10 TCN 729 – 2006 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 729-2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH PHÙ Ở LỢN DO VI KHUẨN E COLI 10 TCN 729 – 2006 Hà Nội - 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 729 – 2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH PHÙ Ở LỢN DO VI KHUẨN E COLI ngày (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN tháng năm 2006 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho cán thú y để chẩn đoán bệnh phù lợn vi khuẩn E.coli gây Khái niệm bệnh Bệnh phù lợn vi khuẩn E coli có yếu tố bám dính F18 có khả sản sinh độc tố verotoxin 2e gây Khi có stress đặc biệt thay đổi chế độ dinh dưỡng, những chủng E.coli chủng có nhân tố bám dính Fimbriae 18 (F18) nhân lên ruột non bám vào thành ruột Các vi khuẩn sản sinh độc tố Verotoxin (VT2e), độc tố được hấp phụ vào máu đến tế bào biểu mô vi mạch quản làm cường thẩm thấu qua mạch quản gây phù triệu chứng thần kinh điển hình như: Đi lại loạng choạng, xiêu vẹo hay ngã, có co giật Máy móc - dụng cụ - môi trường - hoá chất - nguyên liệu 3.1 Máy móc dụng cụ - Tủ lạnh - Tủ ấm 370C - Tủ sấy - Lò vi sóng - Nồi hấp ướt - Cân điện 10 TCN 729 – 2006 - Kính hiển vi phóng đại 1000 lần - Nồi đun cách thuỷ (Water bath) - Bộ đồ mổ tiểu gia súc - Dụng cụ thuỷ tinh: Bình tam giác, ống đong, cốc có mỏ, chai thuỷ tinh, đĩa lồng, ống nghiệm, pipet, lam kính - Các dụng cụ khác: Panh, kéo, dao cắt, que cấy, đèn cồn, bút viết kính, thấm nước, không thấm nước, khăn hoặc giấy thấm mềm - Dụng cụ đo pH 3.2 Hoá chất - Cồn Ethylic - Cồn Methylic – cồn isomylic - Xylen - Natri hydroxyt - Natri bicarbonat - Nước cất - Dầu soi kính - Bộ thuốc nhuộm Gram (xem phụ lục 1) - Thuốc thử Kovacs (xem phụ lục 1) - Thuốc thử Voges-Prskauer (xem phụ lục 1) - Methyl red 3.3 Môi trường nguyên liệu - Thạch máu bản (Blood agar base) - Thạch MacConkey (hoặc thạch Brilliant green) - Môi trường VP-MR - Nước peptone - Môi trường Cimon Citrate - Máu bò, bê hoặc cừu - Bộ kháng huyết E.coli chuẩn lợn - Kháng nguyên F18 - Cặp mồi (primer) phát yếu tố bám dính F18 - Cặp mồi (primer) phát gene vt2e (yếu tố độc lực VT2e) - Các nguyên liệu cần thiết cho PCR Phương pháp chẩn đoán Sơ đờ chẩn đốn bệnh phù vi khuẩn E coli Sơ đồ chẩn đoán bệnh phù vi khuõn E coli Đặc điểm dịch tễ Kiểm tra lâm sàng Mổ khám Kiểm tra bệnh tích Bệnh phẩm 10 TCN 729 2006 Phân lập, giám định sinh hoá, KHV Xác định yếu tố độc lực F18 VT2 Định týp huyết Kết luận 4.1.c im dịch te - Bệnh thường xuất trước sau cai sữa - Bệnh xuất lẻ tẻ, ít lây lan từ đàn sang đàn khác thường điều kiện nuôi dưỡng tốt - Lợn bị bệnh thường những phát triển nhanh nhất đàn - Tỉ lệ chết khoảng 65% 4.2 Triệu chứng lâm sàng - Một hoặc nhiều lợn bị chết đột ngột mà không biểu triệu chứng lâm sàng - Thần kinh rối loạn bao gồm: lại loạng choạng, xiêu vẹo hay ngã, có co giật - Phù mí mắt, mặt, phần bụng phù sưng to - Thở khó, kêu khàn khàn quản bị phù - Lợn có biểu bỏ ăn, bỏ bú Hiện tượng có thẻ kéo dài nhiều ngày - ỉa chảy, phân lỏng có toàn nước hoặc lẫn cục máu tươi - Lợn thường chết vòng từ giờ đến 48 giờ sau có triệu chứng lâm sàng 4.3 Bệnh tích - Phù dưới da toàn thân - Phù mí mắt, kết mạc, đường cong lớn dạ dày - Có dịch nhầy dưới niêm mạc dạ dày - Tràn dịch màng tim, màng phổi, xoang bụng tích nước - Máu đặc sẫm, phổi viêm, gan sưng , tim nhão, hạch ruột viêm toàn 4.4.Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm 4.4.1 Lấy mẫu - Dụng cụ lấy mẫu: lọ thuỷ tinh, bình tam giác hoặc túi nilông vô trùng - Bệnh phẩm: Lấy vô trùng phủ tạng, hạch màng treo ruột, ruột non mỗi loại cho vào từng lọ riêng biệt đậy kín đưa vào phòng xét nghiệm nhanh tốt Nếu phòng thí nghiệm xa, bệnh phẩm phải được bảo quản đIều kiện lạnh từ 0C đến 80C gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 48h sau lấy mẫu 4.4.2 Nuôi cấy, phân lập giám định vi khuẩn 10 TCN 729 – 2006 4.4.2.1 Nuôi cấy, phân lập Bệnh phẩm được nuôi cấy môi trường: Thạch máu, thạch MacConkey (nếu không có thạch MacConkey thì có thể thay bằng thạch Brilliant green) Nuôi 370C điều kiện hiếu khí 24 giờ 4.4.2.2 Giám định đặc tính sinh hoá Một số đặc tính sinh hoá đặc trưng vi khuẩn E.coli Vi khuẩn Indol MR VP Citrate Lactose E.coli + + - - + Dung huyết ± - Trên môi trường thạch MacConkey khuẩn lạc E.coli có màu hồng đậm, nhám, đường kính 2-4 mm - Trên môi trường thạch Brilliant green khuẩn lạc E.coli màu vàng môi trường trở nên vàng chanh - Thạch máu: E coli gây bệnh phù thường gây dung huyết thạch máu Khuẩn lạc màu trắng xám, tròn, bóng - Kiểm tra hình thái vi khuẩn kính hiển vi: Lấy que cấy chấm vào khuẩn lạc nghi ngờ thạch máu, hòa vào gịot nước sinh lý phiến kính hoặc lấy vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn giàn mỏng phiến kính, để khô, rồi cố định tiêu bản ngọn lửa đèn cồn Tiêu bản sau đã được cố định, nhuộm bằng phương pháp Gram (Phụ lục 4) Xem tiêu bản bằng vật kính dầu 100X Vi khuẩn bắt mầu đỏ (màu Gram âm), dạng trực khuẩn ngắn, cầu khuẩn hoặc hình bầu dục, đứng rải rác, không thành chuỗi - Sau kiểm tra hình thái kính hiển vi, cấy khuẩn lạc vào môi trường thạch McConkey - Chọn khuẩn lạc có mầu hồng đậm thạch McConkey cấy vào môi trường nước thịt hay nước peptone để tiếp tục kiểm tra đặc tính sinh hóa - Phản ứng IMViC IMViC = sinh Indol, methyl red (MR), Voges-Proskauer (VP) citrate) Từ những khuẩn lạc có màu hồng đậm thạch MacConkey gây dung huyết thạch máu, tiến hành làm phản ứng IMViC Vi khuẩn E coli có IMViC= +/ + / -/+ Sinh Indol: cấy khuẩn lạc vào môi trường nước peptone hay môi trường có chứa tryptophan, nuôi 370C từ 18 giờ đến 24 giờ Nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs vào môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn, bề mặt môi trường có vòng màu đỏ phản ứng dương tính + VP: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường nước VP-MR, nuôi 37 0C sau 24 giờ nhỏ vào môi trường nuôi cấy giọt thuốc thử VP (xem phần phụ lục), đọc kết quả sau giờ phút, có màu đỏ hồng dương tính, không biến màu hoặc màu vàng âm tính + MR: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường nước VP-MR, nuôi 37 0C sau 24 giờ nhỏ vào môi trường nuôi cấy giọt dung dịch đỏ methyl cồn 95 (xem phần phụ lục), đọc kết quả sau phút, có màu đỏ phản ứng dương tính, có màu vàng âm tính + Citrate: kiểm tra sự sử dụng citrate vi khuẩn Cấy khuẩn lạc vào thạch simon citrate nuôi 370C từ 18 giờ đến 24 giờ Vi khuẩn sử dụng citrate (dương tính) làm môi trường chuyển từ màu xanh sang màu xanh nước biển Âm tính môi trường giữ nguyên màu xanh 10 TCN 729 – 2006 4.4.2.3 Kiểm tra khả sản sinh độc tố F18 VT2e Kiểm tra yếu tố bám dính F18 bằng phản ứng Polymerase chain reaction (PCR) hay ngưng kết nhanh phiến kính - Kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính với kháng nguyên F18 + Để tìm yếu tố bám dính F18, nuôi cấy vi khuẩn E coli môi trường Minca hoặc + Lấy khuẩn lạc, hoặc vi khuẩn canh trùng nuôi cấy làm phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính với kháng nguyên F18 theo hướng dẫn nhà sản xuất - PCR để phát gene f18 sản sinh yếu tố bám dính F18 4.4.2.4 Kiểm tra khả sản sinh độc tố Verotxin - Kiểm tra độc lực động vật thí nghiệm chuột nhắt trắng + Tiêm chuột nhắt trắng mỗi 0,2 ml canh trùng nuôi cấy tĩnh (không lắc) Nếu có độc lực chuột chết sau 24 giờ - Dùng phản ứng PCR phát gene vt2e (yếu tố độc lực VT2e - Nếu có điều kiện) Kết luận Dựa đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích kết quả chẩn đoán phòng thí nghiệm: - Phân lập, giám định đặc tính sinh hoá - Kiểm tra yếu tố độc lực F18 VT2e KT BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng 10 TCN 729 – 2006 Phụ lục Phụ lục 1: Nhuộm gram Thuốc nhuộm a Dung dịch kết tinh tím Kết tinh tím 2,5g Nước cất 1000 ml b Dung dịch fuscin mẹ Fucsin kiềm 1g Cồn 960 C 10 ml Axit phenic kết tinh 5g Nước cất 100ml Pha loãng dung dịch mẹ theo tỉ lệ 1/10 với nước cất nhuộm c Dung dịch lugol Iodua kali 1g Iodua tinh thể 0,5g Nước cất 150 ml d Cồn axeton Cồn nguyên chất phần Axeton phần Cách nhuộm - Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: phút đến phút - Rửa nước nhanh, vẩy khô nước - Nhỏ dung dịch lugol: để phút - Rửa nước nhanh, vẩy khô - Nhỏ cồn Axeton - Rửa nước thật nhanh - Nhỏ dung dịch fucsin loãng: Để phút 10 TCN 729 – 2006 - Rửa nước - Thấm khô Sấy khô Xem kính bằng vật kính dầu - Vi khuẩn gram dương bắt màu tím - Vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ Phụ lục 2: Thuốc thử Kovacs a- Paradimetylaminobenzaldehyte 2,5 g b- Amyl alcohol (cồn amyl) 37,5 ml c- HCL đặc 12,5 ml Cách pha: Hoà dung dịch a vào b cho tan hết để tử lạnh âm 0C Thêm 5ml đến 10 ml HCL từ từ hồ đều rời để tủ lạnh cho lạnh lại tiếp tục đổ HCL cho đủ lượng * Thuốc thử không được để nóng lúc pha chế Bảo quản lọ màu, lạnh Dương tính: Vòng thuốc thử có màu đỏ Âm tính: Vòng thuốc thử có màu vàng Phụ lục 3: Thuốc thử phản ứng VP Chế thuốc thử - Dung dịch 1: - Dung dịch 1: Alpha-naphthol 5g Cồn 96 100 ml NaOH 40g Nước cất 100 ml Tiến hành phản ứng: cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP – MR, nuôi cấy 370C từ 24 giờ đến 48 giờ, sau đó nhỏ vào môi trường nuôi cấy giọt dung dịch Sau phút có màu đỏ hồng phản ứng dương tính Không biến màu hoặc màu vàng phản ứng âm tính Phụ lục 3: Thuốc thử phản ứng MR Đỏ methyl 0,04g 10 TCN 729 – 2006 Cồn 95 60 ml Nước cất 40 ml ... 729 – 2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH PHÙ Ở LỢN DO VI KHUẨN E COLI ngày (Ban hành kèm theo Quy t định số QĐ/BNN-KHCN tháng năm 2006 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) Phạm vi áp dụng:... thôn) Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho cán thú y để chẩn đoán bệnh phù lợn vi khuẩn E.coli gây Khái niệm bệnh Bệnh phù lợn vi khuẩn E coli có yếu tố bám dính F18 có khả sản sinh... IMViC IMViC = sinh Indol, methyl red (MR), Voges-Proskauer (VP) citrate) Từ những khuẩn lạc có màu hồng đậm thạch MacConkey gây dung huyết thạch máu, tiến hành làm phản ứng IMViC Vi