BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƢỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân lập khảo sát số đặc tính chủng vi khuẩn nội sinh Hoàn Ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) Neem (Azadirachta indica) Giảng viên hƣớng dẫn : ThS Nguyễn Thị Kim Cúc Sinh viên thực : Lê Thái Thủy Tiên Mã số sinh viên : 56132000 Khánh Hòa - 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân lập khảo sát số đặc tính chủng vi khuẩn nội sinh Hoàn Ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) Neem (Azadirachta indica) Giảng viên hƣớng dẫn : ThS Nguyễn Thị Kim Cúc Sinh viên thực : Lê Thái Thủy Tiên Mã số sinh viên : 56132000 Khánh Hòa, tháng 7/2018 LỜI CẢM ƠN Thực tập tốt nghiệp thật hội quan trọng để sinh viên nói chung, sinh viên chuyên ngành Cơng nghệ Sinh học nói riêng tiếp cận thực tế nghề nghiệp, rèn luyện phƣơng pháp nghiên cứu khoa học hoàn thiện kỹ thực hành cần thiết trƣớc rời khỏi giảng đƣờng đại học Những kiến thức đúc kết đƣợc bƣớc đệm vững chắc, hỗ trợ cho công việc thực tế sau Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp, ngồi cố gắng thân, tơi nhận đƣợc giúp đỡ nhiều quan cá nhân Với tất chân thành lòng biết ơn sâu sắc xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới: Thạc sĩ Nguyễn Thị Kim Cúc – giáo viên hƣớng dẫn, ngƣời định hƣớng bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Cám ơn cô giúp cho em có định hƣớng tốt cách tƣ khoa học học hỏi đƣợc nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quý giá Chị Nguyễn Minh Nhật tạo điều kiện cho đƣợc học hỏi thực đề tài Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành, Trƣờng Đại học Nha Trang Quý thầy cô giáo chuyên ngành Công nghệ Sinh học trang bị cho em kiến thức cần thiết để làm khóa luận Tơi xin đƣợc cảm ơn ngƣời bạn thân yêu lớp 56CNSH Tôi học hỏi đƣợc nhiều điều từ bạn suốt năm qua Tình cảm tơi trân trọng Cuối cùng, xin đƣợc gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình Cám ơn cha mẹ anh chị bên cạnh động viên lúc khó khăn giúp nên ngƣời Tôi xin chân thành cám ơn! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc Neem 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.2.2 Nguồn gốc phân bố 1.2.3 Đặc điểm hình thái 1.2.4 Tác dụng Neem 1.2 Cây Hoàn Ngọc 1.2.1 Đặc điểm thực vật học 1.2.2 Nguồn gốc phân bố 1.2.3 Đặc điểm hình thái 1.3.4 Tác dụng Hoàn Ngọc 1.3 Sơ lƣợc vi khuẩn nội sinh 10 1.3.1 Nguồn gốc 10 1.3.2 Di chuyển 10 1.3.3 Tiếp cận 11 1.3.4 Xâm nhập 11 1.3.5 Sinh sản 11 1.3.6 Định cư 11 1.4 Vai trò vi khuẩn nội sinh 12 1.5 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thƣờng gặp 13 1.5.1 Vi khuẩn Bacillus 13 1.5.2 Vi khuẩn Klebsiella 14 1.5.3 Vi khuẩn Pseudomonas 14 1.5.4 Vi khuẩn Azotobacter 15 1.5.5 Vi khuẩn Azospirillum 15 1.6 Một số vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp 15 1.6.1 Vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 15 ii 1.6.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 6538 16 1.6.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis 16 1.6.4 Vi khuẩn Vibrio 17 1.6.4.1 Vi khuẩn Vibrio harveyi 17 1.6.4.2 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 18 1.6.5 Nấm men Yarrowia lipolytica 19 1.7 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh nƣớc 19 1.7.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh nước 19 1.7.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh nước 20 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2.1 Mẫu vật 22 2.2.2 Chủng vi khuẩn kiểm định 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 24 2.3.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn nội sinh 24 2.3.3 Phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn nội sinh 24 2.3.4 uan sát hình thái khuẩn l c 24 2.3.5 Nhuộm Gram 25 2.3.6 Xác định khả di động 25 2.3.7 Khảo sát số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn nội sinh 26 2.3.7.1 Khảo sát khả kháng khuẩn 26 2.3.7.2 Thử nghiệm khả sinh enzyme ngo i bào 27 2.3.8 Các thử nghiệm sinh hóa 28 2.3.8.1 Thử nghiệm catalase 28 2.3.8.2 Thử nghiệm oxidase 29 2.3.8.3 Thử ngiệm citrate 29 2.3.8.4 Khả làm dịch hóa Gelatin 29 2.3.8.5 Các thử nghiệm lên men đường 30 2.3.8.6 Thử nghiệm khả oxi hóa – lên men 30 2.3.8.7 Khả phát triển 10% NaCl 31 2.3.8.8 Thử nghiệm CAMP 31 2.3.8.9 Khả sinh bào tử 32 iii CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ Neem Hoàn Ngọc 33 3.1.1 Đặc điểm khuẩn l c chủng vi khuẩn nội sinh 34 3.1.2 Đặc điểm tế bào chủng vi khuẩn nội sinh 37 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh 39 3.3 Khả kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh 42 3.3.1 Khả kháng khuẩn kháng nấm chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem 42 3.3.2 Khả kháng khuẩn kháng nấm chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Hoàn Ngọc 46 3.4 Khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn nội sinh 47 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 57 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số công dụng dƣợc liệu phận Neem Bảng 2.1 Bảng đánh giá mức độ đƣờng kính vòng kháng khuẩn 27 Bảng 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ Neem Hoàn Ngọc 34 Bảng 3.2 Các đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh 35 Bảng 3.3 Đặc điểm tế bào tính di động chủng vi khuẩn nội sinh 37 Bảng 3.4 Các đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh 40 Bảng 3.5 Đặc điểm khuẩn lạc môi trƣờng thạch máu 41 Bảng 3.6 Khả kháng khuẩn kháng nấm vi khuẩn nội sinh từ Neem 45 Bảng 3.7 Khả kháng khuẩn kháng nấm chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Hoàn Ngọc 46 Bảng 3.8 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn nội sinh 47 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Neem (cây sầu đâu) Hình 1.2 Lá Hoàn Ngọc (a), rễ Hoàn Ngọc (b) Hình 1.3 Vai trò vi sinh vật nội sinh chủ 12 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát phƣơng pháp nghiên cứu 23 Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn 26 Hình 2.3 Vùng kháng khuẩn vi khuẩn nội sinh phân lập đƣợc đĩa peptri 27 Hình 2.4 Sơ đồ thử nghiệm hoạt tính sinh enzyme ngoại bào 27 Hình 2.5 Vùng phân giải chất chủng vi khuẩn nội sinh phân lập đƣợc 28 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ CFU Colony Forming Unit OD Optical Density TSA Tryptic Soya Agar TSB Tryptic Soya broth cs cộng OF Oxydative-Fermentative VSV vi sinh vật SCA Simmon’ citrat agar CMC Carboxymethyl cellulose IAA Auxin HIV Human Immunodeficiency Virus mg% Phần trăm khối lƣợng HSV-1 Herpes simplex virus type HSV-2 Herpes simplex virus type vii ĐẶT VẤN ĐỀ Các dƣợc liệu mọc tự nhiên đƣợc ngƣời dân ta sử dụng từ lâu đời từ thời chƣa có xuất kháng sinh nhƣng đem lại hiệu tốt chữa trị bệnh cảm cúm, sốt, cầm máu, Với điều kiện thiên nhiên nhiều ƣu đãi, Việt Nam có hệ sinh thái phong phú đa dạng, có nhiều tiềm để phát triển nguồn dƣợc liệu Trong đó, có nhiều dƣợc liệu có tính kháng khuẩn đƣợc y học dân tộc dùng làm thuốc Hiện với phát triển y học, thuốc từ thực vật đƣợc sử dụng để chữa bệnh ngày nhiều Các lồi thực vật có tự nhiên, dễ kiếm, lại có tác dụng phụ cho ngƣời, thu hút quan tâm nhà nghiên cứu hóa sinh y dƣợc học nƣớc nhƣ giới (Võ Thị Mai Hƣơng, 2009) Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khoảng 80% dân số giới từ nƣớc phát triển dựa chủ yếu vào loại thuốc truyền thống (chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật) để chăm sóc sức khỏe Trong 119 loại hợp chất hóa học, 90 loại có nguồn gốc từ thực vật, loại thuốc đƣợc sử dụng ngày nhiều nhiều quốc gia Hiện có nhiều chất chiết xuất từ có tác dụng chữa bệnh, vấn đề đặt chất có hoạt tính sinh học chất kháng sinh tự nhiên sinh kết mối liên hệ tƣơng sinh với vi sinh vật nội sinh có ích mô thực vật Vi sinh vật nội sinh mô thực vật vi sinh vật liên kết sống mô sống thực vật mà không gây hại cho chủ (Hallmann, 1997) Một số nghiên cứu chứng minh vi khuẩn nội sinh có khả kiểm soát sinh học với loại nấm, vi khuẩn tuyến trùng Do vi sinh vật nội sinh sống đem lại cho trồng nhiều điều kiện thuận lợi giúp trồng phát triển tốt Từ lợi ích tiềm to lớn vi sinh vật nội sinh, việc tìm kiếm đánh giá đặc điểm vi sinh vật nội sinh dƣợc liệu hƣớng đắn cơng tìm chủng có khả chống lại vi khuẩn gây bệnh Cây Neem Hoàn Ngọc dƣợc liệu quý có chứa nhiều hợp chất sinh học có tiềm năng, đƣợc sử dụng phổ biến ngành công nghiệp dƣợc, công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm Hai loại mọc hoang dại không cần sử dụng phân bón hay thuốc trừ sâu sinh học nên vi khuẩn nội sinh đa dạng, phong phú Hình PLB.2 Kết kháng khuẩn chủng NT1-NT4 phân lập từ Neem 60 Hình PLB.3 Kết kháng khuẩn chủng NT5-NL3 phân lập từ Neem 61 Phụ lục B.2 kết kháng khuẩn chủng nội sinh từ Hồn Ngọc Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 25 20 15 10 E.coli B.subtilis S.aureus V.para X9 V.harveyi MCRX MCRV Nấm men Các chủng vi khuẩn gây bệnh XHT3 XHT6 XHT7 XHL XHR1 XHR2 Hình PLB.4 Biểu đồ so sánh khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn nội sinh từ Hoàn Ngọc 62 Hình PLB.5 Kết kháng khuẩn chủng HNT6-HNT7 phân lập từ Hồn Ngọc 63 Hình PLB.6 Kết kháng khuẩn chủng HNL1-HNR2 phân lập từ Hoàn Ngọc 64 Phụ lục B.3 Kết sinh enzyme amylase chủng NT4 NT4 Hình PLB.7 Kết sinh enzyme amylase chủng NT4 Phụ lục B.4 Kết sinh protease chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Neem Hình PLB.8 Kết sinh protease chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Neem Phụ lục B.5 Kết sinh enzyme protease chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Hồn Ngọc Hình PLB.9 Kết sinh enzyme protease chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Hoàn Ngọc 65 Phu lục B.6 Kết sinh enzyme CMC chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem Hình PLB.10 Kết sinh enzyme CMC chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem Phụ lục B.7 Kết sinh enzyme CMC chủng vi khuẩn nội sinh từ Hồn Ngọc Hình PLB.11 Kết sinh enzyme CMC chủng vi khuẩn nội sinh từ Hoàn Ngọc 66 Phụ lục C Phụ lục C.1 Test khả di động HNT3 HNT6 HNT7 HNR1 HNR2 HNL1 Hình PLC.1 Khả di động sinh chủng phân lập từ Hoàn Ngọc NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NL1 NL2 NL3 Hình PLC.2 Khả sinh động sinh chủng phân lập từ Neem 67 Phụ lục C.2 Thử nghiệm citrate NT1 NT2 NT4 NT3 NL1 NL2 NL3 ĐC Hình PLC.3 Kết thử nghiệm citrate chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem ĐC HNR HNR HNL1 HNT7 HNT6 HNT3 Hình PLC.4 Kết thử nghiệm citrate chủng vi khuẩn nội sinh từ Hoàn Ngọc 68 Phụ lục C.3 Khả lên men đƣờng glucose NT1 NT3 NT2 NT4 NT5 NL NL3 NL ĐC Hình PLC.5 Khả lên men đường glucose chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem HNT3 HNT6 HNT7 HNL HNR1 HNR2 ĐC Hình PLC.6 Kết lên men đường glucose chủng vi khuẩn nội sinh từ Hoàn Ngọc 69 Phụ lục C.4 Khả lên men đƣờng lactose NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NL1 NL NL3 ĐC Hình PLC.7 Khả lên men đường lactose chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem HNT3 HNT6 HNT7 HNL HNR1 HNR2 ĐC Hình PLC.8 Khả lên men đường lactcose chủng vi khuẩn nội sinh từ Hoàn Ngọc 70 Phụ lục C.5 Khả lên men đƣờng sucrose NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NL1 NL2 ĐC NL3 Hình PLC.9 Khả lên men đường sucrose chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem HNT3 HNT6 HNT7 HNL HNR1 HNR2 ĐC Hình PLC.10 Khả lên men đường sucrose chủng vi khuẩn nội sinh từ Hoàn Ngọc 71 Phụ lục C.6 Test khả chịu 10%NaCl Hình PLC.11 Kết khả chịu 10%NaCl chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem Hình PLC.12 Kết khả chịu 10%NaCl chủng vi khuẩn nội sinh từ Hoàn Ngọc 72 Phụ lục C.7: Khả sinh bào tử Hình PLC.13 Khả sinh bào tử chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Neem Hình PLC.14 Khả sinh bào tử chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Hoàn Ngọc 73 Phụ lục C.8 Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem Hồn Ngọc mơi trƣờng thạch máu NT1 NT3 NL1 NT4 NT2 NT5 HNT3 HNT6 NL3 HNR2 NL2 HNT7 HNR1 HNL Hình PLC.15 Đặc điểm khuẩn l c chủng vi khuẩn nội sinh từ Neem Hồn Ngọc mơi trường th ch máu 74 ... lập khảo sát số đặc tính chủng vi khuẩn nội sinh Hoàn Ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) Neem (Azadirachta indica) Nội dung đề tài: Phân lập, làm giữ chủng vi khuẩn nội sinh từ Hoàn Ngọc Neem. .. Phân lập vi khuẩn nội sinh từ Neem Hoàn Ngọc 34 Bảng 3.2 Các đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh 35 Bảng 3.3 Đặc điểm tế bào tính di động chủng vi khuẩn nội sinh 37 Bảng 3.4 Các đặc. .. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ Neem Hoàn Ngọc 33 3.1.1 Đặc điểm khuẩn l c chủng vi khuẩn nội sinh 34 3.1.2 Đặc điểm tế bào chủng vi khuẩn nội sinh