BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KH&CN VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04.21/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM DÙNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ” (MÃ SỐ: KC.04.21/06-10) Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Cơng nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Trương Nam Hải 8414 Hà Nội – 2010 Bản báo cáo hoàn thành ngày 08/12/2010 Tài liệu chuẩn bị sở kết thực Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC.04.21/06-10 Mọi chép phải đồng ý Viện Công nghệ sinh học BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KH&CN VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04.21/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM DÙNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ” (MÃ SỐ: KC.04.21/06-10) Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài: PGS TS TRƯƠNG NAM HẢI TL Bộ Khoa học Công nghệ Vụ Khoa học Công nghệ ngành KT-KT Giám đốc Văn phòng chương trình Hà Nội - 2010 Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ LỜI MỞ ĐẦU 13 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16 1.1 Cytokine ung thư 16 1.1.1 Cơ chế ung thư 17 1.1.2 Tình hình bệnh ung thư 18 1.1.3 Các phương pháp điều trị bệnh ung thư 20 1.1.4 Liệu pháp điều trị cytokine- trạng tương lai 22 1.2 Interleukin-2 24 1.2.1 Cấu trúc gen IL-2 người 25 1.2.2 Mối quan hệ cấu trúc chức IL-2 người 25 1.2.3 Ứng dụng IL-2 điều trị 28 1.2.3.1 Điều trị ung thư biểu mô tế bào thận u hắc tố ác tính 29 1.2.3.2 Điều trị bệnh nhân nhiễm HIV 31 1.3 Sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp 33 1.3.1 Công nghệ sản xuất giới 34 1.3.2 Sản xuất Việt Nam 35 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu 37 2.1.1 Vật liệu sinh học (chủng vi sinh vật, vector, động vật thí nghiệm) 37 2.1.2 Các loại vật tư, hóa chất sinh phẩm 38 2.1.3 Máy móc thiết bị 40 2.2 Phương pháp nghiên cứu 46 2.2.1 Kỹ thuật PCR 46 2.2.2 Tách dòng gen vecor đầu pJET1/Blunt 46 2.2.3 Phương pháp cắt nối ghép gen vào vector pET22b(+) 47 2.2.4 Phương pháp biến nạp gen vào tế bào E coli 48 2.2.5 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 49 2.2.6 Phương pháp biểu gen il-2 dạng đơn tế bào vi khuẩn E coli 50 2.2.7 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào E coli 50 2.2.8 Phá tế bào E coli xử lý IL-2 thô tiền tinh chế 51 Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10 2.2.9 Phương pháp biểu gen il-2 tế bào P Pastoris 52 2.2.10 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào P pastoris 52 2.2.11 Phương pháp thu hồi bảo quản sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thô sau lên men nấm men P pastoris 53 2.2.12 Phương pháp lọc – cô mẫu – trao đổi đệm qua hệ lọc tiếp tuyến MidJet 53 2.2.13 Phương pháp sắc ký lỏng nhanh hệ thống FPLC 54 2.2.14 Phương pháp tinh chế hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC 55 2.2.15 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE 55 2.2.16 Xác định hàm lượng protein bẵng kỹ thuật phân tích hình ảnh SDS-PAGE phần mềm chuyên dụng Quantity One 57 2.2.17 Kỹ thuật Western blot 58 2.2.18 Phương pháp kiểm tra hoạt tính IL-2 sau tạo cơng thức dòng tế bào đặc hiệu CTLL259 2.2.19 Định lượng độ ẩm tồn dư sản phẩm đông khô [76] 61 2.2.20 Phương pháp xác định tính vơ trùng cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp 62 2.2.21 Phương pháp xác định an toàn chung cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp [76] 64 2.2.22 Thiết kế thí nghiệm để đánh giá chất lượng IL-2 tái tổ hợp dòng tế bào lympho người 64 2.2.23 Tách tế bào lympho máu ngoại vi 65 2.2.24 Thử nghiệm nuôi cấy tăng sinh tế bào lympho 65 2.2.25 Thử nghiệm chế tiết cytokine 66 2.2.26 Hoạt hóa nhân ni dòng tế bào gây ung thư 67 2.2.27 Gây u thực nghiệm cho chuột 68 2.2.28 Tách tế bào từ khối u 68 2.2.29 Làm tiêu mô học 69 2.2.30 Gây u tác động thuốc lên chuột 70 2.2.31 Xác định tăng trọng lượng chuột trình thí nghiệm 71 2.2.32 Xác định tỷ số phát triển tỷ số ức chế u 71 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3.1 Nghiên cứu tạo IL-2 tái tổ hợp quy mơ phòng thí nghiệm 74 3.1.1 Tách dòng gen il-2 tế bào E coli 75 3.1.2 Tạo vector biểu gen pET22-IL2MN 76 3.1.3 Biểu gen il-2 đơn tế bào E coli BL21 77 3.1.4 Kiểm tra lại dòng tế bào E coli sử dụng làm MCB 78 3.1.5 Tối ưu trình tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp dạng thô 80 3.1.5.1 Tối ưu dòng tế bào vi khuẩn E coli 80 3.1.5.2 Tối ưu dòng tế bào nấm men P pastoris 87 3.1.6 Đánh giá so sánh hiệu tổng hợp sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ hai dòng tế bào E coli P pastoris 96 Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10 3.1.6.1 So sánh chất lượng IL-2 hai loại sản phẩm lên men kỹ thuật Western Blot 96 3.1.6.2 So sánh hàm lượng IL-2 sau lên men SDS-PAGE 97 3.1.7 Tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ nguồn lên men dòng tế bào P pastoris 100 3.1.7.1 Xử lý mẫu IL-2 thô tiền tinh chế (từ dòng tế bào P pastoris) 100 3.1.7.2 Tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dòng tế bào P pastoris lần (FPLC) 104 3.1.7.3 Tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dòng tế bào P pastoris lần (HPLC) 105 3.1.8 Tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ nguồn lên men dòng tế bào E coli 108 3.1.8.1 Xử lý mẫu IL-2 thơ tiền tinh chế (từ dòng tế bào E coli) 109 3.1.8.2 Tinh chế IL-2 tái tổ hợp (từ dòng tế bào E coli) 112 3.1.9 So sánh hiệu tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ hai hệ tế bào E coli P pastoris 114 3.1.10 Tạo công thức sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế 118 3.2 Sản xuất thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp điều kiện chuẩn GMP 123 3.2.1 Tiêu chuẩn GMP cho sản xuất thử nghiệm 124 3.2.1.1 Con người 125 3.2.1.2 Hệ thống nhà xưởng 125 3.2.1.3 Quy định hướng (chiều) quy trình, người nguyên vật liệu 128 3.2.1.4 Vệ sinh khu sản xuất - trang thiết bị 132 3.2.2 Sản xuất thử nghiệm 05 loạt sản phẩm 133 3.2.2.1 Hồ sơ (Chi tiết kết xem thêm sản phẩm Hồ sơ sản xuất 05 loạt IL-2 tái tổ hợp) 133 3.2.3 Tiêu chuẩn sở cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp 137 3.2.4 Đánh giá chất lượng an toàn cho sản phẩm sản xuất theo tiêu chuẩn sở (chi tiết sản phẩm dạng II - Hồ sơ kiểm định sản phẩm IL-2 tái tổ hợp) 140 3.2.4.1 Cảm quan 141 3.2.1.2 Độ ẩm tồn dư (Hàm ẩm) 141 3.2.1.3 Độ pH 141 3.2.1.5 Vô khuẩn (vô trùng) 142 3.2.1.6 Nội độc tố vi khuẩn 142 3.2.1.7 Thử nghiệm an tồn chung (độc tính bất thường) 143 3.2.1.8 Độ tinh khiết (độ tinh sạch) 144 3.2.1.9 Đặc hiệu miễn dịch trọng lượng phân tử 145 3.3 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp dòng tế bào động vật động vật thực nghiệm 146 3.3.1 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp dòng tế bào lympho người 147 3.3.1.1 Thay đổi hình thái số lượng tế bào 147 3.3.1.2 Thử nghiệm MTT 149 3.3.1.3 Phương thức đáp ứng tế bào phụ thuộc liều chế phẩm IL-2 150 3.3.1.4 Thay đổi nồng độ cytokine dịch nuôi cấy tế bào kích thích hai chế phẩm IL-2 tái tổ hợp PHA 152 Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10 3.3.2 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp động vật thực nghiệm 155 3.3.2.1 Kết hoạt hóa, nhân ni trì dòng tế bào ung thư 156 3.3.2.2 Kết gây u thực nghiệm cho động vật 158 3.3.2.3 Kết thử hoạt tính ức chế khối u IL-2 VN IL-2 TQ động vật mang khối u thực nghiệm 161 3.4 Kiểm định sản phẩm IL-2 tái tổ hợp theo tiêu chuẩn sở 166 3.4.1 Kiểm định nước 166 3.4.2 Kiểm định Quốc tế 167 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 169 4.1 Kết luận 169 4.2 Kiến nghị 170 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 171 PHỤ LỤC 177 Trình tự nucleotide gen il-2 người trình tự dịch mã amino acid IL-2 sử dụng trình biểu gen 177 So sánh trình tự DNA gen il-2 vector tác dòng với gen il-2 lý thuyết 180 Các sơ đồ vector sử dụng Đề tài 182 Kết kiểm nghiệm nước với sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Đề tài 184 Kết kiểm nghiệm Quốc tế với sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Đề tài 185 Các sáng chế liên quan đến sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Đề tài 190 Kiểm tra trình tự amino acid IL-2 tái tổ hợp 191 7.1 r-IBinleukin-2 (IL-2 tái tổ hợp Đề tài) 191 7.1.1 Phổ khối peptide r-IBinleukin-2 phân tích hệ LC-ESI-ion TRAP 191 7.1.2 Nhận diện protein rBInleukin-2 195 7.2 IL-2 tái tổ hợp Trung Quốc 198 7.2.1 Phổ khối peptide sản phẩm IL2 Trung Quốc phân tích hệ LC-ESI-ion TRAP 198 7.2.2 Nhận diện IL2 thương phẩm Trung Quốc 201 Tính giá thành sản phẩm r-IBinleukin-2 Đề tài theo loạt sản xuất (1000 lọ/loạt) 203 Một số sản phẩm protein tái tổ hợp thương mại hóa mang amino acid Methionine đầu N 206 9.1 Somatrem Product 206 9.2 G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) 206 9.3 IL-2 human 207 Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ 3LL Amp APS BCG BMGY BMMY bp CML CTL ĐCUT DMEM DNA dNTP dOT E coli EDTA ELISA EPO FDA FPLC G-CSF Tế bào ung thư biểu mô phổi Ampicillin Ammonium Persulfate Baccillus Calmette-Gurin Buffered Minimal Glycerol Media Buffered Minimal Methanol Media Base pair Chronic Myeloid Leukaemia Cytolytic T lymphocyte (tế bào lympho T độc) Đối chứng ung thư Dulbecco‘s Modified Eagle Medium Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide triphosphate Dissolved oxygene tensions Escherichia coli Ethylen diamin tetra acid acetic Enzyme-linked immunosorbent assay Erythropoietin Food and Drug Administration Fast Protein Liquid Chromatography Granulocyte-colony stimulating factor (yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt) Growth factors (các nhân tố sinh trưởng) Granulocyte-macrophage colony stimulating factor ( yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt-đại thực bào) Good Manuafacturing Practice (điều kiện thực hành sản xuất tốt) Tỷ số phát triển khối u Human immunodeficiency virus High Performance Liquid Chromatography The International Agenecy for Research on Cancer Interferon Interleukin-2 Thời gian sống thêm Isopropylthio-β-D-galactoside Tỷ số thoái lui Kilobase Kilo Dalton Lymphokine-activated killer (tế bào diệt hoạt hóa lymphokine) Luria and Bertani Lysyl hydroxylase Lysate GFs GM-CSF GMP GR% HIV HPLC IARC IFN IL-2 ILS IPTG IR% Kb kDa LAK LB LH1 LS Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10 MCB MWCB NK OD P pastoris PBS PDGF PMSF PVDF Sar 180 SDS-PAGE TBS TBUT TEMED TNF YNB YPD Master Cell Bank Manufacturer’s Working Cell Bank Natural killer (tế bào diệt tự nhiên) Optical Density Pichia pastoris Phosphate Buffered Saline Platelet-derived growth factor (yếu tố tăng trưởng tiểu huyết cầu) Phenyl Methane Sulphonyl Fluoride Polyvinylidene fluoride Tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180 Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis Tris Buffered Saline Tế bào ung thư Tetramethylethylenediamine Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử ung thư) Yeast Nitrogen Base Yeast Peptone Dextrose Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Thành phần môi trường M9 .38 Bảng 2 Danh sách trang thiết bị sử dụng sản xuất IL-2 tái tổ hợp 41 Bảng 3: Bảng đánh giá hiệu lực H Itokawa .72 Bảng 1: So sánh thơng số q trình tạo sản phẩm IL-2 tinh chế từ hai nguồn E coli P pastoris 117 Bảng 2: Các thông số kiểm tra hoạt tính IL-2 122 Bảng 3 Kết chuẩn bị chủng sản xuất E coli 133 Bảng Kết OD sau nuôi cấy vi khuẩn E coli nồi lên men Marubishi 10L 134 Bảng Kết thu hoạch sinh khối E coli sau lên men .135 Bảng Kết thu sau xử lý protein thô 135 Bảng Kết thu IL-2 sau tinh chế HPLC 136 Bảng 8: Số lượng IL-2 thành phẩm thu sau sản xuất 137 Bảng Kết kiểm tra cảm quan 05 loạt IL-2 141 Bảng 10 Kết đo độ ẩm tồn dư 05 loạt IL-2 thành phẩm 141 Bảng 11 Kết pH 05 loạt IL-2 thành phẩm .141 Bảng 12 Kết kiểm tra hoạt tính sinh học 05 loạt IL-2 thành phẩm 142 Bảng 13 Kết thử nghiệm vô khuẩn 05 loạt IL-2 142 Bảng 14 Kết kiểm tra nội độc tố vi khuẩn .143 Bảng 15 Kết kiểm tra an toàn chung 05 loạt IL-2 144 Bảng 16 Kết kiểm tra độ tinh khiết 05 loạt IL-2 .144 Bảng 17 Tỷ lệ tạo khối u chuột nhắt 158 Bảng 18: Bảng phân lơ lịch trình thí nghiệm mơ hình u báng 161 Bảng 19: Bảng phân lơ lịch trình thí nghiệm mơ hình u rắn da 161 Bảng 20: Bảng phân lơ lịch trình thí nghiệm theo dõi thời gian sống kéo dài thêm chuột 161 Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04.21/06-10 Bảng 21: Tổng hợp kết khảo sát tác dụng IL-2 lên chuột mang u báng Sar .162 Bảng 22 So sánh hiệu lực kháng u rắn 3LL da IL-2 tái tổ hợp 164 Bảng 23 Thời gian sống trung bình (TGSTB) thời gian sống kéo dài thêm (ILS) chuột lơ thí nghiệm 165 M TQ M F4 F13 F14 F15 F16 IL-2 Hình 10: Kiểm tra sản phẩm IL-2 tinh chế qua hệ thống HPLC SDS-PAGE M, Thang protein chuẩn (hãng Fermentas) TQ, sản phẩm IL-2 Trung Quốc F4, F13, F14, F15, F16 phân đoạn thu sản phẩm protein tinh chế Sản phẩm lên men IL-2 tái tổ hợp thô từ E coli (Sinh khối tế bào) Phá tế bào, biến tính protein tổng số Xử lý dịch protein thơ tiền tinh chế Tinh chế hệ HPLC Sản phẩm IL-2 tinh Hình 11: Chiến lược tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ sản phẩm lên men vi khuẩn E coli sản phẩm tinh chế IL-2 kiểm tra kỹ thuật SDS-PAGE M, thang protein chuẩn (Fermentas); -3, sản phẩm IL-2 tinh chế phân đoạn từ 3-5 15 Quá trình tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ nấm men P pastoris thể hình với điểm tinh chế bước tinh chế qua hệ thống tinh chế protein FPLC – Tinh chế lần HPLC – Tinh chế lần Sản phẩm IL-2 kiểm tra hình 10 cho thấy, tạo IL-2 tinh khiết từ dòng tế bào P pastoris Đối với trình tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ sinh khối tế bào E coli, định hướng chiến lược tinh chế IL-2 dạng không tan Kết tinh chế cuối thể hình 11 khẳng định IL-2 tái tổ hợp từ tế bào E coli tinh chế thành công 3.1.6 So sánh hiệu tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ hai hệ tế bào E coli P pastoris Sau tinh chế thành công, 02 loại sản phẩm IL-2 tinh khiết: IL-2E (IL-2 tinh chế từ nguồn tế bào E coli) IL-2P (IL-2 tinh chế từ nguồn tế bào P pastoris) kiểm tra độ tinh khiết định lượng sản phẩm Thêm vào q trình tiến hành so sánh hiệu tạo sản phẩm theo giai đoạn khác Hướng nghiên cứu lựa để sản xuất quy mô lớn xác định dựa tổng hợp so sánh hiệu suất qua giai đoạn Để so sánh hiệu suất tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ hai nguồn khác nhau, bên cạnh lượng sản phẩm thu từ trình tinh chế cần phải so sánh giai đoạn tạo sản phẩm thông số trình lên men, trình xử lý mẫu trước tinh chế, trình tinh chế Sau bảng so sánh giá trị Bảng 1: So sánh thơng số q trình tạo sản phẩm IL-2 tinh chế từ hai nguồn E coli P pastoris Stt Tiêu chuẩn Escherichia coli Pichia pastoris Thời gian lên men 15 60 Hiệu suất tạo sản phẩm thô sau lên men 1,65 g/ L 0,35 g/ L Dạng sản phẩm protein Dạng không tan nội bào Dạng tan môi trường Kiểu tinh chế protein Biến tính Dạng tự nhiên Xử lý trước tinh chế Biến tính Guanidine 7M Lọc tiếp tuyến Tinh chế lần qua FPLC Khơng Có Tinh chế qua HPLC Có Có 16 Hiệu suất tạo sản phẩm từ sản phẩm lên men 10,07% 10,7% Lượng sản phẩm sau lần tinh chế 1,75 mg/lần 0,15 mg/lần Qua phép so sánh trên, Đề tài định lựa chọn hướng để sản xuất sản phẩm IL-2 hướng thao tác với hệ vi khuẩn E coli Nếu có điều kiện, hướng nâng cạo hiệu tạo sản phẩm hệ nấm men tiếp tục tối ưu giai đoạn 3.1.7 Kiểm tra hoạt tính IL-2 tạo phòng thí nghiệm Sản phẩm IL-2 tinh khiết, sau tạo công thức đông khô tiếp kiểm tra hoạt tính dòng tế bao CTLL-2 Kết kiểm tra thể bảng Bảng 2: Các thơng số kiểm tra hoạt tính IL-2 Mẫu IL-2 VN IL-2 TQ % Hoạt hóa tế bào CTLL2 90 µg/ml µg/ml 4.5 µg/ml 2.25 µg/ml 1.125 µg/ml 130.0434 114.4252 83.5141 41.54013 5.748373 141.6486 120.6074 98.9154 52.49458 ED50 (µg/ml) Units/mg 12.8 8.06 x 105 1.04 9.62 x 106 0.5625 µg/ml 9.978308 Ghi chú: IL-2 VN sản phẩm IL-2 Đề tài, IL-2 TQ sản phẩm IL-2 thương mại Trung Quốc Kết kiểm tra hoạt tính cho thấy, hoạt tính sinh học IL-2 Trung Quốc đạt đến 9.62 triệu IU mg IL-2 Giá trị tương ứng với lượng IL-2 xác xác định tương ứng với thông số công bố Sản phẩm IL-2 Đề tài tạo Phòng thí nghiệm thể hoạt tính sinh học đặc hiệu IL-2 hiệu thấp, khoảng triệu IU mg IL-2, khoảng 10 lần so với sản phẩm IL-2 thương mại Trung Quốc Lý giải cho điều này, cho rằng, sản phẩm IL-2 tạo Đề tài quy mơ phòng thí nghiệm có số bất lợi sau: Chưa sản xuất điều kiện tiêu chuẩn GMP nên chất lượng IL-2 chưa thực đảm bảo Sản phẩm sản xuất điều kiện chuẩn GMP sau gửi kiểm định Quốc tế để xác định xác hoạt tính sinh học riêng sản phẩm IL-2 Đề tài Chưa thể phân nhỏ sản phẩm IL-2 theo liều để bảo quản điều kiện áp suất âm, khô trơ Điều làm giảm chất lượng sản qua lần thao tác 17 Mặc dù vậy, với kết đạt ban đầu, Đề tài thành công việc tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp định hướng dạng thương phẩm quy mô phòng thí nghiệm 3.2 Sản xuất thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp điều kiện chuẩn GMP 3.2.1 Sản xuất sản phẩm IL-2 thành phẩm Sau hoàn thiện quy trình tạo IL-2 tái tổ hợp phòng thí nghiệm, quy trình triển khai sang phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP Công ty Vắc xin sinh phẩm số Quy trình sản xuất minh họa Hình 12 Sản phẩm sản xuất cuối sản phẩm IL-2 thành phẩm, đóng lọ, dán nhãn (hình 13) CHUẨN BỊ CHỦNG PHÁ TẾ BÀO VI KHUẨN XỬ LÝ PROTEIN THÔ LÊN MEN TINH CHẾ BẰNG HPLC BỔ SUNG DINH DƯỠNG, CHẤT CẢM ỨNG IPTG PHA BTPCC IL-2 LÊN MEN ĐĨNG LỌ - ĐƠNG KHƠ TẠO INTERLEUKIN-2 THƠ DÁN NHÃN - ĐĨNG HỘP LY TÂM THU TẾ BÀO Hình 12: Sơ đồ quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp thành phẩm Công ty Vắcxin sinh phẩm số Hình 13: Các lọ Interleukin-2 tái tổ hợp thành phẩm 18 3.2.2 Tiêu chuẩn sở cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Đối với sản phẩm sử dụng dược phẩm, để ứng dụng vào thực tế, bắt buộc dược phẩm phải đạt tiêu chuẩn với tiêu liên đến an toàn chất lượng Ngoài việc tự kiểm định quan sản xuất, dược phẩm phải quan có thẩm quyền kiểm định Các tiêu để kiểm định dược phẩm phải nêu bảng tiêu chuẩn sở Ngoài ra, để tiện lợi cho việc phát triển thương mại sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Đề tài sau này, đặt tên cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thành phẩm rIBinleukin-2 Tiêu chuẩn sở cho sản phẩm r-IBinleukin-2 sau (xem chi tiết Công bố tiêu chuẩn sản phẩm Viện Công nghệ sinh học, số 01/2010 có hiệu lực từ ngày 04/10/2010): Yêu cầu kỹ thuật: 1.1 Các tiêu cảm quan: 1.2 Hàm ẩm: 1.3 Độ pH: 1.4 Hoạt tính sinh học 1.5 Vô trùng 1.6 Nội độc tố vi khuẩn 1.7 Độc tính bất thường (an tồn chung) 1.8 Độ tinh 1.9 Đặc hiệu miễn dịch trọng lượng phân tử 3.2.3 Đánh giá chất lượng an toàn cho sản phẩm sản xuất theo tiêu chuẩn sở Trong sản xuất, yêu cầu đặt cho sản phẩm thành phẩm phải đạt yêu cầu tiêu chuẩn cho phép Đối với sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thành phẩm phải đạt tiêu chuẩn sơ đề Kết đánh giá chất lượng theo tiêu chuẩn sở cho thấy, 05 loạt sản phẩm IL-2 thành phẩm đạt tiêu chuẩn cho phép Như vậy, nhằm mục đích sản xuất thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp điều kiện chuẩn GMP, Công ty Vắc xin sinh phẩm số hoàn thành nội dung cơng việc sau: 19 • Xây dựng hệ thống hồ sơ sản xuất Interleukin-2: quy trình chuẩn, nhật ký sản xuất, nhật ký kiểm định • Sản xuất 05 loạt IL-2 theo quy trình xây dựng điều kiện GMP Các loạt đạt tiêu chuẩn chấp thuận có tính ổn định, tương đương • Kiểm tra 05 loạt IL-2 thành phẩm đạt tiêu chuẩn sở theo công bố tiêu chuẩn sản phẩm số 01/2010 Viện Công nghệ Sinh học dành cho sinh phẩm y tế r-IBleukin-2 3.3 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp dòng tế bào động vật động vật thực nghiệm Sản phẩm IL-2 thành phẩm sau sản xuất từ Công ty Vắc xin sinh phẩm số tiếp tục thử nghiệm tiền lâm sàng dòng tế bào người động vật gây ung thư thực nghiệm Quá trình đánh giá sử dụng IL-2 thương phẩm Trung Quốc làm đối chứng dương để so sánh hiệu tác động 3.3.1 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp dòng tế bào lympho người Để đánh giá hoạt động hoạt hoá tăng sinh tế bào dùng phương pháp đánh giá hình thái hoạt động chuyển hố tế bào Trong số thử nghiệm in vitro, thử nghiệm chuyển hoá chất mầu MTT [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, tetrazole] thường áp dụng rộng rãi Thử nghiệm MTT thường sử dụng ưu điểm đơn giản, phân biệt tế bào sống với tế bào chết, tế bào tăng sinh hay chưa tăng sinh, chưa tăng sinh có hoạt hố với khơng hoạt hố (hình 14) Hình 14: Hoạt tính gây đổi mầu chất MTT 20 IL-2 cytokine có tác dụng hoạt hoá đầu nguồn tế bào khác Liệu IL-2 tái tổ hợp có tác dụng lên tế bào lympho nuôi cấy sinh thêm IL-2 hay không tác dụng IL-2 (cả IL-2 tái tổ hợp IL-2 thứ cấp tế bào lympho tiết ra) tế bào ni cấy có sản sinh cytokine khác q trình hoạt hố tăng sinh chúng hay không? Để trả lời câu hỏi đề tài tiến hành định lượng cytokine dịch nuôi cấy tế bào theo thời gian sau kích thích IL2 tái tổ hợp (hình 15) Hình 15: Nồng độ cytokine dịch nuôi cấy tế bào (n = 8) 21 Kết cuối minh họa hình 14 15 cho thấy, IL-2 tái tổ hợp sản xuất Việt Nam Trung Quốc có tác dụng kích thích hoạt hố tăng sinh tế bào lympho người in vitro Ngoài ra, tác động kích thích IL-2 tái tổ hợp, tế bào hoạt hoá tiết thêm IL-2 cytokine thứ cấp khác TNF-α, IFN-γ, IL-10 IL-13 Tác động tăng cytokine IL-2, TNF-α IFN-γ tế bào lympho Th1, chứng tỏ IL-2 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học tương tự IL-2 tự nhiên Hoạt tính IL-2 Việt Nam sản xuất pg/IU IL-2 Trung Quốc sản xuất 4,4 pg/IU 3.3.2 Đánh giá thử nghiệm sản phẩm IL-2 tái tổ hợp động vật thực nghiệm Trong trình thử nghiệm đặc tính sinh phẩm, ngồi với việc đánh giá dòng tế bào, q trình đánh giá thử nghiệm với sản phẩm IL-2 tiến hành mơ hình động vật thực nghiệm Quá trình đánh giá tiến hành môn Tế bào, Mô phôi Lý sinh, Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội Nội dung việc đánh giá nhiệm vụ tạo mơ hình khối u thực nghiệm chuột để thử tác dụng đánh giá hiệu lực kháng u IL-2 sản xuất Việt nam (IL-2VN) có so sánh với IL-2 thương phẩm (IL-2TQ) Hai loại khối ung thử nghiệm ung thư mô liên kết sarcroma 180 (u báng Sar 180) ung thư biểu mô phổi (u rắn 3LL) Tác dụng kháng u báng sarcoma 180 IL-2 tái tổ hợp Kết đánh giá u báng Sar 180 cho thấy IL-2VN có tác dụng ức chế u cao, đạt 61.16%, so với đối chứng ung thư không điều trị (0%) Chế phẩm IL-2 thương phẩm có xuất xứ Trung quốc có tác dụng ức chế u, đạt 51.77%, thấp IL-2 VN Tỷ số phát triển (GR%) tỷ số ức chế u (IR%) minh họa hình 16 Theo thang đánh giá hiệu lực kháng u H Itokawa cho thấy IL-2VN có hiệu lực ++ (hai cộng), mạnh so với IL-2TQ - đạt + (một cộng) Tuy nhiên sai khác khơng có ý nghĩa thống kê, với độ tin cậy 95% 22 Hình 16: Biểu đồ tỷ số phát triển ức chế u lơ thí nghiệm Tác dụng kháng u rắn da 3LL IL-2 tái tổ hợp 45 chuột cấy ghép với tế bào ung thư 3LL để gây u rắn da chia làm lô, lô 15 ngày sau cấy ghép, cá thể lô ĐCUT bị chết nên lơ ĐCUT lại 14con, lơ: UT+IL-2VN UT+IL-2TQ lơ lại 15 Kết kiểm tra tác dụng kháng u rắn thể hình 17 Một cách trực quan, để dễ dàng thấy hiệu lực ức chế u rắn da IL-2 tái tổ hợp, chúng tơi lấy phần diện tích bơi màu xanh hình 16 để thể số lượng cá thể tiêu giảm u so sánh lô Kết trực quan so sánh hiệu lực lơ xếp sau: ĐCUT < IL-2TQ < IL-2VN Kết theo dõi thời gian sống kéo dài thêm chuột mang u báng tác dụng IL-2 tái tổ hợp Kết chuột lơ đối chứng ung thư có thời gian sống trung bình 19,9 ngày, khơng sai khác với kết nghiên cứu trước (có giá trị 20,5 ngày) Dưới tác dụng IL-2VN IL-2TQ thời gian sống trung bình chuột mang u kéo dài thêm 20,6 29,1 % cách tương ứng Tuy nhiên theo dõi đến đến ngày thứ 30 sau cấy truyền u thấy chuột lô điều trị IL-2 TQ chết 100%, lơ điều trị IL-2VN tính đến ngày thứ 33 13,3% chuột thí nghiệm sống sót (xem hình 18) 23 Hình 17: So sánh hiệu lực kháng u rắn 3LL da IL-2 tái tổ hợp 24 Hình 18: Đồ thị tỷ lệ chuột sống sót lơ 33 ngày tiến hành thí nghiệm 3.4 Kiểm định sản phẩm IL-2 tái tổ hợp theo tiêu chuẩn sở Như đề cập thuyết minh Đề tài, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thành phẩm sau kiểm định, kiểm tra thử nghiệm quan sản xuất kiểm định Cơ quan độc lập khác Việc kiểm định tiến hành Cơ quan kiểm định nước Quốc tế theo tiêu chuẩn sở đặt Cơ quan chủ trì Đề tài 3.4.1 Kiểm định nước Cơ quan độc lập kiểm định nước cho sản phẩm IL-2 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương (48 – Hai Bà Trưng, Hà Nội) Trong trình thực kiểm định nước, yêu cầu kiểm định theo 09 tiêu nêu Tiêu chuẩn sở Tuy nhiên, điều kiện chưa cho phép, Viện Kiểm định thuốc Trung Ương kiểm định 06/09 tiêu chí đề Các tiêu chí là: • Tính chất (chỉ tiêu cảm quan) • Hàm ẩm • Độ pH • Độ vơ khuẩn • Nội độc tố vi khuẩn • Độc tính bất thường 25 Các tiêu quan trọng khác như: Độ tinh sạch, hoạt tính sinh học Đặc hiệu miễn dịch trọng lượng phân tử chưa kiểm định Tuy nhiên, tiêu tiếp tục kiểm nghiệm Cơ quan Quốc tế Trong kết kiểm định nước, hầu hết tiêu chuẩn kiểm định đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn sở Chỉ có tiêu chuẩn độ pH chưa đạt tiêu chuẩn sở pH khoảng (3-3.8) Trong kết kiểm định, tiêu xác định 2.9 Mặc dù vậy, sai khác nhỏ không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thành phẩm 3.4.2 Kiểm định Quốc tế Song song với việc kiểm định nước, Đề tài tiến hành gửi mẫu để kiểm định Quốc tế Công ty BioVision (Hoa Kỳ) Các tiêu kiểm định bao gồm: - Độ tinh khiết - Đặc hiệu miễn dịch trọng lượng phân tử - Vô trùng - Nội độc tố vi khuẩn - Hoạt tính sinh học Các tiêu đạt yêu cầu đề Tiêu chuẩn sở Vì vậy, Đề tài khẳng định sản xuất thành công IL-2 tái tổ hợp thành phẩm đạt đủ tiêu chuẩn an toàn chất lượng đề Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận Sau năm thực dựa số liệu nhận được, Đề tài đạt kết sau: 1) Đã tạo 02 chủng vi sinh vật E coli P pastoris có khả biểu IL-2 người tái tổ hợp dạng đơn Chủng vi khuẩn E coli biểu IL-2 dạng không tan (thể vùi), chủng P pastoris biểu IL-2 dạng tan, có hoạt tính Trên sở tối ưu việc tạo sản phẩm IL-2 thơ qua q trình lên men Hiệu tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp dạng thô sau lên men 1,65 g/ L (E coli) 0,35 g/ L (P pastoris) 26 2) Đã tinh chế sản phẩm IL-2 tái tổ hợp từ hai nguồn tế bào E coli P pastoris, qua lựa chọn dòng tế bào E coli để thiết lập quy trình chuẩn tạo sản phẩm IL-2 tái tổ hợp quy mơ phòng thí nghiệm 3) Đã triển khai sản xuất 05 loạt sản phẩm IL-2 tái tổ hợp thành phẩm từ MWCB điều kiện sản xuất thử nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP 4) Đã xây dựng quy trình chuẩn để kiểm tra chất lượng an tồn cho sản phẩm IL-2 Các quy trình sở cho bảng tiêu chuẩn sở gồm 09 tiêu an toàn chất lượng cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Đề tài 5) Đánh giá thử nghiệm hiệu sản phẩm dòng tế bào lympho người động vật gây ung thư thực nghiệm Về bản, hiệu tác động sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Đề tài IL-2 thương phẩm Trung Quốc tương đương 6) Đã kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn sở sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Đề tài nước Quốc tế Các tiêu quan trọng cho chất lượng an toàn sản phẩm IL-2 tái tổ hợp đạt yêu cầu đặt 4.2 Kiến nghị Để tiếp tục hoàn thiện phát triển cho sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sản phẩm thương mại sử dụng điều trị, Đề tài có số kiến nghị sau: 1) Đề nghị hỗ trợ để chuyển tiếp từ giai đoạn Đề tài nghiên cứu sang Dự án thử nghiệm Vì sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sản phẩm ứng dụng điều trị người nên thời gian tiến hành dự án (nếu được) phải kéo hài (ít năm) 2) Tiếp tục đầu tư để nghiên cứu hồn thiện q trình tạo sản phẩm IL-2 thành phẩm dựa dòng tế bào nhân chuẩn P pastoris Đây sở tạo sản phẩm khơng IL-2 mà nhiều sản phẩm có chất protein tái tổ hợp có ý nghĩa khác 27 Tài liệu tham khảo (Định dạng trích dẫn tài liệu tham khảo thực theo tiêu chuẩn Quốc tế với kiểu IEEE qua phần mềm mã nguồn mở Zotero, chế độ tự động) [1] W E Paul, Fundamental immunology Lippincott Williams & Wilkins, 2008 [2] A A Gaspari and S K Tyring, Eds., Clinical and Basic Immunodermatology London: Springer London, 2008 [3] A Maizel, C Sahasrabuddhe, S Mehta, J Morgan, L Lachman, and R Ford, “Biochemical separation of a human B cell mitogenic factor,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol 79, no 19, pp 59986002, Oct 1982 [4] F Granucci et al., “A contribution of mouse dendritic cell-derived IL-2 for NK cell activation,” The Journal of Experimental Medicine, vol 200, no 3, pp 287-295, Aug 2004 [5] Nguyễn Ngọc Lanh et al., Miễn dịch học, 2nd ed Nhà xuất Y học, 2003 [6] K S Titov et al., “Use of recombinant interleukin-2 for intrapleural therapy of tumorassociated pleurisy,” Bulletin of Experimental Biology and Medicine, vol 148, no 5, pp 794-796, Nov 2009 [7] H Kanayama, “Molecular targeted therapy for advanced renal cell carcinoma,” Gan to Kagaku Ryoho Cancer & Chemotherapy, vol 37, no 7, pp 1208-1213, Jul 2010 [8] S Meraviglia et al., “In vivo manipulation of Vgamma9Vdelta2 T cells with zoledronate and low-dose interleukin-2 for immunotherapy of advanced breast cancer patients,” Clinical and Experimental Immunology, vol 161, no 2, pp 290-297, Aug 2010 [9] M Safar and R P Junghans, “Interleukin maintains biologic stability and sterility over prolonged time,” Immunopharmacology, vol 49, no 3, pp 419-423, Sep 2000 [10] M Sneller, “Consensus symposium on combined antiviral therapy; Overview of interferon and IL-2 combinations for the treatment of HIV infection,” Antiviral Research, vol 29, no 1, pp 105-109, 1996 [11] Y Levy et al., “Enhanced T cell recovery in HIV-1–infected adults through IL-7 treatment,” The Journal of Clinical Investigation, vol 119, no 4, pp 997-1007, Apr 2009 [12] “Sử dụng protein đánh bật HIV khỏi nơi ẩn nấp.” [Online] Available: http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Su-dung-protein-danh-bat-HIV-khoi-noi-annap/20362219/195/ [Accessed: 18-Nov-2010] [13] A Leone, L J Picker, and D L Sodora, “IL-2, IL-7 and IL-15 as immuno-modulators during SIV/HIV vaccination and treatment,” Current HIV Research, vol 7, no 1, pp 8390, Jan 2009 [14] K Koths, J Thomson, M Kunitani, K Wilson, and W Hanisch, “Compositions containing reduced, microbially produced interleukin-2 (IL-2),” U.S Patent 561418525Mar-1997 [15] D Lando, P Riberon, and P Y Abecassis, “Administration of non-glycosylated, recombinant human IL2 in reduced form,” U.S Patent 587407623-Feb-1999 [16] N Katre, R F Halenbeck, R J Goodson, P C McCabe, and M J Knauf, “Interleukin- 28 [17] [18] [19] [20] [21] [22] muteins and polymer conjugation thereof,” U.S Patent 520634427-Apr-1993 E A Grimm and K Heaton, “Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy,” U.S Patent 522910920-Jul-1993 M E Anderson, “Method for administering interleukin-2,” U.S Patent 483268623May-1989 Z Shaked, T Stewart, J W Thomson, and P Hirtzer, “Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation ,” U.S Patent 503764406-Aug-1991 U Schwulera, “Stabilized interleukin-2,” U.S Patent 490446727-Feb-1990 B Manegier and B Voncken, “Stabilized non-glycosylated recombinant human IL2 in reduced form compositions,” U.S Patent 534057423-Aug-1994 “Recombinant Human Interleukin-2 rHuIL-2.” [Online] Available: http://www.cytoshop.com/products/cytokines/rHuIL-2.aspx [Accessed: 18-Nov-2010] 29 ... trùng cho sản phẩm IL -2 tái tổ hợp 62 2 .2. 21 Phương pháp xác định an toàn chung cho sản phẩm IL -2 tái tổ hợp [76] 64 2. 2 .22 Thiết kế thí nghiệm để đánh giá chất lượng IL -2 tái tổ hợp dòng... giá hiệu lực Interleukin- 2 tái tổ hợp sản xuất Việt Nam dùng hỗ trợ điều trị ung thư tiến hành với mục đích tạo sản phẩm IL -2 tái tổ hợp đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho sinh phẩm sử dụng điều trị Cụ... hóa quy trình sản xuất IL -2 tái tổ hợp 3) Đánh giá hiệu lực sản phẩm Interleukin- 2 15 Báo cáo tổng hợp: Đề tài KC.04 .21 /06-10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cytokine ung thư Trong hệ miễn dịch