BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHAN THỊ QUYÊN Khóa học 2007 – 2011 : Tháng 07/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS NGUYỄN TẤT TOÀN PHAN THỊ QUYÊN Tháng 07 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, môn Công Nghệ Sinh Học, Bệnh Viện Thú Y - Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM cho phép tạo điều kiện, giúp đỡ chúng tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Nguyễn Tất Toàn TS Nguyễn Thị Phước Ninh tận tình hướng dẫn, bảo giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập Xin chân thành cảm ơn đến thầy tận tình bảo truyền lại kiến thức, kinh nghiệm q báu giúp tơi có hiểu biết ngày hơm Để hồn thành khóa luận này, tơi nhận nhiều giúp đỡ, cổ vũ động viên bạn bè anh chị Bệnh Viện Thú Y, Đại Học Nông Lâm TP HCM Đồng thời, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình tơi, người ln âm thầm theo dõi động viên, giúp tơi hoàn thành tốt năm đại học Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Xin trân trọng cảm ơn! i TÓM TẮT Phân lập vi khuẩn E coli từ 35 mẫu túi khí thu thập từ gà bệnh với bệnh tích khác tỉnh Bình Dương cho kết dương tính với E coli 22/34 (62,86%) Tiến hành kiểm tra tính mẫn cảm 22 gốc E coli phân lập với 13 loại kháng sinh cho thấy, đa số gốc vi khuẩn đề kháng với ampicillin (81,82%), amoxicillin (77,27%), tetracycline (81,82%) trimethoprim/sulphamethoxazone (72,73%) Các gốc E coli phân lập nhạy cảm với norfloxacine, tobramycin, neomycin gentamicin với tỉ lệ 59,09 – 95,45% Thử nghiệm độc lực 22 gốc vi khuẩn E coli phân lập từ gà bệnh phôi trứng gà 12 ngày tuổi, cho tỉ lệ chết phôi trứng dao động khoảng – 72% Trong đó, có 9/22 gốc cho tỉ lệ chết phôi mức độc lực cao (> 29%), 12/22 mẫu độc lực trung bình (10 – 29%), 1/22 mẫu không gây chết phôi Tiến hành chọn 12 gốc E coli phân lập có độc lực từ kết tiêm phôi trứng để tiến hành kiểm tra độc lực gà ngày tuổi Kết có 7/12 gốc E coli thử nghiệm gây chết gà với tỉ lệ dao động 30 - 100% Trong gốc gây chết 100% gà 5/12 gốc E coli không gây chết gà ngày thí nghiệm Triệu chứng bệnh E coli xuất lơ có gà chết Tuy nhiên, bệnh tích xuất lơ khơng gây chết gà con, điểm tổn thương thấp so với lơ có tỉ lệ chết gà lớn Kết kiểm tra gene liên quan đến độc lực E coli gây bệnh gia cầm fimC iucD 21 gốc có độc lực PCR cho thấy đa số gốc vi khuẩn mang gene FimC phát với tỉ lệ 100% iucD 90,91% ii SUMMARY Thesis title: “Isolation, Antimicrobial susceptibility pattern and determined virulence of avian Escherichia coli pathogenic in Binh Duong provine” Isolated E coli from 35 air sac samples were collected from the diseased chickens with different diseases in Binh Duong, produces positive for E coli is 22/34 (62.86%) Proceed to test the sensitivity of 22 E coli isolates with 13 antibiotics showed that the majority of E coli resistant to ampicillin (81.82%), amoxicillin (77.27%), tetracycline (81.82%) and trimethoprim/sulphamethoxazone (72.73%) The E coli isolates is only sensitive to norfloxacine, tobramycin, neomycin and gentamicin 59.0995.45% Experimental virulence of 22 E coli isolates from disease chickens on 12-dayold chicken eggs, mortality rate of them were isolated from to 72% There were 9/22 model for embryonic mortality in the highly virulent (>29%), 12/22 in moderate virulent (10 - 29%), and 1/22 sample did not kill embryos Twelve E coli isolates strains were picked out from the result of pathogenic in 12 day–old embryos to inject into day – old chicks The result of the pathogenicity in one-old-day chicks indicated that only 5/12 samples were recorded in 90 to 100% mortality, while 2/12 samples were in 30 - 40% motality and 5/12 samples were not pathogenic for one-old-day chicks during the experiment Symptoms of E coli disease only appear in the plots have dead-chickens However, the lesions still appeared on the non-lethal plots, but the lession scores is lower than in the strains had dead-chickens are great In this study, the presence of the virulence – associated genes in avian pathogenic Escherichia coli was determined using PCR on 21 virulent samples Most of the E coli isolates harbored two these genes FimC gene was detected in 100% and iucD in 90,91% iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu – nội dung thực .2 1.2.1 Yêu cầu .2 1.2.2 Nội dung thực .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 E coli gây bệnh gia cầm .3 2.1.1 Lịch sử 2.1.2 Dịch tễ học 2.1.2.1 Đặc điểm hình thái E coli 2.1.2.2 Động vật cảm thụ .3 2.1.2.2 Chất chứa bệnh 2.1.2.3 Phương thức truyền lây 2.1.2.4 Triệu chứng bệnh 2.1.2.5 Các đặc điểm E coli gây bệnh gia cầm 2.1.2.3 Chẩn đoán bệnh 2.1.2.4 Phòng ngừa điều trị 2.2 Thử độc lực trứng gà có phơi 2.3 Động vật thí nghiệm 2.4 Kĩ thuật PCR 10 2.4.1 Nguyên tắc 10 2.4.2 Các giai đoạn phản ứng PCR .10 iv 2.4.3 Thành phần phản ứng .10 2.4.4 Kiểm tra kết PCR .11 2.5 Nghiên cứu có liên quan 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 3.1.1 Thời gian 13 3.1.2 Địa điểm 13 3.2 Đối tượng số lượng mẫu 13 3.3 Nội dung nghiên cứu 13 3.4 Phương pháp nghiên cứu 13 3.4.1 Phân lập vi khuẩn E coli từ gà bị bệnh 14 3.4.1.1 Mục đích 14 3.4.1.3 Phương pháp tiến hành .15 3.4.2 Kiểm tra kháng sinh đồ gốc E coli phân lập 16 3.4.2.1 Mục đích 16 3.4.2.2 Dụng cụ hóa chất 16 3.4.2.3 Phương pháp thực .17 3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi .17 3.4.3 Thử nghiệm độc lực gốc E coli phôi trứng gà gà thí nghiệm 18 3.4.3.1 Mục đích 18 3.4.3.2 Thử nghiệm độc lực gốc E coli phân lập phôi trứng gà 18 3.4.3.3 Thử nghiệm độc lực gốc E coli phân lập gà thí nghiệm 20 3.4.3.4 Xử lý số liệu .24 3.4.4 Phát số gene độc lực gốc E coli kĩ thuật PCR 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết phân lập vi khuẩn E coli gà bệnh 26 4.2 Kết kháng sinh đồ gốc E coli phân lập 27 4.3 Kết thử nghiệm độc lực gốc E coli phôi gà gà thí nghiệm .29 4.3.1 Kết thử nghiệm độc lực gốc E coli phôi trứng gà .29 4.3.2 Kết thử nghiệm độc lực gốc E coli phân lập gà thí nghiệm .30 4.3.2.1 Tỉ lệ gà chết sau tiêm huyễn dịch vi khuẩn 30 4.3.2.2 Triệu chứng lâm sàng gà thí nghiệm 31 v 4.3.2.3 Bệnh tích đại thể .32 4.4 Kết kiểm tra số gene độc lực vi khuẩn E coli .33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị .35 TÀI LIỆU THAM KHẢO .36 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APEC : Avian pathogenic Escherichia coli BA : Blood agar BHI : Brain heart infusion CFU : Colony – forming units ctv : Cộng tác viên CRD : Chronic Respiratory Disease DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate EMB : Eosin methyl blue EAST - : E coli heat-stable enterotoxin-1 IMViC : Indol, Methyl red, Voges – Proskauer, Citrate KIA : Kligle iron agar NA : Nutrient agar LH : Heat – Labile toxins ST : Heat – Stable toxins SHS : Swollen Head Syndrome Stx2f : Shiga Toxin Variant TAE : Tris – acetate EDTA TBE : Tris – borate EDTA TSH : Temperature – sensitive hemagglutinin PCR : Polymerase chain reaction vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các yếu tố độc lực E coli gây bệnh gia cầm Bảng 3.1 Thu thập mẫu từ gà bệnh tỉnh Bình Dương 15 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm tiêm E coli vào trứng gà có phơi .18 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm gà ngày tuổi 21 Bảng 3.4 Điểm thương tổn quan gà nhiễm E coli .22 Bảng 3.5 Điểm triệu chứng gà bị nhiễm E coli .23 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 3.7 Trình tự primer sử dụng phản ứng PCR .25 Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 4.1 Kết phân lập vi khuẩn E coli 26 Bảng 4.2 Kết kháng sinh đồ gốc vi khuẩn E coli phân lập 27 Bảng 4.3 Kết tỉ lệ phôi trứng chết sau ngày theo dõi 29 Bảng 4.4 Tỉ lệ chết gà thí nghiệm sau ngày theo dõi 30 Bảng 4.5 Điểm triệu chứng trung bình lơ gà thí nghiệm 31 Bảng 4.6 Điểm bệnh tích trung bình số gan sau ngày 33 Bảng 4.7 Tỉ lệ phát gene độc lực 33 viii Hình 4.3 Gà có triệu chứng nhiễm E coli Gà xù lông, mắt nhắm, chân đứng không vững 4.3.2.3 Bệnh tích đại thể Các tổn thương quan đặc trưng bị nhiễm E coli gây bệnh túi khí dày đục, viêm phổi, viêm màng ngồi tim, viêm quanh gan, lách sưng Những gà chết trước 48 giờ, bệnh tích xuất thường xuyên lách, gan tim (màng bao tim tích dịch) Bệnh tích phổi ghi nhận gốc có tỉ lệ gà chết thấp không gây chết với điểm tổn thương 1-2 Hình 4.4 Bệnh tích đại thể gà thí nghiệm (1) màng bao tim dày; (2) viêm màng quanh gan; (3) túi khí dày 32 Bảng 4.6 Điểm bệnh tích trung bình số gan sau ngày Gốc E coli Điểm trung bình (n=12) Rất độc (n=9) Túi khí Gan Tim Phổi Lách 0,09± 0,09 1,12 ±0,19 0,94 ±0,86 0,53 ±0,38 0,91 ±0,15 Độc trung bình (n=3) 0,1 ± 0,0 1,17± 0,15 1,2 ± 0,78 0,27 ±0,29 0,93 ±0,12 Bảng 4.6 cho thấy, Ở gốc độc lực cao, gan quan có điểm bệnh tích trung bình cao (1,12 điểm) với dấu hiệu bệnh tích viêm gan, viêm màng quanh gan Tim lách hai quan có điểm bệnh tích trung bình cao thứ hai Ở gốc độc lực trung bình, gan, tim lách quan có điểm bệnh tích trung bình cao Trong đó, tim quan có điểm bệnh tích trung bình cao (1,2 điểm) Giống với kết ghi nhận gốc độc lực cao, túi khí phổi hai quan bị tổn thương E coli gây Kết thử nghiệm độc lực gốc E coli phân lập từ thực địa gà cần thử nghiệm lặp lại để có kết xác khả gây bệnh hai nhóm độc lực 4.4 Kết kiểm tra số gene độc lực vi khuẩn E coli Kết phát gene liên quan đến độc lực vi khuẩn E coli gây bệnh gia cầm fimC iucD gốc E coli phân lập thể bảng 4.7 Bảng 4.7 Tỉ lệ phát gene độc lực Số gốc E coli (n=21) Rất độc (n=9) Độc trung bình (n=12) Tỉ lệ dương tính với gene độc lực fimC iucD Số lượng Tỉ lệ (%) Số lượng Tỉ lệ (%) 100 88,89 12 100 11 91,97 Kết kiểm tra diện gene liên quan đến yếu tố độc lực fimC iucD 22 gốc vi khuẩn E coli phân lập từ thực địa cho kết cao Trong đó, tỉ lệ phát gene fimC tổng số 21 gốc độc phôi trứng 100% 33 cao iucD 90,91% Tỉ lệ phát gene iucD gốc có độc lực cao trứng 88,89%, gốc có độc lực trung bình 91,97% Theo kết nghiên cứu Won ctv (2009), có 112/118 mẫu E coli phân lập từ gà bệnh E coli có gene fimC (95%) iucD 47,5% Janben ctv (2001), cho kết tỉ lệ phát gene fimC 92,7% iucD 88,7% So sánh kết bảng 4.7 với kết nghiên cứu trên, kết phát gene fimC iucD nghiên cứu cao nhiều Tuy nhiên hạn chế nghiên cứu khơng có vi khuẩn đối chứng dương Vì vậy, nghiên cứu dùng thang chuẩn để so sánh kích thước band sản phẩm PCR thí nghiệm từ kết luận diện gene liên quan độc lực vi khuẩn E coli Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm khuếch đại fimC iucD fimC (496bp); iucD (714bp) (1,7) E5; (2,8) E9; (3, 9) E8; (4, 10) E10; (5, 11) E21; (6) 50bp DNA ladder Nồng độ gel agarose 1,5%, thời gian điện di 45 phút 100V Cần xác định thêm gene liên quan yếu tố độc lực khác vi khuẩn E coli gây bệnh để khẳng định khả gây bệnh chế gây bệnh gốc E coli phân lập 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tỉ lệ phân lập gốc E coli dương tính từ gà bị bệnh 62,86% Các gốc vi khuẩn E coli phân lập mẫn cảm 50% với tobramycin, norfloxacine, neomycin gentamicin Đa số gốc E coli phân lập có khả gây chết phơi trứng gà gây bệnh gà – ngày tuổi với triệu chứng bệnh tích điển hình Đa số gốc E coli có độc lực phân lập mang gene fimC iucD 5.2 Đề nghị Do chưa nghiên cứu đầy đủ yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli gây bệnh gà, chưa có tính lặp lại thí nghiệm Vì vậy, khóa luận trở nên hồn thiện hơn, tơi đề nghị: xác định độc lực gốc E coli lại gà thí nghiệm, kiểm tra type kháng nguyên kiểm tra gene độc lực khác 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng Việt Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Kim Loan 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà xuất Nông Nghiệp Phạm Thành Hổ 2008 Nhập môn công nghệ sinh học Nhà xuất Giáo dục, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Hưng 2006 Giáo trình chăn ni gia cầm Nhà xuất Đại Học Huế Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ Hà Thị Minh Thi 2007 Giáo trình sinh học phân tử Nhà xuất Đại Học Huế Nguyễn Thị Phước Ninh 2010 Bài giảng bệnh truyền nhiễm gia cầm Tủ sách trường ĐH Nông Lâm, TP HCM Lò Thanh Sơn 2009 Cơng nghệ di truyền Nhà xuất Đại Học Tây Bắc Phần nước Barnes, H.J and W.B Gross, 1997 Colibacillosis In: Diseases of Poultry Calnek, B.W., at al (Eds.) 10th Edition, Mosby-Wolf Publication Ltd., London, UK., pp: 131-139 ISBN: 0-7234-2955-3 Daini, O.A and A Adesemowo, 2008 Antimicrobial Susceptibility Pattern and R- Plasmids of Clinical Strains of Escherichia coli Aus J Basic Appli Sci., 2: 397-400 Dominique Vandekerchove 2004 Colibacillosis in battery-caged layer hens: clinical and bacteriological characteristics, and risk factor analysis http://lib.ugent.be/fulltxt/thesis/19852368.pdf 10 Esther–Maria Antão, Susanne Glodde, Ganwu Li, Reza Sharifi, Timo Homeier, Claudia Laturnus, Ines Diehl, Astrid Bethe, Hans–C Philipp, Rudolf Preisinger, Lothar H Wieler, Christa Ewers 2008 The chicken as a natural model for extraintestinal infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC) Microbial Pathogenesis 45, p 361-369 11 Giovanardi, E Campagnari, L Sperati Ruffoni, P Pesente, G Ortali and V Furlattini 2005 Avian pathogenic Escherichia coli transmission from broiler breeders to their progeny in an integrated poultry production chain Avian Pathology 34:4, p 313-318 12 Huq M R 2002 Longitudinal Study of the Causes of Mortality of Chickens in Parent Stock Flocks of the Department of Livestock Services (DLS) of Bangladesh with a Special Emphasis on Esherichia coli Infection M Sc Thesis 13 Janßen T, Dr Hans-C Philipp, Dr Matthias Voss, Prof Rudolph Preisinger and Prof Lothar H Wieler 2003 Multiplex PCR is the first technique to allow the specific and sensitive detection of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) Avian Diseases (2003) 28, p 1-5 14 Janben T, Schwarz C, Preikschat P, Voss M, Philipp HC, Wieler LH 2001 Virulence-associated genes in avian pathogenic Escherichia coli (APEC) isolated from internal organs of poultry having died from colibacillosis Int J 36 Med Microbiol 2001 Nov;291(5), p 371-8 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11727821 15 Kwon Soon - Gu, Se -Yeoun Cha, Eun - Ju Choi, Bokyung Kim, Hee - Jong Song and Hyung - Kwan Jang 2008 Epidemiological Prevalence of Avian Pathogenic Escherichia coli Differentiated by Multiplex PCR from Commercial Chickens and Hatchery in Korea Journal of Bacteriology and Virology Vol 38, No 4, p 179 – 188 16 Lutful Kabir 2010 Avian Colibacillosis and Salmonellosis: A Closer Look at Epidemiology, Pathogenesis, Diagnosis, Control and Public Health Concerns Int J Environ Res Public Health 2010, 7,89 - 114; doi:10.3390/ijerph7010089 17 Oliveira A,S Sillankorva, R Quinta, A Henriques, R Sereno and J Azeredo 2009 Isolation and characterization of bacteriophages for avian pathogenic E.coli strains The Society for Applied Microbiology vol 106, pp 1919 – 1927 18 Susantha M Gomis, Robert Goodhope, Les Kumor, Norleen Caddy, Craig Riddell, Andrew A Potter, Brenda J Allan 1997 Isolation of Escherichia coli from cellulitis and other lesions of the same bird in broilers at slaughter Can Vet J 1997; 38: 159-162 19 Paul SC, Khan MSR, Amin MM, Begum F, Hassan J and Islam MS 2009 Chacracterization of Salmonella isolated from pigs of sadar upazilla of Mymensingh district Bangl J Vet Med p 281 – 286 20 Sharada R, S Wilfred Ruban and M Thiyageewaran 2010 Isolations, characterization and antibiotic resistance pattern of Escherichia coli from poultry American – Eurasian Journal of Scientific Research (1), p 18– 22 ISSN 1818-6785 21 Timothy J Johnson, Subhashinie Kariyawasam, Yvonne Wannemuehler, Paul Mangiamele, Sara J Johnson, Curt Doetkott, Jerod A Skyberg, Aaron M Lynne, James R Johnson, and Lisa K Nolan 2007 The Genome Sequence of Avian Pathogenic Escherichia coli Strain O1:K1:H7 Shares Strong Similarities with Human Extraintestinal Pathogenic E coli Genomes JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol 189, no 8, pp 3228-3236 22 Wooley RE, Gibbs PS, Brown TP and Maurer JJ 2000 Chicken embryo lethality assay for determining the virulence of avian Escherichia coli isolates Avian disease 44 (2), p 318 – 324 23 Won Ga-Yeon, Moon Bo-Mi, Oh In-Gyeong, Kiku Matsuda, Atul A Chaudhari, Jin Hur, Eo Seong-Kug, Yu Il-Jeoung, Lee Young-Ju, Lee YunSik, Kim Byeong-Su and Lee John Hwa 2009 Profiles of virulenceassociated genes of avian pathogenic Escherichia coli isolates from chickens with colibacillosis J Poult Sci., 46: p 260-266 24 Zahraei Salehi and S Farashi Bonab 2006 Antibiotics Susceptibility Pattern of Escherichia coli Strains Isolated from Chickens with Colisepticemia in Tabriz Province, Iran International Journal of Poultry Science (7): p 677684 37 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ĐỂ NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN Brain Heart Infusion Broth (BHI) Thành phần g/l Dịch từ tim bò 250 Dịch từ não dê 200 Proteose peptone sodium chloride 10 Sodium chloride Di - sodium phosphate 2,5 Dextrose pH 7,4 ± 0,2 25oC Nước cất lít Kligler Iron Agar (KIA) Thành phần g/l Peptic tiêu hóa mơ động vật 15 Agar 15 Lactose 10 Proteose peptone Sodium chloride Cao thịt bò Cao nấm men Dextrose Sodium thiosulphate 0,3 Ferrous sulphate 0,2 Phenol red 0,024 pH 7,4 ± 0,2 25oC Nước cất lít Blood agar (BA) Thành phần g/l Peptone from casein 10 Peptone from meat Heart extract Cao nấm men Starch Sodium chloride Agar 13 Máu cừu 5% pH 7,3 ± 0,2 25oC Nước cất lít EMB agar, Levine Thành phần g/l Peptic digest of animal tissue 10 Dipotassium phosphate Lactose 10 Eosin – Y 0,4 Methylene Blue 0,065 Agar 15 pH 7,1 ± 0,2 25o C Nước cất lít Simmon citrate agar Thành phần g/l MgSO4 0,2 Ammonium dihydrogen phosphate Dipotassium phosphate Sodium citrate Bromothymol blue 0,08 Agar 15 pH cuối (tại 25oC) 6,8 ± 0,2 Nước cất lít Nutrient agar (NA) Thành phần g/l Peptic digest of animal tissue Beef extract 1,5 Cao nấm men 1,5 Sodium chloride Agar 15 pH điểm cuối (ở 25oC) 7,4 ± 0,2 Nước cất lít Nutrient broth Thành phần g/l Peptic digest animal tissue Cao nấm men 1,5 Beef extract 1,5 Sodium chloride pH điểm cuối (ở 25oC) 7,4 ± 0,2 Nước cất 1lít Methylred Voges – Proskauer (MR – VP) Thành phần g/l Peptone K2HPO4 pH 6,9 ± 0,2 Nước cất lít Thành phần cách pha dung dịch Mac Farland 0,5 • Dung dịch A (0,048 M BaCl ) 1,175g BaCl 2H O Thực với 10ml nước cất • Dung dịch B (0,18 M H SO ) 1,0 ml (Analar grade Sp Gr 1,84) Cho vào 100ml nước cất • Cho theo tiêu chuẩn: Cho 0,5ml dung dịch A vào 99,5ml dung dịch B Lắc mạnh phân vào ống nghiệm thủy tinh suốt hay ống có nắp -6 ml Được bảo quản tối nhiệt độ phòng thay chuẩn bị dung dịch chuẩn khác sau tháng chuẩn bị Tiêu chuẩn độ đục nên khuấy động trước sử dụng Cách đo độ đục với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5 Để so sánh độ đục huyễn dịch vi khuẩn với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5 ta làm sau: kẻ lên tờ giấy trắng (A4) hai đường thẳng song song bút lông đen Lấy ống huyễn dịch vi khuẩn Mac Farland để gần sát với hai đường thẳng song song, so độ đục Nếu ống huyễn dịch vi khuẩn cho thêm khuẩn lạc, ngược lại cho nước muối sinh lý 0,9% vô trùng Bảng Các chuẩn mực biên luận đường kính vòng vơ khuẩn Enterobacteriaceae Đĩa kháng sinh Ampicillin Amoxicillin Cephalexin Cefuroxime acetil Gentamicin Kanamycin Netilmicin Tobramycin Tetracycline Doxycycline Norfloxacin Trimethoprim/ sulfamethoxazole colistin Hàm lượng 10 µg 10 µg 30 µg 30 µg 10 µg 30 µg 30 µg 10 µg 30 µg 30 µg 10 µg 23,75 µg Đường kính vòng vơ khuẩn đo mm tròn Kháng Trung gian Nhạy ≤13 14-16 ≥17 ≤13 14-16 ≥17 ≤14 15-17 ≥18 ≤14 15-22 ≥23 ≤12 13-14 ≥15 ≤13 14-17 ≥18 ≤12 13-14 ≥15 ≤12 13-14 ≥15 ≤14 15-18 ≥19 ≤12 13-15 ≥16 ≤12 13-16 ≥17 ≤10 11-15 ≥16 ≤8 9-10 ≥11 Bảng Thời gian gây chết phôi trứng Mẫu Số trứng tiêm E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 Thời gian theo dõi 0-24h 24-48 2 1 2 1 2 0 3 1 3 1 3 Số phôi chết 48h 2 3 Tỉ lệ (%) Tính chất Độc Độc TB Độc TB TB Độc Độc Độc Độc TB Độc TB TB TB TB TB Độc TB Không TB TB 36,36 45,45 27,27 36,36 18,18 18,18 36,36 45,45 36,36 72,72 18,18 36,36 27,27 18,18 18,18 18,18 27,27 45,45 18,18 0,00 27,27 18,18 Bảng Điểm triệu trứng lơ thí nghiệm Mẫu E1 E2 E3 E4 E7 E8 E9 E10 E12 E13 E18 E21 10 10 10 0 0 10 10 Ngày 1 0 0 0 5 0 0 0 1 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 10 Ngày 2 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 Ngày 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Bảng Tỉ lệ gà chết ngày Gốc E coli Độc Độc TB Số gà tiêm (con) Số gà chết (con) Tỉ lệ chết % 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 0 10 10 0 10 0 90 40 30 100 100 0 90 100 E1 E2 E4 E7 E8 E9 E10 E12 E18 E3 E13 E21 ĐC Bảng Điểm bệnh tích quan ngày Mẫu Độc Độc TB E1 E2 E4 E7 E8 E9 E10 E12 E18 E3 E13 E21 Túi khí 0 0 0 2 0 1 1 Gan 10 10 9 10 10 10 10 0 1 0 0 1 3 0 Tim 0 10 0 Phổi 0 0 0 0 0 0 6 1 0 0 0 0 0 Lách 10 1 1 1 Bảng Điểm bệnh tích trung bình số quan sau ngày tiêm Độc Độc TB Mẫu E1 E2 E4 E7 E8 E9 E10 E12 E18 E3 E13 E21 Túi khí 0,1 ± 0,32 0,0 ± 0,0 0,2 ± 0,42 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,2 ± 0,42 0,2 ± 0,42 0,0 ± 0,0 0,1 ± 0,32 0,1 ± 0,32 0,1 ± 0,32 0,1 ± 0,32 0,0 ± 0,0 ĐC Gan ± 0,0 ± 0,0 1,5 ± 0,53 1,4 ± 0,52 1,1 ± 0,32 1,1 ± 0,32 ± 0,0 ± 0,0 ± 0,0 ± 0,0 1,3 ± 0,48 1,2 ± 0,42 0,0 ± 0,0 Tim 0,1 ± 0,32 0,4 ± 0,52 ± 0,82 0,7 ± 0,82 0,9 ± 0,32 2,1 ± 0,32 ± 0,0 0,1 ± 0,32 0,2 ± 0,94 0,3 ± 0,48 1,6 ± 0,52 1,7 ± 0,48 0,0 ± 0,0 Phổi 1,1 ± 0,32 0,7 ± 0,48 0,2 ± 0,42 0,6 ± 0,52 0,8 ± 0,42 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,8 ± 0,42 0,6 ± 0,52 0,6 ± 0,52 0,1 ± 0,32 0,1 ± 0,32 0,0 ± 0,0 Lách ± 0,0 0,6 ± 0,52 ± 0,0 ± 0,0 0,9 ± 0,32 ± 0,0 ± 0,0 0,7 ± 0,48 ± 0,0 0,8 ± 0,42 ± 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Descriptive Statistics: Túi khí E1, Túi khí E2, Túi khí E3, Túi khí E4, Variable N N* Mean SE Mean StDev Minimum Q1 Median Túi khí E1 10 0.100 0.100 0.316 0.000 0.000 0.000 Túi khí E2 10 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 Túi khí E3 10 0.200 0.133 0.422 0.000 0.000 0.000 Túi khí E4 10 0.200 0.133 0.422 0.000 0.000 0.000 Túi khí E7 10 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 Túi khí E8 10 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 Túi khí E9 10 0.100 0.100 0.316 0.000 0.000 0.000 Túi khí E10 10 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 Túi khí E12 10 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 Túi khí E13 10 0.100 0.100 0.316 0.000 0.000 0.000 Túi khí E18 10 0.100 0.100 0.316 0.000 0.000 0.000 Túi khí E21 10 0.100 0.100 0.316 0.000 0.000 0.000 Descriptive Statistics: Gan E1, E2, E3, E4, E7, E8, E9, E10, E12, E13, E18, E21 Variable N N* Mean SE Mean StDev Minimum Q1 Median Q3 Gan E1 10 1.0000 0.000000 0.000000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 E2 10 1.0000 0.000000 0.000000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 E3 10 1.0000 0.000000 0.000000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 E4 10 1.500 0.167 0.527 1.000 1.000 1.500 2.000 E7 10 1.400 0.163 0.516 1.000 1.000 1.000 2.000 E8 10 1.100 0.100 0.316 1.000 1.000 1.000 1.000 E9 10 1.100 0.100 0.316 1.000 1.000 1.000 1.000 E10 10 1.0000 0.000000 0.000000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 E12 10 1.0000 0.000000 0.000000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 E13 10 1.300 0.153 0.483 1.000 1.000 1.000 2.000 E18 10 1.0000 0.000000 0.000000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 E21 10 1.200 0.133 0.422 1.000 1.000 1.000 1.250 Descriptive Statistics: Tim E1, E2, E3, E4, E7, E8, E9, E10, E12, E13, E18, E21 Variable N N* Mean SE Mean StDev Minimum Q1 Median Q3 Tim E1 10 0.100 0.100 0.316 0.000 0.000 0.000 0.000 E2 10 0.400 0.163 0.516 0.000 0.000 0.000 1.000 E3 10 0.300 0.153 0.483 0.000 0.000 0.000 1.000 E4 10 0.300 0.153 0.483 0.000 0.000 0.000 1.000 E7 10 0.700 0.260 0.823 0.000 0.000 0.500 1.250 E8 10 0.700 0.300 0.949 0.000 0.000 0.000 2.000 E9 10 2.100 0.100 0.316 2.000 2.000 2.000 2.000 E10 10 2.0000 0.000000 0.000000 2.0000 2.0000 2.0000 2.0000 E12 10 0.100 0.100 0.316 0.000 0.000 0.000 0.000 E13 10 0.200 0.133 0.422 0.000 0.000 0.000 0.250 E18 10 0.200 0.133 0.422 0.000 0.000 0.000 0.250 E21 10 1.900 0.100 0.316 1.000 2.000 2.000 2.000 Bảng Kết kiểm tra diện gene fimC iucD 21 mẫu độc lực phôi trứng gà Mẫu ĐỘC (n=9) ĐỘC TB (n=12) E1 E2 E4 E7 E8 E9 E10 E12 E18 E3 E5 E6 E11 E13 E14 E15 E16 E17 E19 E21 E22 Sự diện gene độc lực fimC iucD + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ... đến nhiễm trùng thứ cấp E coli, thường xảy từ – 12 tuần tuổi, với thi t hại xảy chủ yếu tuần thứ Đây bệnh gia cầm phổ biến với thi t hại vượt 20% Kết tăng trưởng kinh tế giảm giảm hiệu thức ăn,... non-lethal plots, but the lession scores is lower than in the strains had dead-chickens are great In this study, the presence of the virulence – associated genes in avian pathogenic Escherichia coli... dụng kĩ thuật sinh học phân tử PCR để phát số gene độc lực chủng E coli gây bệnh gia cầm điều cần thi t Từ có hiểu biết sâu đặc điểm gây bệnh E coli gia cầm Đồng thời, kiểm tra tính mẫn cảm E coli