Đang tải... (xem toàn văn)
Chế tạo và đánh giá hiệu quả hình thành phức hợp oxytocin PEG để làm thuốc bằng các phương pháp hóa sinh
Bộ Y tế Trường Đại học Dược Hà Nội CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH THÀNH PHỨC HỢP OXYTOCINPEG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH Người thực hiện: Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Rư HVCH Lê Quang Nghị Nội dung Đặt vấn đề Nguyên liệu phương pháp F Thực nghiệm kết Kết luận đề xuất Đặt vấn đề Đặt vấn đề Oxytocin - Đặc điểm cấu tạo - Vai trò - Sự bền phân tử - Dễ bị phân hủy enzym thể Kém ổn định bảo quản Phương pháp tăng độ bền ? Phương pháp pegyl hóa Tăng độ bền phân tử Tăng cường tác dụng Pegyl hóa Giảm tính sinh miễn dịch protein thể Tăng thời gian bán thải Mục tiêu Gắn kết Oxytocin với phân tử polyehthylen glycol tạo phức hợp Oxytocin-PEG Xác định hiệu hình thành phức hợp Oxytocin-PEG Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu phương pháp Nguyên liệu Hóa chất Thiết bị Oxytocin, methoxyl polyethylen glycol propion aldehyd 5kDa Kali dihyrophosphat, ethanol, Tris(methylen, aminopersulfat, natri dodecyl sulfat,… Máy khuấy từ, điện di, buret, tủ lạnh, máy đo quang… Phương pháp nghiên cứu - Gắn PEG vào phân tử Oxytocin Dựa phản ứng khử - Dựa nghiên cứu Jenifer Collin công Đã thực phản ứng liên hợp với Oxytocin với mPEG aldehyd Xác định vị trí gắn amin Cys Phương pháp nghiên cứu Xác định hình thành Oxytocin-PEG phương pháp điện di Điện di gel polyacrylamid có Natri dodecyl sulfat (SDS) 3.5 Đánh giá ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tớivlượng Oxytocin-PEG sau sắc ký lọc gel Quá trình đánh giá tiến hành mức, thêm bớt lượng mPEG aldehyd 10%, 20% so với ban đầu M0 M2 (-20%) M1 (-10%) M0 M3(+10%) M4(+20%) Kết rửa giải cột sắc ký lọc gel mẫu phản ứng M1 0.4 D Mẫu phản ứng xuất Ve=12 ml 0.35 - đỉnh pick Oxytocin-PEG 0.3 Ve=18 ml 0.25 0.2 0.15 ml 0.1 0.05 0 10 12 14 16 18 20 22 24 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải mẫu M Ve=12ml Kết rửa giải cột sắc ký lọc gel mẫu phản ứng M2 D 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 Ve=12 ml Mẫu phản ứng xuất đỉnh Ve=18 ml pick Ve=12ml Oxytocin-PEG 10 12 14 16 18 20 22 24 ml Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải mẫu M2 Kết rửa giải cột sắc ký lọc gel mẫu phản ứng M3 D 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 Mẫu phản ứng xuất Ve=12 ml đỉnh pick Oxytocin-PEG Ve=18 ml ml 10 12 14 16 18 20 22 24 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải mẫu M3 Ve=12ml Kết rửa giải cột sắc ký lọc gel mẫu phản ứng M4 D Ve=12 ml 0.4 Mẫu phản ứng xuất 0.35 đỉnh pick Ve=12ml Oxytocin-PEG 0.3 Ve=18 ml 0.25 0.2 0.15 0.1 ml 0.05 0 10 12 14 16 18 20 22 24 Đồ thị tương quan mật độ quang phân đoạn rửa giải mẫu M Nhận xét chung Mẫu M0, M1, M2, M3, M4 cho pick sắc ký + Có hình thành Oxytocin-PEG + Ve Oxytoin-PEG 12 ml, M= kDa + Lượng hợp chất Oxytocin-PEG nằm phân đoạn ml -14ml Đánh giá ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tới lượng Oxytocin-PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel Thông số M2 M1 M0 mOxytocin mPEG M1 M2 44,55 48,60 32,40 36,45 40,50 Ve 12 MOxytocin-PEG mOxytocin-PEG 29,36 30,22 30,28 30,61 31,38 H% 61,16 62,95 63,08 63,76 65,38 p 0,07 0,81 0,27 0,06 Nhận xét: Lượng hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG mẫu Bàn luận Về phản ứng Về khối lượng Về đánh giá pegyl hóa phân tử protein hiệu suất thu Oxytocin sau phản ứng hồi Oxytocin-PEG Về phản ứng pegyl hóa • Cơ chế phản ứng • • • • • • Vị trí nhóm NH2: Cys1 mPEG aldehyd: Methoxyl polyethylen glycol propion aldehyd pH: 4,5 7,5 Tác nhân khử : NaCNBH3 Tiến hành phản ứng Kết điện di : hình thành Oxytocin-PEG, kDa Khối lượng phân tử protein sau phản ứng - Xác định hình thành OxytocinPEG - Tách chiết Xác định M Oxytocin-PEG = kDa Kết luận: phân tử mPEG aldehyd gắn kết với phân tử Oxytocin Về đánh giá hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG Ảnh hưởng pH Lượng hiệu suất thu hồi OxytocinPEG Mẫu pH 4,5 > Điều giải thích theo chế phản ứng Mẫu pH 7,5 Về đánh giá hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG Ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd Oxytocin Thay đổi khoảng 10, 20% Ve=12ml Oxytocin-PEG lượng mPEG aldehyd M =6 kDa Lượng hiệu suất thu hồi - Do khoảng khảo sát hẹp Ảnh hưởng trình tách chiết Kết luận đề xuất Kết luận Đã thực hiên gắn phân tử Đã tách chiết xác định PEG vào Oxytocin khối lượng phân tử Oxytocin-PEG Oxytocin Xác định điều kiện phản ứng phù hợp Đánh giá ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd Đề xuất: Khảo sát điều kiện khác, cải tiến phương pháp xây dựng tiêu chuẩn đánh giá đặc điểm Oxytocin-PEG Cảm ơn thầy cô bạn ý lắng nghe ! ... polyehthylen glycol tạo phức hợp Oxytocin- PEG Xác định hiệu hình thành phức hợp Oxytocin- PEG Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu phương pháp Nguyên liệu Hóa chất Thiết bị Oxytocin, methoxyl... Cys Phương pháp nghiên cứu Xác định hình thành Oxytocin- PEG phương pháp điện di Điện di gel polyacrylamid có Natri dodecyl sulfat (SDS) Phương pháp nghiên cứu Phương pháp sắc ký lọc gel Phương. .. Cthử Oxytocin_ PEG Lượng hợp chất Oxytocin- PEG dung dịch sau sắc ký lọc gel (mg) Hiệu suất thu hồi hợp chất Oxytocin- PEG VR ml H% = (mg/ml) Thực nghiệm kết Thực ngiệm kết 3.1 Gắn PEG vào phân