BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI-RÚT GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP CHỦNG BẮC MỸ TRÊN HEO (PRRSV) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME RT-PCR SỬ DỤNG MẪU DÒ TAQMAN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : LÊ THỊ THƠM Niên khoá : 2007 – 2011 Tháng năm 2011 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI-RÚT GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP CHỦNG BẮC MỸ TRÊN HEO (PRRSV) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME RT-PCR SỬ DỤNG MẪU DÒ TAQMAN Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI KS VÕ KHÁNH HƯNG LÊ THỊ THƠM Tháng năm 2011 iii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cám ơn gia đình ln quan tâm động viên suốt trình học tập Em xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng nghệ Sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức hay phong cách làm việc tốt cho em suốt năm học Tập thể cán quý Thầy - Cô Viện công nghệ sinh học môi trường, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian thực tập Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải KS.Võ Khánh Hưng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho em suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Thầy Phạm Hùng Vân, chị Thùy Trang anh chị phòng thí nghiệm cơng ty Nam Khoa giúp đỡ em nhiều q trình làm thí nghiệm Các bạn nhóm nghiên cứu, bạn lớp DH07SH Chân thành cảm ơn bạn Nguyễn Văn Chí KS Nguyễn Phan Thành giúp đỡ em trình thực đề tài i TÓM TẮT Bệnh vi-rút PRRS gây heo xảy ra, gây nhiều thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi giới Việt Nam Tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp xuất biến chủng PRRSV Bắc Mỹ độc lực cao Trung Quốc, gọi tắt HV-PRRS (highly virulent PRRS) Các chủng PRRSV phát Việt Nam xác định phần lớn thuộc dòng PRRSV Bắc Mỹ có PRRSV độc lực cao Do vậy, việc xây dựng quy trình định tính định lượng PRRSV dòng Bắc Mỹ cần thiết cho cơng tác phòng chống bệnh Real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao định tính định lượng vi-rút PRRS nhiễm heo Vì yêu cầu trên, đề tài “ Xây dựng quy trình định tính định lượng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản hô hấp chủng Bắc Mỹ heo (PRRSV) kỹ thuật real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman” thực Viện Công nghệ sinh học Môi trường Công ty Nam Khoa Kết đạt gồm xây dựng thành cơng quy trình định tính định lượng PRRSV; ứng dụng quy trình real-time PCR chẩn đốn 20 mẫu thực địa, kết 11/20 mẫu dương tính với PRRSV dòng Bắc Mỹ (tỷ lệ 55%) ii SUMMARY The reproductive and respiratory syndrome has been spreading and causing severe economic devastations for the international and Vietnam livestock The situation has become complexly when the highly virulent virus in China mutated from North American PRRSV appears In Vietnam, PRRSV is determined to be North America PRRSV and even HV-PRRSV Therefore, establishing the procedure for detecting and quantifying PRRSV is necessary Taqman based real time RT-PCR is the sensitive and specific method to detect and quantify PRRSV For all these reasons, the thesis: “To establish the procedure to detect and quantify reproductive and respiratory syndrome virus by using the Taqman based real time RT-PCR” is performed at the Institute Research of Biotechnology and Environment and Nam Khoa company The result achieves: The research established successfully the procedure to detect and quantify NA PRRSV The procedure was applied to test 20 samples which 11 samples are positive with the NA PRRSV (55%) iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i TÓM TẮT .ii SUMMARY iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu .2 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo 2.2 Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo 2.2.2 Biến chủng PRRSV độc lực cao Trung Quốc 2.2.3 Cấu trúc vi-rút PRRS .6 2.3 Chẩn đoán vi-rút PRRS .7 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 2.3.2 Phương pháp phát kháng thể 2.3.3 Phương pháp RT-PCR 2.3.4 Phương pháp nested RT-PCR .8 2.4 Kỹ thuật real-time PCR chẩn đoán PRRSV 2.4.1 Kỹ thuật real-time PCR 2.4.2 Các chất phát huỳnh quang sử dụng real-time PCR .8 2.4.3 Nguyên lý hoạt động real-time sử dụng mẫu dò Taqman 10 iv 2.4.4 Thành phần phản ứng real-time PCR dùng mẫu dò Taqman 11 2.4.5 Tiêu chuẩn phản ứng PCR định lượng tối ưu 11 2.4.6 Thiết kế mồi mẫu dò cho phản ứng real-time PCR 13 2.5 Một số nghiên cứu nước PRRSV 14 2.5.1 Nghiên cứu giới 14 2.5.2 Một số nghiên cứu Việt Nam 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu 16 3.3 Hóa chất thiết bị 16 3.4 Phương pháp tiến hành 17 3.4.1 Thu nhận mẫu 17 3.4.2 Ly trích RNA từ dịch vi-rút huyết 19 3.4.3 Thiết kế mồi mẫu dò real-time PCR đặc hiệu PRRSV dòng Bắc Mỹ 20 3.4.4 Kiểm tra khả hoạt động cặp mồi F7-R7VN 20 3.4.5 Phản ứng Onestep Taqman real-time RT-PCR mẫu thực địa 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Thiết kế cặp mồi mẫu dò cho phản ứng real-time PCR 22 4.2 Kiểm tra hoạt động cặp mồi F7-R7VN 24 4.3 Phản ứng Onestep Taqman real-time RT-PCR với mồi F7-R7VN mẫu dò P7 .24 4.4 Xây dựng đường chuẩn cho định lượng PRRSV 25 4.5 Xác định độ đặc hiệu phản ứng 26 4.6 Ứng dụng quy trình Onestep Taqman Real-time RT-PCR mẫu thực địa 27 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa Amino acid cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid Ct Threshold cycle DNA Deoxyribonucleotide acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EU European FAO Food and Agriculture Organization HV-PRRS Highly virulent PRRS LOD Limit of detection NA North American nt Nucleotide NTC No template control ORF Open reading frame PAMs Porcine alveolar macrophage PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction TBE Tris borate EDTA TE Tris EDTA vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Một số cặp chất phát hấp thụ huỳnh quang thường sử dụng .9 Bảng 3.1 Mẫu sử dụng quy trình phát PRRSV Taqman real-time PCR 18 Bảng 3.2 Cặp mồi mẫu dò thiết kế cho phản ứng real-time 20 Bảng 3.3 Thành phần nồng độ hóa chất phản ứng RT-PCR 20 Bảng 3.4 Quy trình nhiệt phản ứng RT-PCR 21 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng Onestep Taqman real-time PCR 21 Bảng 3.6 Chu trình nhiệt phản ứng Onestep Taqman real-time PCR 21 Bảng 4.1 Kết chạy mẫu thực địa 28 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Sự phân bố vi-rút PRRS khu vực Đông Nam Á từ 2007 - 2010 Hình 2.2 Cấu trúc gen vi-rút PRRS Hình 2.3 Cấu tạo mẫu dò Taqman Hình 2.4 Cơ chế phát quang Taqman phản ứng real-time PCR 10 Hình 2.5 Biểu đồ thể giai đoạn tín hiệu huỳnh quang 11 Hình 2.6 Đường chuẩn cho phản ứng định lượng 13 Hình 4.1 Vị trí bắt cặp mồi xi F7 ORF7 PRRSV dòng Bắc Mỹ 22 Hình 4.2 Vị trí bắt cặp mồi R7VN PRRSV dòng Bắc Mỹ 23 Hình 4.3 Vị trí Taqman bắt cặp vào DNA PRRSVdòng Bắc Mỹ .23 Hình 4.4 Chạy RT-PCR với dịch pha loãng dịch vi-rút mẫu huyết 24 Hình 4.5 Phản ứng định tính Taqman real-time PCR 25 Hình 4.6 Biểu đồ khuếch đại độ pha loãng dịch vi-rút từ 100 đến 10-5 25 Hình 4.7 Đường chuẩn độ pha lỗng dịch vi-rút từ 100 đến 10-5 26 Hình 4.8 Đánh giá độ đặc hiệu cặp mồi F7-R7VN 27 Hình 4.9 Đường phát tín hiệu huỳnh quang mẫu thuyết thực địa 29 Hình 4.10 Hàm lượng vi-rút PRRSV mẫu H2 H14 đường chuẩn .29 Hình 4.11 Tương quan dịch vi-rút từ Navetco vacxin IngelVac 30 viii Hình 4.7 Đường chuẩn độ pha lỗng dịch vi-rút từ 100 đến 10-5 Đường chuẩn có hiệu khuếch đại 101,0%, nằm giới hạn khuếch đại cho phép Real-time PCR (90-105%) (Bio-Rad), hệ số tương quan R2 =0,983 hệ số góc -3,298 (hình 4.7) Các thông số chứng tỏ đường chuẩn đạt yêu cầu đạt độ tin cậy cao để thực phản ứng real-time định tính định lượng vi-rút PRRS dòng Bắc Mỹ Đường chuẩn giúp đánh giá độ nhạy phản ứng real-time PCR hay xác định giới hạn phát vi-rút Giới hạn phát (LOD) xác định số lượng thấp phản ứng phát được, độ nhạy phản ứng Dựa vào đồ thị hình 4.7, giới hạn phát PRRS dòng Bắc Mỹ Taqman real-time RT-PCR xác định độ pha loãng 10-4với Ct = 38,67 Thực phản ứng real-time RT-PCR RT-PCR phát PRRSV dòng Bắc Mỹ điều kiện sử dụng mồi F7-R7VN mẫu dịch vi-rút công ty Navetco xác định ngưỡng phát hai phương pháp 10-4 10-3 Kết chứng tỏ kỹ thuật real-time PCR có độ nhạy cao RT-PCR Sự khác biệt độ nhạy hai phương pháp nghiên cứu 10 lần 4.5 Xác định độ đặc hiệu phản ứng Sử dụng mẫu gồm dịch ly trích PRRSV Navetco, mẫu âm tính với PRRSV dòng Bắc Mỹ (đã xác định RT-PCR) mẫu dương tính với PCV2 (xác định phản ứng PCR với mồi theo Kathleen năm 2008) Tiến hành chạy Taqman real-time PCR theo thành phần quy trình nhiệt bảng 3.5 3.6, kết mẫu vacxin xuất 26 tín hiệu huỳnh quang chu kỳ 28,56 mẫu PRRSV âm tính mẫu PCV2 dương tính khơng có tín hiệu (hình 4.8) Kết khẳng định phản ứng real-time có độ đặc hiệu cao phát PRRSV dòng Bắc Mỹ Hình 4.8 Đánh giá độ đặc hiệu cặp mồi F7-R7VN 4.6 Ứng dụng quy trình Onestep Taqman Real-time RT-PCR mẫu thực địa Tiến hành quy trình Onestep Taqman real-time RT-PCR 21 mẫu gồm 20 mẫu huyết thực địa heo bị nghi nhiễm vi-rút PRRS mẫu vacxin PRRSV IngelVac làm đối chứng dương Đánh giá kết dựa vào chu kỳ ngưỡng mẫu NTC định lượng số ng/µl đường chuẩn tuyến tính Theo ngun tắc mẫu có hàm lượng RNA cao thời gian phát tín hiệu huỳnh quang ngắn lại hay Ct thấp Chính vậy, mẫu có Ct nhỏ Ct mẫu âm xem dương tính với vi-rút PRRS Trong tổng số 20 mẫu huyết thực địa, có 11/20 mẫu dương tính với PRRSV dòng Bắc Mỹ, chiếm 55%, chứng tỏ quy trình có độ tin cậy cao (bảng 4.1) 27 Bảng 4.1 Kết chạy mẫu huyết thực địa STT Mẫu Ct 10-4 38,67 H1 30,67 + H2 28,50 + H3 31,21 + H4 - H5 - H6 29,14 + H7 29,93 + H8 - 10 H9 - 11 H10 - 12 H11 31,04 + 13 H12 - 14 H13 35,07 + 15 H14 29,86 + 16 H15 - 17 H16 - 18 H17 34,13 + 19 H18 30,45 + 20 H19 32,56 + 21 H20 - 22 PRRSV IngelVac 28,56 + 28 Kết luận Hình 4.9 Đường phát tín hiệu huỳnh quang mẫu thuyết thực địa.H2, H14: mẫu thực địa, Ct 28,50 29,68, (-) mẫu âm sử dụng nước siêu Hình 4.10 Hàm lượng vi-rút PRRSV mẫu H2 H14 thể đường chuẩn 29 Hình 4.11 Tương quan dịch vi-rút từ Navetco vacxin PRRSV IngelVac Kết hình 4.11 nhận thấy, Ct dịch vi-rút từ Navetco dịch vacxin 28,53 28,56, không chênh lệch nhiều Điều chứng tỏ vùng ORF7 dịch vi-rút ni cấy từ công ty Navetco vi-rút nhược độc IngelVac có tương đồng cao hay vacxin IngelVac có tính ổn định Do sử dụng vacxin PRRSV IngelVac làm đối chứng dương quy trình real-time phát PRRSV dòng Bắc Mỹ 30 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Mồi mẫu dò Taqman thiết kế cho phản ứng real-time PCR đặc hiệu với dòng PRRSV Bắc Mỹ Quy trình Onestep real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman nghiên cứu đặc hiệu với PRRSV type NA, cho phép định tính định lượng vi-rút PRRS có độ nhạy độ đặc hiệu cao, có khả ứng dụng chẩn đốn thực tế 5.2 Đề nghị So sánh độ nhạy quy trình xây dựng với quy trình chuẩn khác RT-PCR, RT-LAMP Phát triển chứng nội nhằm đảm bảo điều kiện tối ưu phản ứng Xây dựng đường chuẩn dịch plasmid có chèn vùng gen ORF7 PRRSV dòng Bắc Mỹ giúp định lượng xác số vi-rút Giải trình tự mẫu thực địa dương tính nhằm xác định dòng Bắc Mỹ cũ hay biến dòng từ Trung Quốc, xây dựng sinh dòng đánh giá tình hình nhiễm PRRS type NA Hồ Chí Minh số địa phương khác 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cục Thú Y 2011 Thơng tin tình hình dịch bệnh gia súc gia cầm Bio-rad Laboratories, Inc Real-time PCR-Kỹ thuật ứng dụng Feng Y., Zhao T., Nguyễn Tùng, Inui K., Ma Y., Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Văn Cảm, Liu D., Bùi Quang Anh, Tô Long Thành, Wang C., Tian K., Gao GF 2009 Các biến dòng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp Việt Nam Trung Quốc năm 2007 Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú Y 16 (1): 5-9 Huỳnh Thị Thu Hương 2009 Xác định tỷ lệ nhiễm dòng virus PRRS đàn heo địa phương Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Kim Văn Phúc, Nguyễn Thị Lam Hương, Đặng Hùng, Trần Thanh Quân, Bùi Anh Thy Morrissy Chris 2007 Điều tra lưu hành virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) heo số tỉnh Nam Bộ Báo cáo kết NCKH 2007, Bộ Nông Nghiệp PTNT Lê Thị Thu Hà 2010 Định lượng giải trình tự vi-rút PRRSV đàn heo giống tỉnh Đồng Nai Luận văn Thạc sĩ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long Nguyễn Ngô Minh Triết 2000 Bước đầu khảo sát hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) số trại heo giống thuộc vùng Tp.HCM Báo cáo Khoa học Chăn ni Thú Y tồn quốc 1999 – 2000: 244 – 249 Nguyễn Ngọc Hải Đặng Ngọc Thùy Dương 2010 Phân tích di truyền số dòng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRSV) Tp.Hồ Chí Minh Đồng Nai Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú Y số 1: 25-29 Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học Thú Y Nhà xuất Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh 10 Phạm Hùng Vân 2009 PCR real time PCR vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học 11 Trần Thị Bích Liên Trần Thị Dân 2007 Xác định tỷ lệ nhiễm chủng virus PRRS số sở chăn ni heo miền Đơng Nam Bộ Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú Y 14 (6): 5-9 12 Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân Nguyễn Ngọc Tuân 2007 Chẩn đoán vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kỹ thuật RT – PCR Tạp chí KHKT tập XIV, Số 5, 5-12 13 Võ Khánh Hưng 2009 Phân tích trình tự gen ORF5 ORF7 vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRSV) số tỉnh miền Nam Việt Nam Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 32 Tài liệu tiếng Anh 14 Allende R., Lewis T.L., Lu Z., Rock D.L., Kutish G.F., Ali A., Doster A.R and Osorio F.A., 1999 North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus differ in non-structural protein coding regions J Gene.Virol 80: 307-15 15 Amonsin A., Kedkovid R., Puranaveja S., Wongyanin P., Suradhat S., and Thanawongnuwech R 2009 Comparative analysis of complete nucleotide sequence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolates in Thailand (US and EU geneotypes) Virology Journal 6:143 16 An T., Zhou Y., Liu G., Tian Z., Li L., Qiu H and Tong G 2007 Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein of PRRSV isolates in mainland China from 1996 to 2006: Coexistence of two NA-subgeneotypes with great diversity Vet Micro 123: 43–52 17 Balka G., Hornyákb A., Bálintc A., Benyeda Z.and Rusvai M 2009 Development of a one-step real-time quantitative PCR assay based on primer-probe energy transfer for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virological Methods 158: 41–45 18 Bustin SA 2000 Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 25: 169 -193 19 Chen J., Liu T., Zhu C.G., Jin Y.F and Zhang Y.Z 2006 Genetic Variation of Chinese PRRSV Strains Based on ORF5 Sequence Biochemical Genetics44:421–431 20 Cheng, Jian-Jun Zhao, Na Li, Yuan Sun, Yan-Jun Zhou, Yan Zhu, Zhi-Jun Tian, Changchun Tu, Guang-Zhi Tong and Hua-Ji Qiu 2008 Simultaneous detection of Classical swine fever virus and North American genotype Porcine reproductive and respiratory syndrome virus using a duplex real-time RT-PCR Journal of Virological Methods, 194-199 21 Christianson WT, Collins JE, Benfield DA, Harris L, Gorcyca DE, Chladek DW, Morrison RB and Joo HS 1992 Experimental reproduction of swine infertility and respiratory syndrome in pregnant sows Am J Vet Res 53: 485-8 22 Christoph Egli, Barbara Thu, Luzia Liu and Martin A Hofmann 2001 Quantitative TaqMan® RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virological Methods 98: 63–75 23 Chung W.B., Chan W.H., Chaung H.C., Lien Y, Wu C.C and Huang Y.L 2005 Real-time PCR for quantitation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type in naturally-infected and challenged pigs J.Virol Methods 124: 11-19 24 Dea S, Gagnon CA, Mardassi H, Pirzadeh B and Rogan D 2000 Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145: 659–688 25 FAO (2011) Porcine reproductive and syndrome (PRRS), virulence jumps and persistent circulation in Southeast Asia 26 Gall A Le, O Legeay , Bourhy H., Arnauld C., Albina E and Jestin A 1998 Molecular variation in the nucleoprotein gene (ORF7) of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Virus Research 54: 9–21 33 27 Gyula Balka, Ákos Hornyák, Ádám Bálint, Zsófia Benyeda and Miklós Rusvai 2009 Development of a one-step real-time quantitative PCR assay based on primer-probe energy transfer for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virological Methods 158: 41–45 28 Kathleen A McIntosh , Anju Tumber , John C.S Harding , Steven Krakowka , John A Ellis and Janet E Hill 2008 Development and validation of a SYBR green real-time PCR for the quantification of porcine circovirus type in serum, buffy coat, feces, and multiple tissues Veterinary Microbiology 133: 23–33 29 Lurchachaiwong W., Payungporn S., Srisatidnaraku U., Mungkundar C., Theamboonlers A and Poovorawan Y 2008 Rapid detection and strain identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RTPCR Journal compilation 46: 55- 60 30 Madsen, K G., Hansen, C M., Madsen, E S., Strandbygaard, B., Botner, A and Sorensen, K J 1998 Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the American type collected from Danish swine herds Archives of Virology 143: 1683–1700 31 Mateu, E., Diaz, I., Darwich, L., Casal, J., Martin, M and Pujols, J 2006 Evolution of ORF5 of Spanish porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains from1991 to 2005 Virus Research 115: 198–206 32 Nelson EA, Christopher-Hennings J, Drew T, Wensvoort G and Collins JE 1993 Differentiation of U.S and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies Journal Clinical Microbiol 31: 3184–3189 33 Roongtham Kedkovid, Suparlark Nuntawan Na Ayudhya, Alongkorn Amonsin and Roongroje Thanawongnuwech 2010 NSP2 gene variation of the North American genotype of the Thai PRRSV in central Thailand Virology Journal 7:340 34 Shimizu M, Yamada S, Murakami Y, Morozumi T and Kobayashi H 1994 Isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus from Heko-Heko disease of pigs Journal Vet Medical Science 56: 389–391 35 Suarez P., Zardoya R., Martin M.J., Prieto C., Dopazo J., Solana A and Castro J.M 1996 Phylogenetic relationships of european strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) inferred from DNA sequences of putative ORF-5 and ORF-7 genes Virus Research 42: 159–165 36 W Lurchachaiwong, S Payungporn, U Srisatidnarakul, C.Mungkundar, A Theamboonlers and Y Poovorawan 2007 Rapid detection and strain identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RTPCR, Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254 37 Wasilk A., Callahan J.D., Christopher-Hennings J.J, Gay T A., Fang Y., Dammen M., Reos M E., Torremorell M., Polson., Mellencamp M., Nelson E.A 2004 Detection of U.S Lelystad, and European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and relative quantitation in boar semen and serum samples by real-time PCR J Clin Microbiol 42: 4453 - 4461 38 Xiaofang Hao, Zengjun Lu, Wendong Kuang, Pu Sun, Yu Fu, Lei Wu, Qing Zhao, Huifang Bao, Yuanfang Fu, Yimei Cao, Pinghua Li, Xingwen Bai, Dong Li and Zaixin Liu 2011 Polymorphic genetic characterization of the ORF7 gene of 34 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in China Virology Journal, 8:73 39 Xing-Long Xiao, Hui Wu, Yi-Gang Yu, Bang-Zhao Cheng, Xiao-Quan Yang, Gu Chen, Dong-Mei Liu and Xiao-Feng Li 2008 Rapid detection of a highly virulent Chinese-type isolate of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus by real-time reverse transcriptase PCR Journal of Virological Methods 149: 49–55 35 PHỤ LỤC Phụ lục1 Blast mồi R7VN với PRRS dòng Bắc Mỹ PCV2 NCBI Hình Blast mồi R7-VN với dòng PRRS Bắc Mỹ (www.ncbi.nlm.nih.gov/) Phụ lục Khảo sát cấu trúc primer dimer Mồi tự bắt cặp (Primer self dimer) Hình Khả mồi tự bắt cặp Mồi F7 R7VN bắt cặp với (Pair dimer) Hình Khả mồi F7 R7VN bắt cặp với Cấu trúc kẹp tóc (Hair spin) Hình Khả tạo cấu trúc kẹp tóc mồi ... VIẾT TẮT aa Amino acid cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid Ct Threshold cycle DNA Deoxyribonucleotide acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid... đồng thành phần nucleotide tỷ lệ tương đồng amino axit cao (99 - 100%) với dòng Trung Quốc; thấp so với dòng VR2332 (94 % nucleotide, 96 %về aa); thấp với dòng Lelystad (69 % nucleotide; 79 % aa)... nên thi t kế mồi khuếch đại sản phẩm DNA kích thước Thi t kế mẫu dò: Giống thí nghiệm định lượng khác, real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman yêu cầu khuếch đại hiệu đặc hiệu sản phẩm Nguyên tắc thi t