kinh, phòng ngừa tối loạn nhịp tim phổi dày Trong 100g trà có 150-160mg vitaminB1; nhu cầu cần thiết hàng ngày người 1700mg vitamin B1, chén trà có 4,5-18mg vitamin B1; chén trà uongs ngày đảm bảo 1,3-1,5 nhu cầu vitamin B1 Vitamin B2 gọi vitamin G, riboflavin hạch hoàng tố, thường thiếu thành phần dinh dưỡng hàng ngày; thiếu vitamin B2 ảnh hưởng đến oxy hóa vật chất thể người; thiếu vitamin B2 thường biểu mắt, chỗ tiếp giáp da niêm mạc; vitamin B2 có tác dụng phòng trị viêm giác mạc, viêm da, viêm giác mạc miệng Trong 100g 42 trà có 1300-1700mg vitamin B2, cao đỗ tương lần, cao gạo dưa hấu 20 lần Con người cần 1800mg/ngày; uống chén trà/ngày cung cấp 11-14% nhu cầu vitamin B2 Vitamin B3 (vitamin PP), thiếu thể làm cho hàm lượng coenzym bắp giảm rõ rệt bị bệnh Vitamin B11 gọi folic axit, có tác dụng dự phòng máu thiếu Fe [Sắt] 100g trà khơ có 5080mg B12; uống chén trà/ngày đảm bảo 2,5-4,0% vitamin B12 nhu cầu thể người/ngày Vitamin P1 trì tính thẩm thấu tế bào vi huyết quản, chống albumin thẩm thấu vào huyết quản, giảm xuất huyết mao quản, tăng tính đàn hồi huyết quản chống cao huyết áp Vitamin tan lipid: Gồm có A, D, E, K… Trong vitamin E thúc đẩy chức sinh sản tế bào, chống oxy hóa, có hiệu trẻ hóa người 100g trà có 57-70mg vitamin E; vitamin K có tác dụng cầm máu Chất Khoáng Muốn xác định thành phần khoáng chất chè phải xác định thành phần chất tro chè Chất tro phần vật chất lại sau nung chè nhiệt độ cao 500-600°C Chất tro chia thành nhóm, hòa tan khơng hòa tan nước Nhóm khơng hòa tan nước lại chia thành nhóm nhỏ, hòa tan khơng hòa tan axit HCl pha lỗng Đó tiêu chất lượng chè thường xuyên phải phân tích Hàm lượng tro chè biến đổi theo độ non già búp chè, thời kỳ sinh trưởng, giống chè… Trong búp chè có 4-5% tro, trà khơ có 5-6% tro trà sản phẩm Tổng lượng chất tro cao chè xấu mức độ vệ sinh công nghiệp - Kali hàm lượng cao 1,5-2,5% Kali chất cation chủ yếu tế bào chè; có tác dụng trọng yếu trao đổi vật chất, áp suất thẩm thấu cân huyết dịch - Selenium (GSH-PX) thành phần thiếu thành phần tổ chức mơ tế bào Có tác dụng kích thích sản sinh tính miễn dịch protid kháng thể, tăng cường tính đề kháng với bệnh tât, có tác dụng định với bệnh tim Hàm lượng trà xanh Tử Dương Thiển Tây tương đối cao đạt tới 1,5-3,8ppm Tuy nhiên, uống trà có hàm lượng Se cao gây nên rụng lơng 43 - Zn thơng qua hình thành RNA DNA trực tiếp ảnh hưởng đến hợp thành axit cucleic protid Nếu thiếu Zn sinh trưởng phát duchj nhi đồng thiếu niên bị chậm lại Hàm lượng Zn khu vực sản xuất chè Trung Quốc khơng đồng 1g trà khơng có 35-50mg Zn; trà xanh 41,4, trà đen 39,3, trà Ô long 37,3mg Zn - Fluor môi giới chủ yếu kết cấu xương; có tác dụng phòng trị tốt bệnh bệnh loãng xương Hàm lượng Fl chè tương đối cao (trên 100ppm), thùy loại trà, theo thứ tự cao đến thấp sau đây: Hắc trà, Ô long trà, trà đen, trà xanh Thiếu Fl dễ mắc bệnh khắc sơn (Parkinson) ung thư đại tràng Fl có nhiều trà gạch ép bánh, loại trà yêu thích dân tộc thiểu số vùng Tây Tạng, Tân Cương, Cam Túc, Nội Mông Cổ Các vùng phần lớn nằm cao ngun, lấy chăn ni súc mục làm nghề chính; kết cấu phần lương thực với hàm lượng lớn thịt sữa, có nhu cầu uống trà gạch hàng ngày để phân giải lipid, hỗ trợ tiêu hóa bổ sung vitamin Do trà gạch (bánh) trở thành nhu yếu phẩm phải có sinh hoạt hàng ngày dân tộc thiểu sống vùng biên cương Nhưng nhiều Fl lại gây bệnh Fluorosis ảnh hưởng đến sức khỏe - Calcium: Hàm lượng Ca trà xanh 1,4-3,3mg, trà đen 2,9-6,6mg/g trà khô - Magie trà xanh 1,2-2,4mg, trà đen 1,2-2,3mg/g trà khô - Fe trà xanh 80-260mg, trà đen 100-290mg/g trà khô - Mangan trà xanh 0,2-1,1mg, trà đen 0,25-1,3mg/g trà khơ Mỗi ngày uống 5-6 chén trà đảm bảo ±45%, 25% 10% nhu cầu mangan, kali, Se Zn 4.Các loại glucid (hydratcarbon) Glucid nguồn chủ yếu cung cấp lượng tế bào thực vật có tác dụng chống rét, chống bệnh Glucid chè phân loại thành hai nhóm lớn: - Glucid đơn giản hay monosacarid (như đường bồ đào, glucose) - Glucid phức tạp hay polysaccarid, nhiều phần tử monosaccarid kết hợp với thành mạch dài có trọng lượng phân tử lớn; nhóm khơng tan nước tạo thành dung dịch keo (như tinh bột, cellulose) - Hàm lượng glucid hòa tan nước tăng theo tuổi chè; hàm lượng glucid không tan nhiều trà xấu 44  Phương pháp xử lý mẫu: Sau hái, mẫu chè non tráng nước, lau bụi bẩn tạp chất khăn giấy mềm trước lưu giữ nitơ lỏng tủ lạnh sâu (-24ºC) Bảo quản mẫu điều kiện giúp đảm bảo chè tươi, không dập nát, ứ nước gây khó khăn cho cơng tác tách chiết ADN sau  Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái giống/dòng chè: Các đặc điểm hình thái liên quan đến suất - chất lượng giống/dòng chè đánh giá theo tiêu chuẩn IPGRI Trừ đặc điểm dạng thân, tiêu chí chè (kích thước, màu sắc, hình thù ) đo đếm, đánh giá năm lần vị trí khác thu mẫu lấy giá trị trung bình Ngồi ra, thời gian hoa, giai đoạn nở hoa giống chè theo dõi để làm sở chọn lựa cặp lai 1.2 Tách chiết ADN từ giống/dòng chè Lá chè chứa nhiều polysaccharide, polyphenol chất chuyển hóa thứ cấp khác Các chất gây khó khăn cho trình tách chiết ADN chè, ảnh hưởng đến nồng độ, độ tinh ADN tổng số thu Để loại bỏ tối đa chất này, đề tài áp dụng quy trình tách chiết ADN tổng số Gawel Jarret (1991) có cải tiến để tách chiết ADN giống/dòng chè  Hóa chất vật tư: Hóa chất phục vụ tách chiết ADN chè cung cấp hãng BioRad, Sigma, Fermentas Mẫu nghiền cối chày sứ nitơ lỏng  Quy trình tách chiết ADN tổng số: (i) Nghiền khoảng g chè nitơ lỏng thành dạng bột mịn, sau chuyển sang ống Falcon 50 ml Thêm 10 ml đệm chiết (đã ủ sẵn nhiệt độ 60°C), trộn ủ khoảng 30- 45 phút 36 60°C bể lắc nhiệt (ii) Sau ủ, để dung dịch nguội tự nhiên nhiệt độ phòng (khoảng 10 phút), thêm 10 ml dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1), trộn cách đảo ống nhẹ nhàng đến dung dịch ống chuyển sang dạng sữa (iii) Ly tâm 5.000 vòng/ phút 15 phút nhiệt độ thường (iv) Hút chuyển dung dịch pha sang ống Falcon (tránh hút lớp cặn dung dịch pha dưới, lặp lại bước (ii)- (iii) dung dịch bị lẫn tạp Thêm thể tích tương ứng propanol (làm lạnh -20°C), lắc nhẹ giữ -20°C 30 phút (v) Ly tâm 10.000 vòng/ phút 10 phút (vi) Loại bỏ dung dịch ống, rửa kết tủa ethanol 70% Để khô kết tủa nhiệt độ phòng (khoảng giờ) Hòa tan kết tủa 500 µl TE (ở 4°C, qua đêm) sau chuyển sang ống eppendorf ml Thêm µl Rnase A (10 mg/ml) ủ 37°C (vii) Thêm 1ml dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1), lắc nhẹ cho dung dịch trộn ly tâm 12.000 vòng/ phút 15 phút (viii) Cẩn thận hút phần dung dịch pha sang ống eppendorf ml (lặp lại bước (vii)- (viii) dung dịch bị hút lẫn) Thêm lần thể tích ethanol (làm lạnh trước -20°C) 1/10 thể tích sodium acetate 3M, lắc nhẹ nhàng giữ -20°C (ix) Ly tâm 12.000 vòng/phút 10 phút, loại bỏ dung dịch ống rửa kết tủa ethanol 70% (hai lần) Để khô kết tủa nhiệt độ phòng 37 (x) Hòa tan kết tủa 100 đến 200 µl TE, sau bảo quản dung dịch ADN tổng số 4°C -20°C (bảo quản lâu dài) Các mẫu ADN tổng số chè với ADN nồng độ chuẩn (λDNA 25 ng/µl) điện di kiểm tra gel agarose 1% sau nhuộm dung dịch EtBr 0,5 ng/ml scan máy Molecular Imager FX (BioRad Laboratories) Độ tinh sạch, nguyên vẹn ADN đánh giá qua hình ảnh điện di, nồng độ mẫu ADN xác định thông qua phương pháp so sánh cường độ quang phần mềm QuantityOne (BioRad Laboratories) băng điện di mẫu ADN chè λDNA 1.3 Tiến hành nhận dạng ADN (PCR) giống/dòng chè  Phản ứng nhân gen SSR-PCR: Mẫu ADN giống dòng chè nhận dạng thị SSR Thành phần phản ứng nhân gen SSR-PCR chuẩn bị bảng 2.2 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng SSR-PCR Thành phần Nồng độ Đệm PCR 10X Thể tích cho phản ứng (µl) 1X Hỗn hợp dNTPs (2,5 mM loại) 0,2 mM 1,6 MgCl2 (25 mM) 2,0 mM 1,6 Mồi xuôi (20 pmol/µl) pmol/µl Mồi ngược (20 pmol/µl) pmol/µl Taq DNA polymerase (5 U/µl) U/20µl 0,15 ADN khn (25 ng/µl) dH2O 11,65 20 Tổng thể tích 38 Phản ứng SSR-PCR tiến hành máy PCR AB Vertity theo chu trình nhiệt sau: 95°C - phút 94°C - 1phút Ta - phút 30 chu kỳ 72°C - phút 30 giây 72°C - 15 phút 4°C - ∞ Nhiệt độ gắn mồi Ta cho cặp mồi SSR thống kê bảng 2.1  Điện di ghi nhận kết nhân gen SSR-PCR: Để nhận dạng di truyền giống/dòng chè, sản phẩm SSR-PCR điện di với DNA ladder 100 bp gel polyacrylamide 15% điều kiện 80V/120 phút Sau điện di, gel polyacrylamide nhuộm 20 phút dung dịch EtBr 0,5 ng/ml, sau soi chụp máy MultiDoc-It hãng UVP Kết nhận dạng di truyền giống/dòng chè thị SSR ghi nhận từ ảnh điện di phần mềm TotalLab TL120 1D v2009 (Nonlinear Dynamics Ltd.) theo nguyên tắc: với giống/ dòng chè, vị trí alen, có alen (có băng ADN) ký hiệu 1, khơng có alen (khơng có băng ADN) ký hiệu Dữ liệu kiểu gen từ hình ảnh điện di chuyển thành liệu nhị phân phần mềm Excel 2007 1.4 Phân tích phân nhóm giống/dòng chè xác định tổ hợp lai  Phân tích phân nhóm di truyền: Dữ liệu kiểu gen SSR giống/dòng chè xử lý, phân tích phần mềm NTSYS pc 2.11X (Applied Biosatistics) Mức độ tương đồng di truyền (genetic similarity) tính toán theo hệ số SM (Simple Matching) Dựa ma trận hệ số tương đồng di truyền SM, phân nhóm di truyền xây dựng phương pháp UPGMA 39  Xác định tổ hợp lai: Kết phân tích đa dạng di truyền sở xác định xác quan hệ di truyền giống/dòng chè bố mẹ Dựa kết phân nhóm di truyền ma trận hệ số tương đồng SM đề tài lựa chọn giống chè có quan hệ di truyền phù hợp để ghép cặp lai Mức độ tương đồng di truyền lựa chọn ≤ 0,8/1 (khác biệt di truyền ≥20%) Bên cạnh mức độ tương đồng di truyền, số tiêu chí khác áp dụng để chọn lựa cặp bố, mẹ cho phép lai: - Số liệu đánh giá kiểu hình liên quan đến suất, chất lượng - Giai đoạn hoa, chu kỳ nở hoa giống/ dòng chè - Độ tuổi giống/ dòng chè bố, mẹ (cây chè có độ tuổi sinh trưởng phù hợp cho lai tạo năm tuổi) Đố i với nộ i dung 2: Lai tạo giống chè Chè thân gỗ lâu năm, thời gian nở hoa dao động từ tháng 12 đến tháng năm sau Tuy nhiên, giống chè có thời gian nở hoa khác Đó thực tế khó khăn lai tạo giống chè mà nở hoa cặp bố, mẹ lựa chọn bị lệch pha khơng có hạt phấn để thụ phấn Do vậy, việc xác định thời gian nở hoa giống để thu thập bảo quản hạt phấn phục vụ cơng tác lai tạo có vai trò quan trọng 2.1 Khử phấn lai tạo giống/dòng chè Sau xác định cặp lai, tiến hành khử đực lai Hoa mẹ xác định từ chiều hơm trước, hoa nở cánh hoa khép kín nhụy nhị bên Các bước thu phấn hoa bố, khử đực hoa mẹ lai hoa thực vào buổi sáng hôm sau, từ 9-11 thời tiết tốt, khơng có mưa Hoa chè sau lai, bọc bảo vệ túi PE nhằm tránh côn trùng tác nhân gây ảnh hưởng khác Đối với cặp lai mà giống bố, mẹ có chu kỳ nở hoa lệch nhau, phải 40 tiến hành thu phấn hoa bố trước (khi hoa nở), bảo quản điều kiện 10~15°C chờ thụ phấn cho hoa mẹ Thời gian lệch pha chu kỳ nở hoa giống chè bố, mẹ không tuần phấn hoa suy giảm sức nảy mầm điều kiện bảo quản, ảnh hưởng đến kết phép lai 2.2 Tách phôi lai để nuôi cấy cứu phơi Tuổi phơi lai có ảnh hưởng lớn đến khả thành cơng thí nghiệm ni cấy cứu phơi, đề tài tiến hành xác định khoảng thời gian thích hợp để tách thu phơi Quy trình tách phơi chè lai (i) Quả chè lai đậu (thụ phấn thành công) cặp lai thu hái vào buổi sáng Dùng kéo cắt cuống, để riêng cặp lai đánh dấu tuổi phôi lên túi ni lông Phôi đưa phòng thí nghiệm, bảo quản ngăn mát tủ lạnh (ii) Khử trùng: loại bỏ cánh hoa, nhụy héo phần thừa, sau rửa xà phòng vòi nước chảy Dùng NaClO 10% ngâm 15 phút, sau rửa lại nước cất lần (iii) Tách phôi: dùng dao mổ loại nhỏ nhẹ nhàng cắt khoanh tròn (đường kính từ 1-2 mm), cậy bỏ phần vỏ nửa thấy phơi lộ ra, lấy phơi cấy vào mơi trường Một chè sau thụ tinh có từ 1-10 phơi (thơng thường, chè chín có từ 1-3 hạt, phần lớn có hạt) Đố i với nộ i dung 3: Cứu phơi tái sinh hồn chỉnh 3.1 Nuôi cấy cứu phôi lai chè  Môi trường nuôi cấy cứu phôi: Các nghiên cứu Akula (1998), Mondal (2004) Yoichi (2005) cho thấy sử dụng mơi trường MS có bổ sung 41 thêm chất điều hồ sinh trưởng ni cấy cứu phơi chè có hiệu [17], [33], [57] Trên sở kết nghiên cứu công bố thực tế số thí nghiệm thăm dò Viện KHKT NLN miền núi phía Bắc, đề tài chọn lựa tiến hành thử nghiệm năm môi trường cứu phơi khác (dựa mơi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ khác nhau) để chọn lựa môi trường phù hợp áp dụng nuôi cấy cứu phôi phôi lai: MT1: MS + 1mg/ l BAP + 0,1mg/l IBA + 30 g/l đường + 6g/l agar MT2: MS + mg/l 2,4 D + 30g/l đường + 6g/l agar MT3: MS + mg/l BAP + 30g/l đường + 6g/l agar MT4: ½ MS + mg/l GA3 + 50g/l đường + 6g/l agar MT5: ½ MS + mg/l GA3 + 50g/l đường + 6g/l agar pH=5,8 Mỗi công thức tiến hành 30 ống nghiệm, ba lần nhắc lại  Chỉ tiêu theo dõi: để xác định môi trường tối ưu đề tài tiến hành đánh giá số tiêu sau: - Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống sót mẫu mơi trường ni cấy - Tỷ lệ mẫu hình thành mơ sẹo/ chồi mơi trường ni cấy 3.2 Tạo hồn chỉnh  Môi trường nhân chồi: Sử dụng môi trường MS + mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetine + 2mg/l B1 + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 6g/l agar, pH 5,8  Tạo hoàn chỉnh: Cây chè có chiều cao 3- 4cm cấy sang 42 mơi trường tạo rễ (½ MS + 0,5mg/l IBA + 2mg/l IAA + 30g/l đường + 6g/l agar, pH= 5,8) để tạo hoàn chỉnh  Chỉ tiêu theo dõi: lệ rễ Tỷ lệ tạo chồi, tốc độ sinh trưởng, hệ số nhân chồi, tỷ 3.3 Nhân nhanh giống chè Chồi hình thành từ mầm phơi từ phơi vơ tính đạt chiều cao từ 4- cm (có từ 4- con) cắt thành đoạn dài 1- cm gồm đoạn thân và cấy vào môi trường nhân chồi Khi nhân đủ số cần cho thí nghiệm đánh giá chuyển sang mơi trường tạo rễ Thời gian cấy chuyển 2- 2,5 tháng/ lần  Tạo rễ: Chồi chè có chiều cao – cm cấy sang mơi trường tạo rễ: ½ MS + 0,5mg/l IBA + 2mg/l IAA + 30g/l đường + 6g/l agar, pH= 5,8  Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu nuôi cấy nhân nhanh chè đánh giá qua số tiêu: tỷ lệ tạo chồi, hệ số nhân chồi, tỷ lệ tạo rễ  Chuyển vườn ươm: Cây chè có rễ chuyển vườn ươm để đánh giá tiêu: tỷ lệ sống, đặc điểm thân, Đố i với nộ i dung 4: Phân tích kiểu gen SSR giống bố mẹ lai 4.1 Tách chiết ADN lai  Thu thập xử lý mẫu chè lai F1: tách lấy số chè lai F1 từ nuôi cấy in-vitro Cây rửa nước cất để loại bỏ hồn tồn mơi trường thạch ni cấy sót lại, sau để nước ngâm bảo quản nitơ lỏng  Tách chiết ADN từ chè F1: Do lượng mẫu nên đề tài tiến hành quy trình tách chiết ADN ống eppendorf ml (thay sử dụng cối 43 chày sứ) Các bước tiến hành thực công việc 1, nội dung 4.2 Tiến hành nhận dạng ADN lai kỹ thuật PCR sử dụng mồi SSR  Sàng lọc thị SSR cho đa hình giống bố mẹ: Để đảm bảo nhận dạng xác tổ hợp lai, dựa kết nhận dạng di truyền giống/dòng chè bố mẹ, xác định chọn lựa thị SSR cho đa hình giống chè bố, mẹ  Phản ứng nhân gen SSR-PCR: Phản ứng nhân gen nhận dạng di truyền chè F1 thực công việc 3, nội dung 4.3 Điện di sản phẩm PCR nhận dạng kiểu gen chè bố, mẹ lai gel agarose  Điện di gel agarose: Do cặp mồi SSR sử dụng để nhận dạng chè lai tạo alen đa hình có chênh lệch kích thước nhỏ (chỉ khác vài motif lặp) nên điện di sản phẩm PCR gel agarose khơng đảm bảo phân tách alen rõ ràng để đánh giá Chính vậy, để nhận dạng di truyền dòng chè lai, sản phẩm SSR-PCR điện di với DNA ladder 100bp gel polyacrylamide 15% điều kiện 80V/120 phút Sau điện di, gel nhuộm 20 phút dung dịch EtBr 0,5 ng/ml, sau soi chụp máy MultiDoc-It hãng UVP  Nhận dạng kiểu gen chè bố, mẹ lai: Kết nhận dạng di truyền chè lai giống/dòng chè bố, mẹ thị SSR ghi nhận từ ảnh điện di phần mềm TotalLab TL120 1D v2009 (Nonlinear Dynamics Ltd.) theo nguyên tắc: với giống/ dòng chè, vị trí alen, có alen (có băng ADN) ký hiệu 1, khơng có alen (khơng có băng ADN) ký hiệu Dữ liệu kiểu gen từ hình ảnh điện di chuyển thành liệu nhị phân phần mềm Excel 2007 44 4.4 Phân tích di truyền xác định lai F1 Từ ảnh điện di kết nhận dạng kiểu gen SSR, chè lai xác định theo nguyên tắc sau: - Các alen locus lai phải có bố mẹ hai bố mẹ - Alen xuất bố (hoặc mẹ) khơng xuất lai (phụ thuộc phân ly alen) - Cây lai xác định không phù hợp xuất alen mà bố mẹ khơng có Đố i với nộ i dung 5: Tuyển chọn dòng chè có triển vọng  Đánh giá vườn ươm: Các chè lai từ nuôi cấy đánh giá di truyền sức sinh trưởng từ lựa chọn thể sinh trưởng khoẻ, trồng bầu PE vườn ươm đánh giá tiêu sinh trưởng: chiều cao cây, đường kính gốc, số lá, trọng lượng búp  Đánh giá đồng ruộng: Cây chè vườn ươm đạt chiều cao 2530 cm (khoảng sáu tháng tuổi) trồng đồng ruộng để đánh giá tiêu liên quan đến suất chất lượng: - Đặc điểm thân, - Chiều cao cây, đường kính gốc, số cành cấp I, số cành cấp II - Số búp/cây, trọng lượng búp - Một số tiêu sinh hoá búp chè: tanin, chất hoà tan, cafein - Đánh giá cảm quan chè xanh: hương thơm, vị, màu nước Từ kết đánh giá tiêu suất chất lượng chọn lọc dòng chè triển vọng 45 * Nhận định chung phương pháp chọn giống truyền thống đại: Mặc dù sử dụng rộng rãi góp phần khơng nhỏ vào việc cải thiện suất, chất lượng chè suốt thập kỷ qua, phương pháp chọn tạo giống chè truyền thống có nhiều nhược điểm khó đáp ứng nhu cầu giống chè chất lượng số lượng gia tăng mạnh mẽ Nguyên nhân hạn chế có nhiều, có hai nguyên nhân chủ yếu, đặc điểm tự nhiên chè phương pháp sử dụng chọn tạo giống chè Về đặc điểm sinh học tự nhiên, chè có đặc tính thụ phấn chéo lại có thời gian hoa kéo dài (2-3 tháng) khác biệt giống Đặc điểm có tác động khơng nhỏ đến khả thụ phấn thành công cặp lai Ngay giống chè gần gũi, phép lai thành công xảy tượng chè lai tự rụng sau đến tháng Điều ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ thành công phép lai hữu tính nhằm tạo giống chè Bên cạnh đó, thời gian để chè phát triển hoàn chỉnh (từ thụ phấn đến ươm cây) từ 10 đến 12 tháng, với thời gian sinh trưởng phát triển chè từ gieo hạt đến đưa vào trồng sản xuất đến 20 tháng Nhìn chung, để có hệ chè thơng qua lai hữu tính phải cần từ hai đến ba năm Tuy nhiên, tính đến thời gian để chè phát triển hoàn chỉnh với đặc điểm suất chất lượng ổn định phải cần thêm ba đến năm năm Không vậy, hầu hết giống/dòng chè có kiểu gen dị hợp tử nên thụ phấn chéo, chè lai có đặc tính khơng đồng cần phải chọn lọc để tìm dòng triển vọng Các dòng chè triển vọng nhân giống để đưa vào đánh giá, phát triển thành giống sản xuất tiếp tục chọn lọc tìm dòng phù hợp với điều kiện tự nhiên vùng sản xuất khác Quá trình nhiều thời gian, có lên đến hàng chục năm Như thấy thời gian để có giống chè thơng qua phương pháp chọn tạo giống truyền thống dài, điều khó đáp ứng nhu cầu giống chè sản xuất Bên cạnh đặc điểm tự nhiên chè, phương pháp sử dụng chọn tạo giống chè truyền thống có điểm hạn chế lớn Trong lai hữu tính (và đánh giá chọn lọc dòng triển vọng), nhà chọn giống chè chủ yếu sử dụng đặc điểm hình thái liên quan đến đặc tính suất chất lượng để xác định giống bố mẹ tiến hành lai tạo Các đặc điểm hình thái chịu ảnh hưởng điều kiện tự nhiên có tính biến đổi, không phản ánh chất di truyền giống Do dễ dẫn đến khả phép lai không thành công giống bố, mẹ bất thụ (khác biệt di truyền lớn) chè lai khơng có ưu điểm vượt trội so với bố mẹ (tương đồng di truyền lớn nên ưu lai) Ngồi ra, q trình giao phấn (tự nhiên nhân tạo có kiểm sốt) có khả xảy sai sót, khó xác định xác nguồn gốc chè lai tạo Những nhược điểm hạn chế nhiều hiệu công tác chọn tạo giống chè phần ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển ngành sản xuất chế biến 46 chè Phương pháp chọn tạo giống chè đại với việc áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật công nghệ cứu phôi lai xa cho phép khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống mở triển vọng cho phát triển ngành chè Việt Nam C THÀNH TỰU TRONG TẠO GIỐNG CÂY CHÈ: Tuyển chọn lai tạo thành công giống chè mới, 03 giống chè quốc gia: PH1, LDP TRI 777 13 giống suất, chất lượng cao Bộ Nông nghiệp PTNT công nhận tạm thời phổ biến sản xuất: Giống chè PH1, Được công nhận giống quốc gia (1986), cho suất cao (15-20 búp/ha, có mơ hình đạt 30 tấn/ha) dùng để chế biến chè đen xuất khẩu, trồng sản xuất chiếm 8-9% diện tích chè nước Hai giống chè lai LDP1 & LDP2 (Giống LDP1 công nhận giống quốc gia năm 2002, giống LDP2 khu vực hoá năm 1994) có suất cao (14-19 tấn/ha), chất lượng tốt, chế biến chè xanh chè đen, trồng sản xuất chiếm khoảng 15% diện tích chè nước Bảy giống chè chất lượng cao (PVT, KAT, HĐB, PT95, Bát Tiên, Kim Tuyên Thuý Ngọc) chọn từ giống nhập nội có chất lượng cao mở rộng nhanh chóng sản xuất để góp phần nâng cao chất lượng chè Việt Nam năm tới Giống PH1 thích ứng ngoại cảnh tốt, chịu đựng điều kiện chiếu sáng mạnh Giống chè Shan TB14 có suất cao (khoảng 20 búp/ha/năm) Tán trà phát triển rộng, chất lượng tốt, hàm lượng tanin 33,46% chất khơ Giống TB14 có búp to PH1 có nhiều bạch mao thích hợp với thị hiếu tiêu thụ Giống chè TB11 có suất trung bình khoảng 16 búp tươi/ha/năm, hàm lượng tanin khoảng 35,12% chất khô, tán chè phát triển trung bình Giống chè TBKT Kim Tuyên Tên khác: Kim Hun, A17 dòng 27 47 Giống vơ tính Đài Loan, chọn lọc từ tổ hợp lai hữu tính mẹ giống Ơlong to địa phương bố giống Raiburi Ấn Độ vào năm 1975 Nhập nội vào Việt Nam từ 1994 Trồng tỉnh Lâm Đồng, Yên Bái, Phú Thọ, Lạng Sơn Năm 2003, Hội đồng khoa học Bộ NN-PTNT thông qua giống tạm thời cho SX thử nghiệm tỉnh Lâm Đồng, Phú Thọ, Yên Bái, Sơn La, Lạng Sơn.Năm 2008, Hội đồng khoa học Bộ NN-PTNT thông qua giống tiến kỹ thuật để SX chè Ôlong, chè xanh cao cấp Giống chè PH8 Nguồn gốc: Giống vơ tính Việt Nam, chọn lọc từ tổ hợp lai hữu tính giống chè TR1-777 giống chè Kim Tuyên Năm 1998, tiến hành lai hữu tính cặp lai có mẹ giống chè TR1-777 (giống chè shan chế biến chè xanh chất lượng cao Srilanca nhập nội vào Phú Hộ năm 1977) bố giống chè Kim Tuyên (giống chè TBKT tiếng chế biến chè olong chất lượng cao) Năm 2009 Hội đồng khoa học Bộ NN-PTNT thông qua giống tạm thời cho SX thử nghiệm tỉnh Thái Nguyên, Phú Thọ, Tuyên Quang Sơn La Giống chè PH9 Nguồn gốc: Giống vơ tính Việt Nam, chọn lọc từ tổ hợp lai hữu tính giống chè TRI-777 giống chè Kim Tuyên Năm 1998, tiến hành lai hữu tính cặp lai có mẹ giống chè TRI-777 (giống chè shan chế biến chè xanh chất lượng cao Srilanca nhập nội vào Phú Hộ năm 1977) bố giống chè Kim Tuyên (giống chè TBKT tiếng chế biến chè olong chất lượng cao) Năm 2009 Hội đồng khoa học Bộ NN-PTNT thông qua giống tạm thời cho SX thử nghiệm tỉnh Thái Nguyên, Phú Thọ, Tuyên Quang Sơn La D KẾT LUẬN Cây chè công nghiệp chủ lực nước ta, năm vừa qua đóng vai trò khơng nhỏ vào GDP giải lượng lớn lao động vùng nông thôn Do nhu cầu chọn tạo giống chè có suất cao phẩm 48 chất chất lượng tốt để phục vụ nhu cầu trồng chè xuất mối quan tâm không nhỏ Việc phát triển kỹ thuật mới, áp dụng thành tựu công nghệ sinh học vào chọn giống góp phần quan trọng chọn tạo giống chè khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống Hy vọng ngành chè nước ta ngày phát triển Tài liệu tham khảo: http://www.nhandan.org.vn/kinhte/tin-tuc/item/22287702-nghien-cuu-phat-trien-cacgiong-che-xanh-che-o-long-chat-luong-cao.html truy cập ngày 9/5/2014 http://vaas.vn/thanhvien_home.asp?newsgroupID=NEW_070715124606 truy cập ngày 9/5/2014 http://www.lamdong.gov.vn/vi-VN/a/book/Pages/books/Chuyendeche/thuthap.htm truy cập ngày 9/5/2014 Luận văn Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền giống/dòng chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) Việt Nam thị hình thái thị phân tử microsatellite (SSR) thạc sĩ Trần Đức Trung: http://luanvan365.com/luan-van/luan-van-nghien-cuu-danh-gia-su-da-dang-di-truyencac-giongdong-che-camellia-sinensisl-o-kuntze-o-viet-nam-bang-chi-47517/ Đề tài nghiên cứu chọn tạo giống chè suất cao, chất lượng tốt thị phân tử công nghệ cứu phôi tiến sĩ La Tuấn Nghĩa: http://text.123doc.vn/document/1321951-nghien-cuu-chon-tao-giong-che-nang-suatcao-chat-luong-tot-nho-chi-thi-phan-tu-va-cong-nghe-cay-phoi.htm 49 50 ... giản nhiều chè Vân Nam Trung Quốc chất cafein phức tạp chè Vân Nam nhiều chè Việt Nam Do tác giả đề xuất sơ đồ tiến hố chè sau : Camelia- chè Việt Nam – chè Vân Nam to – chè Trung Quốc – chè Assam... nở hoa giống/ dòng chè - Độ tuổi giống/ dòng chè bố, mẹ (cây chè có độ tuổi sinh trưởng phù hợp cho lai tạo năm tuổi) Đố i với nộ i dung 2: Lai tạo giống chè Chè thân gỗ lâu năm, thời gian nở... NHÂN GIỐNG: I ĐẶC ĐIỂM CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG CHÈ Chè trồng lâu năm thời gian sinh trưởng dài, đặc trưng sinh trưởng dinh dưỡng sinh trưởng sinh thực biểu khác nhau, việc nghiên cứu giống chè cần