CHƯƠNG 5: SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION I NGUYÊN TẮC Sắc ký trao đổi ion q trình dung dịch chất điện ly cho tiếp xúc với nhựa (resin) trao đổi ion ion hoạt động bề mặt nhựa chỗ ion có điện tích dung dịch chất điện ly Nhựa trao đổi ion chất khơng tan nước, mang nhóm chức có điện tích, nhóm chức liên kết với đối-ion (contre-ions) có dung dịch cần phân tích Nếu nhựa mang nhóm chức có điện tích dươn,g đối-ion có điện tích âm trao đổi với ion âm, nhựa loại gọi nhựa trao đổi anion Ngược lại, nhựa mang nhóm chức có điện tích âm, đối-ion có điện tích dương, nhựa thực trao đổi với ion dương, nên gọi nhựa trao đổi cation II PHÂN LOẠI Nhựa trao đổi anion mang nhóm chức phân cực amonium tam tứ cấp (CH2NR2 –CH2-N+R3) Nhựa trao đổi anion thường sản xuất dạng Clorur (Cl -) dạng hydroxid (OH-) dạng Clorur bền Nhựa trao đổi cation mang nhóm chức phân cực có tính acid, thường SO 3H; COOH; OH; H3PO4 Các nhóm gắn vào phân tử polimer (nhựa) theo khoảng cách đặn III CÁC LOẠI NHỰA TRAO ĐỔI ION Các loại nguyên liệu để làm nhựa trao đổi ion bao gồm hạt không tan nước, bề mặt hạt có mang nhóm chức có điện tích dương điện tích âm Các đối-ion tự liên kết với nhóm chức Các nguyên liệu làm nhựa trao đổi ion polysaccharid resin tổng hợp Có nguyên liệu chính: nhựa polystyren, polymer carbonhydrat silica gel - Nhựa polystyren nguyên liệu thông dụng nhất, polystyren metacrylat mang nhiều nhóm mang điện tích Mạng nhựa rắn bền mặt hóa học Mạng polystyren chịu khoảng pH từ 1-14, mạng metacrylat chịu khoảng pH từ 2-10.Nhựa thơng dụng Dowex, tổng hợp từ styren với divyninbenzen (DVB) để nối mạng ngang - Polymer carbohydrat: Hạt nhựa polysaccharid có tính nước (hydrophilic) nên thường sử dụng để tách protein - Một loại nhựa thông dụng Sephadex Sephadex dextran nối mạng ngang tạo mạng chiều, nhóm chức hoạt động gắn lên dextran ngang qua cầu nối ether Nhựa dạng hình cầu nên cho dòng chảy qua giải ly dễ Nhựa trương nở nước nên dễ nạp vào cột Có loại nhựa Sephadex: - Sephadex 25 có độ nối mạng ngang chặt chẽ, hạt gel trương nở ít, phù hợp để tách hợp chất tự nhiên - Sephadex 50 có độ rỗng lớn hơn, thường dùng để tách đại phân tử hữu có trọng lượng lớn 30.000 dalton phân tử protein hay phân tử dễ bị hư hại Ngồi có loại nhựa Sepharose (là agarose nối mạng ngang) cellulose Gần thị trường có loại hạt nhựa tạo silica Ngược lại với hạt nhựa trên, hạt nhựa silica không trương nở theo thành phần dung môi sử dụng Hạt nhựa có nhược điểm cần có ổn định pH, nhựa bền khoảng pH=2-7,5 II ĐẶC ĐIỂM CỦA NHỰA TRAO ĐỔI ION Trong sắc ký trao đổi ion, yếu tố quan trọng nhóm chức (thực trao đổi) gắn nhựa Việc trao đổi xảy phần bề mặt dung môi tiếp xúc với bề mặt hạt nhựa phần bên hạt nhựa Người ta thấy với ion nhỏ (ion kim loại, anion vơ có kích cỡ nhỏ, ion hữu kích cỡ nhỏ) dễ dàng bị hấp thu hết nhóm hoạt động nhựa trao đổi ion Nhựa có độ nối mạng ngang (crosslinkage) lớn kích thuớc lỗ rỗng nhỏ, có tính lựa chọn cao ion nhỏ, ion lớn bị đuổi khỏi cột nhựa Nhựa dùng làm sắc ký trao đổi ion cần có đặc điểm sau: - Độ nối mạng ngang 4-8% - Kích cỡ hạt nhỏ tốt - Các hạt phải đồng Trong trình trao đổi ion, việc gắn tách rời hợp chất khỏi nhựa trao đổi ion trình hấp phụ thuận nghịch, xảy chủ yếu theo lực Vander Walls, có tương tác lưỡng cực Mỗi nhựa xác định khả trao đổi ion Khả xác định số nhóm chức mang điện tích 1g resin khơ Thí dụ, nhựa có khả trao đổi ghi meq/g nghĩa 1g nhựa khơ có khả trao đổi ion với milimol loại phân tử đơn diện tích milimol loại phân tử điện tích Nhựa mạnh (acid mạnh, baz mạnh) sử dụng nhiều loại yếu nhờ thực việc trao đổi khoảng pH mạnh Các loại nhựa acid yếu baz yếu diện dạng ion dạng muối nên hoạt động khoảng pH giới hạn Nhựa loại baz yếu hấp phụ chất có tính acid mạnh ngược lại Những loại nhựa trao đổi ion cổ điển thường tách phân tử sinh học (có tính phân cực mạnh có điện tích) khỏi hỗn hợp chúng, phân tử khơng chui vào hạt nhựa Hiện nay, số loại nhựa thương mại dextran hiệu việc tách hợp chất đại phân tử Bảng 11: Các đặc tính tổng quát loại nhựa trao đổi ion Loại Nhóm chức trao đổi Khoảng pH Nhựa trao đổi ion cation acid mạnh -SO3H 1-14 Nhựa trao đổi ion cation acid yếu -COOH 5-14 Nhựa trao đổi ion anion baz mạnh -CH2-N+R3 1-15 Nhựa trao đổi ion anion baz yếu -CH2NR2 1-9 III NHỰA SEPHADEX ĐẶC ĐIỂM: Nhựa Sephadex không tan dung môi, bền nước, dung dịch nước muối, dung dịch có tính acid baz yếu Trong dung dịch có tính acid mạnh, gây thủy giải chuỗi dây glucose Cho nên sử dụng cần tránh mơi trường có pHpI: phân tử protein dạng anion (H2N-CR2-COO-) chúng tách nhựa trao đổi anion - Tại pHpI, dùng nhựa trao đổi anion DEAE QAE - Nếu protein khơng bị hư khoảng pH10 lỗ rỗng 2-12 Silica 2-7,5 >30 >400 10 >400 Bảng 15: Nhựa trao đổi anion mạnh Tên thương mại Hãng sản xuất Nhóm chức Đốiion Chất mang Dowex 1X2-100 Dow Cl- Polistyren nối mạng 2% Dowex 1X8-400 Dow Trimetilbenzyl amonium Trimetilbenzyl amonium Amonium tứ cấp Khả Khoảng trao đổi pH (meq/100 ml) 70 0-14 Cl- Polistyren nối mạng 8% 120 0-14 Cl- Polistyren nối mạng 8% 140 0-14 Cl- Polistyren 130 0-14 Cl- Polistyren 130 0-14 Cl- Polistyren có lỗ rỗng 100 0-14 Cl- 0-14 Cl- Polistyren có lỗ nối mạng 6% Dextran rỗng 120 Pharmacia Trimetilbenzyl amonium Trimetilbenzyl hidroxietil amonium Trimetilbenzyl Amonium Trimetilbenzyl amonium Aminoetil tứ cấp TosoHaas Aminoetil tứ cấp Cl- Polistyren divinilbenzen Amberlite IRA- Rohm Haas 400 Diaion SA10A Mitsubishi Diaion SA10A Mitsubishi Amberlite IRA- Rohm Haas 900 Daion PA-312 Mitsubishi QAE-Sephadex A-25 TSKgel SAX 50 2-12 >370 1-14 Hạt gel (mesh) kích cở (µm) 50-100 150-250 200-400 35-75 16-50 500-1000 40-60 350-550 40-60 350-550 16-50 500-1000 16-50 500-1000 100-400 40-120 >400 Bảng 16: Nhựa trao đổi cation yếu Tên thương mại Hãng xuất sản Nhóm chức Đối-ion Chất mang Khả trao Khoảng đổi pH (meq/100 ml) CM-Sephadex 25 A- Pharmacia Amberlite IRC-50 Dianion WK10 Duolite C-433 Dianion CR 10 Carboximetil Na+ Dextran 56 2-12 Hạt gel (mesh) kích cở (µm) 100-400 40-120 Rohm Haas Mitsubishi Rohm Haas Mitsubishi Acid carboxilic H+ Acid carboxilic H+ Acid carboxilic H+ Polistyren 4% nối 350 Polimetacrylat 5-14 16-50 500-1000 250 5-14 40-60 350-550 Polistyren 420 5-14 16-50 500-1000 Acid carboxilic Na+ Polistyren 50 1-5 40-60 350-550 Cellex CM Bio Rad Carboximetil H+ Cellulose 70 5-12 200-400 TSKgel CM-3SW TosoHaas Carboximetil Na+ Silica >30 2-7,5 >400 10 Bảng 17: Nhựa trao đổi Cation mạnh Tên thương mại Hãng xuất SP-Sephadex A- Pharmacia 25 Dowex-50X2-100 Dow Dowex-50X8-100 Diaion SK1B Amberlite IR-I22 Diaion SK122 TSKgel Sp-5PW TSKgel SCX sản Nhóm chức Sulfopropil Acidsulfoni c Dow Acidsulfoni c Mitsubishi Acidsulfoni c Rohm & Haas Acidsulfoni c Mitsubishi Acidsulfoni c TosoHaas Acidsulfoni c TosoHaas Acidsulfoni c Đối-ion Chất mang Na+ Dextran H+ Polistyren 2% Polistyren 8% Polistyren nối 60 0-14 Hạt gel (mesh) kích cở (µm) 100-400 40-120 50-100 nối 170 0-14 50-100 190 0-14 nối 210 0-14 nối 210 0-9 Na+ Polistyren 10% Polistyren 12% Metacrylat Na+ Polistyren/DVB 40-60 400-600 16-50 500-1000 16-50 500-1000 >400 10 >400 H+ Na+ Na+ Na+ Khả Khoảng trao đổi pH (meq/100 ml) 30 2-12 >10 2-12 >420 1-14 Đối-ion dung dịch đệm ban đầu (о) Các hợp chất cần tách : (▲) (▄) Ion dung dịch giải ly tuyến tính (•) (о) - Giai đoạn 1: Nhựa trao đổi ion cân với đối-ion Các hợp chất cần phân tích chuẩn bị ngang qua nhựa - Giai đoạn 2: nhựa trao đổi ion trao đổi với hợp chất cần phân tích Sau giai đoạn hấp thu này, việc giải ly tuyến tính áp dụng - Giai đoạn 3: Ion dung dịch giải ly tuyến tính tranh giành trao đổi với nhựa đẩy hợp chất cần tách (▲) khỏi nhựa trao đổi ion - Giai đoạn 4: Tiếp theo, ion dung dịch giải ly tuyến tính tranh giành trao đổi với nhựa đẩy hợp chất (▄) khỏi nhựa trao đổi ion - Giai đoạn 5: Tái tạo nhựa: ion dung dịch giải ly trao đổi với đốiion để trả lại tình trạng nhựa ban đầu  ... 200-400 35- 75 16 -50 50 0-1000 40-60 350 -55 0 40-60 350 -55 0 16 -50 50 0-1000 16 -50 50 0-1000 100-400 40-120 >400 Bảng 16: Nhựa trao đổi cation yếu Tên thương mại Hãng xuất sản Nhóm chức Đối -ion Chất mang... điện hợp chất) hợp chất có điện tích tồn phần zero, hợp chất không gắn vào nhựa Các protein hợp chất luỡng cực nên tùy thuộc vào pH mà protein có khả gắn vào nhựa trao đổi anion hay nhựa trao đổi. .. carboxilic H+ Polistyren 4% nối 350 Polimetacrylat 5- 14 16 -50 50 0-1000 250 5- 14 40-60 350 -55 0 Polistyren 420 5- 14 16 -50 50 0-1000 Acid carboxilic Na+ Polistyren 50 1 -5 40-60 350 -55 0 Cellex CM Bio Rad Carboximetil