BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ MỸ LINH Niên khóa : 2007 - 2011 Tháng 07/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, THỬ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VI KHUẨN Escherichia coli GÂY BỆNH TRÊN GÀ TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG HƯỚNG DẪN KHOA HỌC SINH VIÊN THỰC HIỆN TS NGUYỄN TẤT TOÀN NGUYỄN THỊ MỸ LINH Tháng 07/2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Tất Toàn TS Nguyễn Thị Phước Ninh tận tình hướng dẫn cho tơi từ ngày đầu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bệnh Viện Thú Y, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập để tơi hồn thành khóa luận Các anh chị phòng xét nghiệm vi sinh hỗ trợ, hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian tơi thực tập làm khóa luận Các Thầy Cơ Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nơng Lâm hết lòng truyền đạt kiến thức q báu thời gian tơi theo học trường Gia đình người bạn ủng hộ, chia sẻ giúp đỡ nhiều suốt thời gian qua TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2011 Nguyễn Thị Mỹ Linh i TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Phân lập, thử kháng sinh đồ xác định độc lực vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh gà số địa phương” tiến hành Bệnh Viện Thú Y, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh thời gian từ 15/01/2011 – 30/06/2011 Trong số 45 mẫu gà mổ khám có 24 mẫu có triệu chứng bệnh tích điển hình tiến hành phân lập xác định có dương tính với E coli hay khơng Kết có 20 mẫu dương tính với E coli đạt tỷ lệ phân lập 83,3%, có 10 mẫu từ Đồng Nai, mẫu Quận 9, TP HCM, mẫu Tiền Giang mẫu Bình Phước Sau tiến hành thử kháng sinh đồ 20 gốc E coli cho kết đa số mẫu đề kháng cao với kháng sinh ampicillin (tỷ lệ 57,14% - 100%), amoxicillin (tỷ lệ 50% - 100%), trimethoprim/sulfamethoxazone (tỷ lệ 40% - 100%) tetracycline (tỷ lệ 80% - 100 %) Trong số 13 loại kháng sinh E coli nhạy với số kháng sinh norfloxacine (50% - 100%), tobramycin (90% - 100%) Vi khuẩn kháng trung bình với colistin, cephalexin, cefuroxine, doxycyline, gentamicin, kanamycin, neomycine (tỷ lệ 10% – 42,86%) Xác định độc lực 20 gốc dương tính qua tiêm truyền phơi trứng 12 ngày tuổi gà ngày tuổi Kết cho thấy Bình Phước Tiền Giang có tỷ lệ chết phơi trung bình tương ứng 54,55% 45,45% mức độc Đồng Nai Quận 9, TP HCM có tỷ lệ chết phơi trung bình từ 23% - 33,64% mức độc trung bình Tỷ lệ gà chết sau tiêm vi khuẩn dao động khoảng 20% – 100% Triệu chứng chung gà sau ngày tiêm huyễn dịch vi khuẩn thở yếu, ngực phập phồng nhẹ, xù lông, phản ứng nhanh với âm Tỷ lệ số gà chết cao thuộc lô tiêm vi khuẩn phân lập Đồng Nai Sau mổ khám gà ta thấy có bệnh tích điển hình bệnh E coli gan viêm, viêm màng bao tim, phổi có khối viêm, túi khí dày, lách xung huyết… Xác định gene độc lực iucD fimC 15 gốc E coli có độc lực cho kết dương tính 86,7% 93,3% Hầu hết gốc E coli phân lập chứa gene độc lực ii SUMMARY The thesis title “Isolation, resistance status study, and determination virulence of avian pathogenic Escherichia coli in some provinces of Vietnam” was conducted in the Hospital Veterinary, Nong Lam University from January to June, 2011 There was 24 post mortem chickens express typical symptoms and lesions among 45 ones, they were isolated to detective Escherichia coli The result showed that 20 positive samples with percentage 83,3%, there was 10 E coli strains in Dong Nai province, E coli strains in district 9, Ho Chi Minh city, E coli strains in Tien Giang province and E coli strains in Binh Phuoc province After that, we performed antibiotic sensitivity test for 20 E coli strains with 13 antibiotic agents Result showed that a high level of resistance of all the isolates to four antimicrobial agents such as ampicillin (57,14 – 100%), amoxicillin (50 – 100%), trimethoprim/sulfamethoxazone (40 – 100%) and tetracycline (80 – 100%), intermediate resistance of them to such as colistin, cephalexin, cefuroxine, doxycyline, gentamicin, kanamycin, neomycine (10 – 42,86%) and sensitive of them to antimicrobial agents norfloxacine (50 - 100%), tobramycin (90 - 100%) Virulence determination of the 20 E coli strains will be done by injection in twelve day old embryonated fowls’ eggs and one day old chick The result showed that rate of death inoculated embryos was high in Binh Phuoc (54,55%) and Tien Giang (45,45%), correlative isolates was virulent, medium in Dong Nai and district 9, Ho Chi Minh city (23 - 33,64%) correlative isolates was moderately The death of chick fluctuated 20 – 100% The most common from of chicks symptom after day observed is light breathing with slight movement of the chest, ruffled feathers and alert The high percentage of the chick died in after they were injected with isolates in Dong Nai The most important lesion was pericarditis, the air sac membranes become thicker and cloudy in appearance Liver may show a thin covering of fibrinous exudates Spleen was congestion Lung had lesions Using PCR to detect the presence of virulent gene iucD and fimC The result showed that rate of iucD and fimC were 93,3%, 86,7% repectively Most of the isolates E coli harboring combination iucD and fimC gene iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii M ỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Tính chất ni cấy đặc điểm sinh hóa 2.1.3 Cấu tạo kháng nguyên 2.1.4 Phân loại E coli .4 2.1.5 Shiga toxigenic E coli (STEC) .5 2.1.5.1 Thuật ngữ 2.1.5.2 Shiga toxin yếu tố độc lực liên quan 2.1.6 Enteropathogenic E coli (EPEC) 2.1.7 Enterotoxingenic E coli (ETEC) 2.1.7.1 Các yếu tố độc lực 2.1.8 Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) 2.2 Bệnh E coli gây gà 10 2.2.1 Động vật cảm thụ .10 2.2.2 Những phương thức truyền lây 10 2.2.3 Triệu chứng bệnh tích .10 2.2.3.1 Thể viêm túi khí 10 iv 2.2.3.2 Thể bại huyết 10 2.2.3.3 Thể viêm ruột 10 2.2.3.4 Thể viêm vòi trứng 11 2.2.3.5 Thể chết phôi 11 2.2.3.6 Các thể khác .11 2.2.4 Chẩn đoán 11 2.2.5 Phòng trị bệnh 11 2.2.5.1 Phòng bệnh .11 2.2.5.2 Trị bệnh 11 2.3 Kỹ thuật PCR 12 2.3.1 Khái niệm nguyên tắc 12 2.3.2 Các giai đoạn phản ứng PCR 12 2.3.3 Các thành phần phản ứng PCR 13 2.3.4 Phân tích kết PCR 14 2.4 Một số nghiên cứu liên quan 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm .16 3.1.1 Thời gian 16 3.1.2 Địa điểm 16 3.2 Đối tượng nghiên cứu .16 3.3 Nội dung nghiên cứu 16 3.4 Phương pháp nghiên cứu 16 3.4.1 Phân lập gốc E coli gà bệnh 17 3.4.1.1 Mục đích 17 3.4.1.2 Vật liệu .17 3.4.1.3 Phương pháp tiến hành .18 3.4.2 Khảo sát kháng sinh đồ 19 3.4.2.1 Mục đích 19 3.4.2.2 Vật liệu .19 3.4.2.3 Thực 20 3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi .20 3.4.3 Xác định độc lực qua tiêm truyền phôi trứng gà 20 v 3.4.3.1 Mục đích 20 3.4.3.2 Vật liệu .20 3.4.3.3 Tiêm phôi trứng 12 ngày tuổi 21 3.4.3.4 Tiêm truyền gà ngày tuổi .23 3.4.4 Khảo sát gen độc lực từ gốc E coli phân lập phương pháp PCR 25 3.4.4.1 Mục đích 25 3.4.4.2 Vật liệu .25 3.4.4.3 Phương pháp tiến hành .25 3.4.4.4 Chỉ tiêu theo dõi .26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Phân lập gốc E coli gà bệnh .27 4.2 Khảo sát kháng sinh đồ 28 4.3 Xác định độc lực qua tiêm truyền phôi trứng gà 31 4.3.1 Kết tiêm phôi trứng .31 4.3.1.1 Ghi nhận số phôi chết thời gian theo dõi ( 24 - 48 giờ) 31 4.3.1.2 Quan sát bệnh tích đại thể phơi trứng chết 32 4.3.1.3 Phân lập lại vi khuẩn E coli từ trứng chết phôi .34 4.3.2 Xác định độc lực qua tiêm truyền gà 34 4.3.2.1 Số gà chết sau tiêm truyền huyễn dịch vi khuẩn 34 4.3.2.2 Triệu chứng lâm sàng gà thời gian theo dõi 35 4.3.2.3 Bệnh tích quan sát 35 4.3.2.4 Tái phân lập E coli EMB 37 4.4 Khảo sát gene độc lực từ gốc E coli phân lập PCR 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO .41 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A/E : Attaching and effacing APEC : Avian pathogenic Escherichia coli BA : Blood agar CF : Colonization factor CFU : Colony forming units DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphat EaggEC = EAEC : Enteroaggregative E coli EHEC : Enterohaemorrhagic E coli EIEC : Enteroinvasive E coli EMB : Eosin methylen blue agar EPEC : Enterophathogenic E coli ETEC : Enterotoxigenic E coli Hly : Haemolysin HUS : Haemolytic uraemic syndrome IMViC : Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon Citrate KIA : Kligle iron agar LEE : Locus of enterocyte effacement LT : Heat labile toxin MCK : MacConkey agar NA : Nutrient agar PCR : Polymerase chain reaction ST : Heat stable toxin STEC : Shiga toxin-producing E coli Stx : Shiga toxin Tir : Translocated intimin receptor Tm : Melting temperature TSH : Temperature sensitive haemagglutinin UV : Ultra violet vii VT : Verotoxin VTEC : Verotoxigenic E coli viii 4.3.2.2 Triệu chứng lâm sàng gà thời gian theo dõi Bảng 4.8 Điểm triệu chứng trung bình gà sau tiêm truyền vi khuẩn Địa phương Số gốc E coli Sau ngày Đồng Nai Rất độc (n=5) 1,32±0,14 1±0,2 0,26±0,09 Độc trung bình (n=1) 1,87±0,64 1,83±0,4 0,75±0,25 1,44±0,31 1±0,35 0,33±0,142 Độc trung bình (n=1) 0,7±0,26 0,89±0,26 0,5±0,27 Tiền Giang Rất độc (n=2) 0,8±0,17 0,7±0,15 0,25±0,14 Bình Phước Rất độc (n=1) 2,67±0,67 2,33±0,33 1,33±0,33 Quận 9, TP HCM Rất độc (n=2) Sau ngày Sau ngày Qua bảng 4.8 nhận thấy gốc độc thuộc tỉnh Đồng Nai có điểm trung bình triệu chứng thấp độc trung bình tỉnh lại cao so với điểm trung bình triệu chứng gốc độc trung bình Quận 9, TP HCM gốc độc Tiền Giang Chứng tỏ độc lực gốc E coli phân lập tỉnh Đồng Nai cao Các gốc độc thuộc tỉnh Tiền Giang gốc độc trung bình Quận 9, TP HCM gần không gây triệu chứng bệnh cho gà sau tiêm huyễn dịch (điểm trung bình qua ngày theo dõi nhỏ 1) Các gà tiêm vi khuẩn E coli phân lập Bình Phước (rất độc) có điểm trung bình triệu chứng cao nhất, điểm trung bình sau ngày thứ ngày thứ hai 2,67 ± 0,67 2,33 ± 0,67, gà có triệu chứng thở khó tăng cử động ngực, xù lông phản ứng với âm Các gốc vi khuẩn phân lập Đồng Nai, Quận 9, TP HCM có điểm trung bình triệu chứng lớn 1, gà có triệu chứng chung xù lông, phản ứng nhanh nhẹn, thở yếu so với không bệnh Sau ngày đa số gà khơng có triệu chứng bệnh, nhanh nhẹn, phản ứng nhanh với âm 4.3.2.3 Bệnh tích quan sát Đa số tất gà tiêm huyễn dịch vi khuẩn có bệnh Và có bệnh tích điển hình E coli gây gà bị nhiễm bệnh túi khí dày đục, tổn thương phổi với tổn thương diện tích rộng, có nhiều dịch viêm bên màng bao tim, màng bao tim dày đục, có lớp tơ huyết phủ bên ngồi gan, lách xung huyết 35 Hình 4.5 Màng bao tim dày đục, chứa dịch bên Hình 4.6 Phổi có khối viêm Hình 4.7 Gan nhạt màu có lớp tơ huyết phủ, tim tích dịch 36 Bảng 4.9 Điểm trung bình bệnh tích số quan Địa Tim phươn Tính chất Phổi Túi khí g Gan Lách 1±0,21 0,58±0,16 0,8±0,2 0,4±0,16 tim Rất độc (n=6) Độc TB (n=1) màng bao Rất độc (n=2) Độc TB (n=1) Rất độc (n=2) Rất độc (n=1) 1,08±0, 0,9±0,2 1,4±0,2 1±0,21 1,1±0,1 1,75±0,33 1,23±0,27 1,7±0,4 0,6±0,22 2,1±0,21 1,05±0,26 1,25±0,17 0,5±0,16 1,7±0,37 0,6±0,22 0,8±0,25 0,7±0,15 0,16±0,22 1,2±0,2 0,95±0,17 0,55±0,11 2±0,26 0,7±0,21 0,5±0,17 1,3±0,3 0,8±0,13 1: Đồng Nai, 2: Quận 9, TP HCM, 3: Tiền Giang, 4: Bình Phước; TB: trung bình Qua bảng 4.9, ghi nhận điểm trung bình bệnh tích quan lớn 0, điều chứng tỏ E coli gây bệnh quan khảo sát Điểm trung bình bệnh tích túi khí, phổi, tim màng bao tim, gan gốc độc Đồng Nai, Quận 9, TP HCM lớn so với điểm trung bình gốc độc trung bình Điểm trung bình bệnh tích phổi cao quan khảo sát, tiếp đến túi khí E coli xâm nhập vào vật chủ qua hệ thống hô hấp Vị trí vi khuẩn tiếp cận với dòng máu vùng trao đổi khí phổi túi khí, nơi mà tương đối yếu thiếu diện thường xuyên đại thực bào (Antão ctv, 2008) Điểm trung bình bệnh tích quan khảo sát gốc độc Quận 9, TP HCM cao so với tỉnh khác 4.3.2.4 Tái phân lập E coli EMB Kết phân lập vi khuẩn E coli từ mẫu bệnh phẩm từ gà có bệnh tích lơ có tiêm huyễn dịch canh khuẩn dương tính với E coli Điều chứng tỏ gà chết E coli gây bệnh 37 4.4 Khảo sát gene độc lực từ gốc E coli phân lập PCR Kết PCR thu dược 86,7% số gốc E coli phân lập dương tính với hai gene độc lực fimC iucD Các gốc E coli có độc lực có tỷ lệ chứa hai gene cao fimC ladder 10 11 iucD 700 bp 500 bp Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm khuếch đại gene fimC iucD fimC(496 bp); iucD (714 bp) Lanes - 5: mẫu DNA gốc - Lane ladder 50 bp Lane – 11: mẫu DNA gốc – Bảng 4.10 Tỷ lệ gốc có mang gene iucD fimC fimC Địa phương Số gốc E coli Đồng Nai Rất độc n= Trung bình n= Q 9, TP HCM Tiền Giang Số lượng iucD 83 100 Số lượng Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) 83 100 Rất độc n= 50 100 Trung bình n= 2 100 100 Rất độc n= 2 100 100 Bình Phước Rất độc n= 1 100 100 Qua bảng 4.10 kết tỷ lệ gốc E coli phân lập có mang gene fimC, iucD mang hai gene tỉnh Tiền Giang Bình Phước đạt mức cao (100%), Đồng Nai có tỷ lệ từ 83 - 100% số mẫu có mang hai gene trên, Quận 9, TP HCM đạt tỷ lệ từ 50 - 100% Trung bình tỷ lệ số gốc E coli có mang gene fimC 86,7% tỷ lệ số gốc mang gene iucD 93,3%, tỷ lệ số gốc có mang gene 86,7% Kết PCR xác định gene gây độc theo Janßen ctv (2001) tỷ lệ mag gene fimC 92,7% iucD 88,7% so với kết chúng tơi đạt tỷ lệ gốc E coli mang gene iucD cao 38 tỷ lệ gốc E coli mang gene fimC lại thấp Kết theo Giovanardi ctv (2005) 100% mẫu có mang gene fimC iucD kết thấp Cần xác định thêm gene liên quan đến yếu tố độc lực khác để khảo sát chi tiết đặc điểm chế gây bệnh gốc E coli Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tỷ lệ phân lập E coli dương tính cao Đồng Nai (91%) thấp Tiền Giang (50%) Phần lớn gốc E coli đề kháng cao với kháng sinh ampicillin, amoxicillin, tetracycline, trimethoprim/sulfemethoxazone nhạy với norfloxacin tobramycin với liều lượng kháng sinh 30ppm Hầu hết gốc E.coli phân lập từ địa phương có độc lực mức độ trung bình đến cao: gây chết phơi, có biểu triệu chứng bệnh tích rõ ràng gà ngày tuổi Đa số gốc E coli có độc lực phân lập mang hai gene iucD fimC 5.2 Đề nghị Số lượng mẫu thử nghiệm nhiều cần xác định thêm gene độc lực khác để so sánh xem xét mối tương quan với gene độc lực khác 39 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Xuân Bình ctv 2002 109 bệnh gia cầm cách phòng trị Nhà xuất nơng nghiệp Hà Nội, trang 41 - 46 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Dũng 2007 Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm Tài liệu trường Đại học Khoa học tự nhiên Lê Thị Mai Khanh, 2004 Phát số gen độc lực Escherichia coli phân lâp từ phân thịt bò, heo kỹ thuật multiplex – PCR Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 66 - 67 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010 Bài giảng bệnh truyền nhiễm gia cầm Tủ sách trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Đoàn Thị Nguyện 2001 Vi sinh vật Y học Nhà xuất Y học Hà Nội, trang 118 – 121 Bùi Thị Tho Nghiêm Thị Anh Đào 2005 Giáo trình dược lý thú y Nhà xuất Hà Nội Tiếng Anh Abdul – Aziz T A., El – Sukhon S N.1996 Serum sensitivity and apathogenicity for chickens and chick embryos of Escherichia coli J5 strain Veterinary research 27 (3): 267 – 271 10 Antão ME., Glodde S., Li G., Sharifi R., Homeier T., Laturnur C., Diehl I., Bethe A., Philipp HC., Preisinger R., Wieler LH., Ewers C 2008 The chicken as a natural model for extraintestinal infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC).Microbial pathogenesis 45: 361 – 369 11 Barnes H J., Gross W B 1999 Diseases of poultry Ames Iowa, Iowa state university press p: 131 – 141 12 Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Herman L 2003 Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass swabs Res Microbiol 154: 97 - 104 13 Calderwood S B., Acheson D W K., Keuch G T., Barrett T J., Griffin P M., Strockbine N A., 1997 Proposed new nomenclature for SLT (VT) family ASM News 1997: 118 - 119 14 Cebula T A., Payne W L., and Fegn P 1995 Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype 0157:H7 and their Shiga-like toxin type by Mismatch amplification mutation assay multiplex – PCR J Clin Microbiol 33: 28 250 15 Cerna J F., Nataro J P, and Garcia T E 2003 Multiplex – PCR for detection of three plasmid borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains J Clin Microbiol 42: 2138 - 2140 16 Chulasiri M Suthienkul O 1989 Antimicrobial resistances of Escherichia coli isolated from chickens Veterinary Microbiology 21: 189 – 194 41 17 Dho - Moulin M., Fairbrother J M., 1999 Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) Veterinary Research 30 (2 - 3): 299 – 316 18 Donenberg M S., Tzipori S., McKee M L., O’Brien A D., Alroy J., and Kaper J B 1993 The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model J Clin Invest 92: 1418 - 1428 19 Ga - YeonWon, Bo - Mi Moon, In - Gyeong Oh, Kiku Matsuda, Atul A Chaudhari, Jin Hur, Seong - Kug Eo, IL - Jeoung Yu, Young - Ju Lee, Yun - Sik Lee, Byeong - Su Kim and John Hwa Lee 2009 Profiles of virulence associated genes of avian pathogenic Escherichia coli isolates from chickens with colibacillosis J Poult Sci., 46: 260 - 266 20 Gaastra W., and Svennerholm A M 1996 Colonization factors of human enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) Trends Microbiol 4: 444 - 452 21 Giovanardi D., Campagnari E., Ruffoni L Sperati, Pesente P., Ortali G And Furlattini V 2005 Avian pathogenic Escherichia coli tranmission from broiler breeders to their progeny in an intergrated poultry production chain Avian Pathology 34: 4, 313 - 318 22 Janßen T., Schwarz C., Preikschat P., Voss M., Phillipp HC., Preisinger R., Wieler L H 2001 Virulence – associated genes in avian pathogenic Escherichia coli (APEC) isolated from internal organs of poultry having died from colibacillosis Internation of Juornal of Microbiol 291 (5): 371 – 378 23 Janßen T., Phillipp HC., Voss M., Preisinger R., Wieler L H 2003 Multiplex PCR is the first technique to allow the specific and sensitive detection of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) Internation of Juornal of Microbiol 28 24 Konowalchuck J., Speirs J I, and Stavric S 1977 Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli Infect Immun 18: 775 - 779 25 Leung P H M., Peiris J S M., Ng W W S., Robin-Browne R M., Bettelheim K A., and Yam W., C 2003 A newly discovered verotoxin variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli Appl Environ Microbiol 69: 7549 – 7553 26 Moon H W., Schneider R A., and Moseley S L 1986 Comparative prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli isolated from swine Am J Vet Res 47: 210 – 212 27 Nataro J P and Kaper J B 1998 Diarrheagenic Escherichia coli Clin Microbiol Rev 11(1): 142 - 201 28 Neter E., Westphal O., Luderitz O., Gimo R M., and Gorzynski E A 1995 Demonstration of antibodies against enteropathogenic Escherichia coli in sera of children of various ages Pediatrics 16: 801-808 29 Wooley RE, Gibbs PS, Brown TP, Maurer JJ 2000 Chicken embryo lethality assay for determining the virulence of avian Escherichia coli isolates Avian disease 44(2): 318 - 324 42 PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ BA Peptone from casein 10 g Peptone from meat 5g Heart extract 3,6 Extract from yeast 5g Starch 1g Sodium chloride 5g Agar – agar 13 g Nước cất 1000 ml Beef heart infusion from 250 g Calf brain infusion from 200 g Proteose peptone 10 g Sodium chloride 5g Di – sodium phosphate 2,5 g Dextrose 2g Nước cất 1000 ml Peptone lactose 10 g Phosphate dipotassium (K HPO ) 2g Eosin 10 g Methylen Blue 10 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml Cao nấm men 3g Beef extract 3g Peptone 20 g BHI EMB KIA NaCl 5g Lactose 10 g FeSO 0,2 g Na S O 0,3 Glucose 1g Agar 15 g Nước cất 1000 ml Phenol red ml Beef extract 3g Peptone 5g Nước cất 1000 ml Bacto peptone 17 g Bacto Proteose peptone 3g Bacto Lactose 10 g Bacto Bile salts 1,5 g Sodium Chloride 5g Bacto Agar 13,5 g Neutral Red 0,03 g Bacto Crystal Violet 0,001g Nước cất vừa đủ 1000 ml Peptone 5g Sodium chloride 5g Beef Extract 1,5 g Yeast Extract 1,5 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 15 g Idol MAC NA pH = 7,4 ± 0,2 (250C) SIMMON CITRATE Sodium citrate 2g NaCl 5g K HPO 1g NH H PO 1g MgSO 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml Peptone 7g Glucose 5g K HPO 5g Nước cất vừa đủ 800 ml MR – VP pH = 6,9 ± 0,2 Thuốc thử VP (Voges Proskauer) Dung dịch A: Alpha naphthol 5g Ethanol tuyệt đối 100 ml Dung dịch B: Potassium hydroxyde 40 g Nước cất 100 ml MR (Methyl red) Methyl red 0,1 g Alcohol 300 ml Nước cất vừa đủ 500ml Bảng Bệnh tích đại thể sau tiêm truyền gà ngày tuổi Điểm bệnh tích (số con) Phổi túi khí gan tim lách Điểm Điểm coli 3 2 Gốc 0 3 0 0 Gốc 2 0 3 Gốc 5 0 4 Gốc 4 0 0 4 Gốc 0 2 Gốc 0 0 6 Gốc 0 5 2 Gốc 11 0 2 Gốc 12 0 0 4 Gốc 13 0 3 0 4 Gốc 18 0 0 5 2 Gốc 19 0 0 4 Gốc 20 0 0 5 Gốc E Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Bảng Số lượng phôi chết ngày quan sát Tỉnh Đồng Nai Quận Tiền Giang Bình Phước Thời gian chết sau tiêm 24 - 48 Tên gốc - 24 giờ Gốc Gốc Gốc 3 Gốc 2 Gốc Gốc Gốc Gốc Gốc Gốc 10 Gốc11 3 Gốc 12 Gốc13 Gốc14 1 Gốc15 Gốc16 Gốc17 0 Gốc18 Gốc19 Gốc20 Tổng số chết sau 48 6 4 3 1 6 2 1 6 Bảng Điểm triệu chứng quan sát tỉnh Đồng Nai ĐIỂM TRIỆU CHỨNG QUAN SÁT Đồng SAU NGÀY Nai SAU NGÀY SAU NGÀY 4 Gốc 5 0 0 0 Gốc 0 0 0 0 Gốc 2 0 0 Gốc 0 0 1 0 Gốc 0 0 0 0 0 0 0 Gốc 6 2 3 0 Gốc 3 3 0 Bảng Điểm triệu chứng Quận 9, TP HCM TRIỆU CHỨNG QUAN SÁT Quận SAU NGÀY SAU NGÀY SAU NGÀY 4 Gốc 11 3 0 1 0 Gốc 12 0 0 0 Gốc 13 0 0 0 Bảng Điểm triệu chứng tỉnh Tiền Giang TRIỆU CHỨNG QUAN SÁT Tiền Giang SAU NGÀY SAU NGÀY SAU NGÀY 4 Gốc 18 0 0 0 Gốc 19 0 0 0 Bảng Điểm triệu chứng Bình Phước TRIỆU CHỨNG QUAN SÁT Bình Phước Gốc 20 SAU NGÀY SAU NGÀY SAU NGÀY 4 0 0 0 Bảng Tỷ lệ chết phôi sau 48 sau tiêm vi khuẩn (Bình Phước) Bình Phước Tổng số chết Tỷ lệ sau 48 chết Gốc20 54,55% Đối chứng 0,00% Tên gốc Kết luận Rất độc Bảng Tỷ lệ chết phôi sau 48 sau tiêm vi khuẩn (tỉnh Đồng Nai) Đồng Nai Tên gốc Tổng số chết sau 48 Gốc Gốc Gốc Gốc 4 Gốc Gốc Gốc Gốc Gốc Gốc 10 Trung bình Tỷ lệ chết 54,55% 54,55% 45,45% 36,36% 36,36% 36,36% 27,27% 27,27% 9,09% 9,09% 33,64% Kết luận Rất độc Rất độc Rất độc Rất độc Rất độc Rất độc Độc trung bình Độc trung bình Khơng độc Khơng độc Bảng Tỷ lệ chết phôi sau 48 sau tiêm vi khuẩn (Quận 9) Tên gốc Gốc11 Gốc 12 Gốc13 Gốc14 Gốc15 Gốc16 Gốc17 Số phôi chết sau 48 6 2 1 Trung bình Quận 9, Tp HCM Tỷ lệ chết 54,55% 54,55% 18,18% 18,18% 9,09% 9,09% 0,00% 23,38% Kết luận Rất độc Rất độc Độc trung bình Độc trung bình Khơng độc Không độc Không độc Bảng 10 Tỷ lệ chết phôi sau 48 sau tiêm vi khuẩn (Tiền Giang) Tiền Giang Tên Số phôi chết sau 48 Tỷ lệ gốc chết Gốc18 54,55% Gốc19 36,36% Trung bình 45,45% Kết luận Rất độc Rất độc