Đại Cương Về Sắc Ký (Chromatography) PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Đại Cương Về Sắc Ký Mục tiêu - Trình bày đònh nghóa sắc ký, giai đoạn trình sắc ký, phân loại sắc ký, hai yếu tố chủ yếu đònh trình tách sắc ký, nguyên tắc sắc ký hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử, lực - Giải thích ý nghóa thông số sắc ký - Ứng dụng cách đònh tính, đònh lượng phương pháp sắc ký Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Đại Cương Về Sắc Ký Dàn - Lòch sử - Đònh nghóa - Quá trình sắc ký - Phân loại phương pháp sắc ký - Sự tách sắc ký sắc ký đồ - Các thông số đặc trưng sắc ký - Ứng dụng sắc ký Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Lòch sử - Đònh nghóa  1906: Mikhail Tswett – sắc ký lỏng hấp phụ cột Ether dầu hỏa Sắc tố TV  1938: Izmailov & Schraiber – xây dựng phương pháp SKLM Chlorophyl Xanthophyl CaCO3  1958: Stahl – hoàn thiện phương pháp SKLM  1941: Martin & Synge – đặt tảng cho sắc ký phân bố: SKG SKK  1952: Martin & James – báo SKK  Cuối năm 1960: sắc ký lỏng cao áp đời  1937 – 1972: 12 giải Nobel sắc ký  Đầu năm 2005: sắc ký lỏng siêu áp t0 Nguyễn Đức Tuaán t1  2012: Sắc ký hội tu siêu hiệu Đại học Y Dược TPHCM Lòch sử - Đònh nghóa  Qui trình chất tan tách riêng trình dòch chuyển khác động lực học chúng hệ thống hai hay nhiều pha Một pha chuyển động cách liên tục theo hướng đònh pha chất riêng biệt thể linh độ khác có khác phân bố, hấp phụ, điện tích, kích thước phân tử, độ hòa tan áp suất  Sắc ký đòi hỏi hai pha:  Pha động: lỏng, khí, lỏng siêu tới hạn  Pha tónh: cố đònh cột hay bề mặt chất mang rắn trơ hóa học  Chất rắn hay chất lỏng tẩm, hấp phụ hay liên kết hóa học chất mang  Tương tác với chất tan theo chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, lực  Phương pháp sắc ký áp dụng ngành khoa học khác  Ngành Dược: nghiên cứu, phân tích, kiểm nghiệm thuốc Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hợp chất B Hợp chất A A B Quá trình sắc ký  Đưa hỗn hợp lên pha tónh  Khai triển sắc ký F  Sắc ký khai triển X  Sắc ký rửa giải: A  Quá trình rửa giải  Dung môi rửa giải (eluent) O x x x  Dung dòch rửa giải (eluate)  Phát chất  Màu chất  Đèn tử ngoại Mẫu  Phun thuốc thử  Đầu dò (detector) Nguyễn Đức Tuấn Triển khai sắc ký Đại học Y Dược TPHCM Phân loại phương pháp sắc ký  Theo chất vật lý pha Tên kỹ thuật Pha tónh Loại cân Sắc ký lỏng (liquid chromatography): pha động chất lỏng - Chất lỏng hấp phụ chất rắn (chất mang) - Pha liên kết - Chất rắn - Phân bố hai pha lỏng - Phân bố pha lỏng bề mặt pha liên kết - Hấp phụ Sắc ký khí (gas chromatography, GC): pha động chất khí - Chất lỏng hấp - Phân bố pha khí phụ chất rắn pha lỏng - Pha liên kết - Phân bố pha khí pha liên kết - Chất rắn - Hấp phụ Sắc ký lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid chromatography, SFC): pha động chất lỏng siêu tới hạn - Pha liên kết Nguyễn Đức Tuấn - Phân bố pha lỏng siêu tới hạn pha liên kết Đại học Y Dược TPHCM Phân loại phương pháp sắc ký  Theo phương cách cho pha động qua pha tónh  Sắc ký khai triển  Sắc ký rửa giải  Theo phương cách lưu giữ pha tónh  Sắc ký cột  Sắc ký lớp mỏng  Sắc ký giấy Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phân loại phương pháp sắc ký  Theo chất trình sắc ký  Sắc ký hấp phụ  Sắc ký rây phân tử  Sắc ký phân bố  Sắc ký lực  Sắc ký trao đổi ion  Sắc ký cặp ion Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng sắc ký  Sắc ký khí sắc ký lỏng hiệu cao Thời gian lưu tR (phút): thời gian cần thiết để chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector cho peak sắc ký đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất đỉnh peak)  tM (hoặc to): thời gian lưu chất không bò lưu giữ, gọi thời gian chết  tR lớn, chất tan bò lưu giữ mạnh tốc độ di chuyển nhỏ  Thời gian lưu hiệu chỉnh t'R tính theo công thức: t'R = tR - tM (hay t'R = tR - to) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng sắc ký  Sắc ký khí sắc ký lỏng hiệu cao * Hai chất giống phải có tR t’R * Hai chất phải có thể tích tiêm mẫu triển khai điều kiện sắc ký Nếu trục hoành sắc ký đồ sử dụng đơn vò đo thể tích dung môi: - thể tích lưu VR - thể tích lưu hiệu chỉnh V'R - thể tích chết cột VM (thể tích rỗng Vo): thể tích dung môi từ nơi tiêm cột đến detector Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng sắc ký  Đònh lượng Nguyên tắc chung: dựa so sánh chiều cao diện tích pic mẫu thử với hay nhiều mẫu chuẩn  Pic hẹp đối xứng: đo chiều cao pic  Pic tù hay lệch phương: đo diện tích pic  Phương pháp đònh lượng  Xây dựng đường chuẩn (chuẩn ngoại nhiều điểm)  So sánh trực tiếp (chuẩn ngoại điểm)  Thêm chuẩn  Nội chuẩn  Chuẩn hóa diện tích Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng sắc ký  Dùng đường chuẩn (chuẩn ngoại nhiều điểm)  Pha dung dòch chuẩn có nồng độ khác  Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn  Vẽ đường chuẩn độ biểu diễn phụ thuộc chiều cao hay diện tích pic theo nồng độ  Tiến hành sắc ký mẫu thử Dựa vào đường chuẩn suy nồng độ mẫu thử Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng sắc ký  So sánh trực tiếp (chuẩn ngoại điểm)  Phân tích chiều cao pic: hx Cx  Co ho ho: Chieàu cao pic chuẩn, hx: Chiều cao pic thử  Phân tích diện tích pic: Sx Cx  Co So: Diện tích pic chuẩn, Sx: Diện tích pic thử So C0 Cx gần kết xác Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp định lượng HPLC  Phương pháp nội chuẩn  Kết phân tích khơng lặp lại áp dụng phương pháp ngoại chuẩn (xử lý mẫu qua nhiều giai đoạn, hàm lượng chất phân tích thấp hay thể tích tiêm mẫu khơng lặp lại)  Ngun tắc  Thêm hàm lượng chất chuẩn khác (chuẩn nội) với chất cần định lượng vào mẫu thử chuẩn  Mẫu phân tích gồm nhiều chất: chọn chất làm chuẩn nội  Tỷ số diện tích pic chất phân tích chuẩn nội thơng số sử dụng để xây dựng đường chuẩn (S/SIS, C)  Yêu cầu chuẩn nội  Pic chuẩn nội phải tách khỏi pic thành phần khác  tR chuẩn nội phải gần với tR chất phân tích  Nồng độ chuẩn nội thêm vào gần nồng độ chất phân tích Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp định lượng HPLC  Phương pháp nội chuẩn  Độ nhạy phát chuẩn nội chất phân tích thường khác  Xác định yếu tố hiệu chỉnh Fs chuẩn nội chất phân tích  Sử dụng dung dịch chuẩn tinh khiết S i  Cs Fs  S s  Ci - Cs: nồng độ dung dịch chuẩn ngoại - Ci: nồng độ dung dịch chuẩn nội - Ss: diện tích đỉnh chuẩn ngoại - Si: diện tích đỉnh chuẩn nội  Nồng độ Cx mẫu thử có diện tích đỉnh Sx Sx Cx  Ci Fs Si Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp định lượng HPLC  Phương pháp thêm chuẩn  Thêm lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử  Nồng độ Cx mẫu thử có diện tích pic Sx  Thêm C vào làm tăng S C Cx  S x S  Áp dụng có ảnh hưởng chất phụ Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp định lượng HPLC  Phương pháp qui 100% diện tích pic  Hay áp dụng để xác định độ tinh khiết hoạt chất  Yêu cầu  Mọi cấu tử hỗn hợp cần phân tích phải rửa giải, phát tách hoàn toàn  Sự đáp ứng đầu dò cấu tử Ax 100 %X  Ax  Ay  Az Nguyễn Đức Tuấn - % X: giá trị % cấu tử X hỗn hợp X, Y, Z - Ax, Ay, Az: diện tích pic cấu tử X, Y, Z Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng HPLC KN dược liệu HCTN Định lượng dược liệu HCTN – Khơng có chất chuẩn  Áp dụng phương pháp qui 100% diện tích (xác định độ tinh khiết sắc ký)  Yêu cầu: tất chất mẫu thử phải tách phát  Giả định: chất hỗn hợp tiêm vào máy HPLC cho pic  Khối lượng chất pic tìm thấy [S1/(S1 + S2 + … + Sn)] x M M: tổng khối lượng chất tan mẫu tiêm  Ứng dụng hạn chế định lượng đa thành phần  Có thể áp dụng để định lượng gần HCTN có độ tinh khiết cao  Pic dung môi pic tương ứng với chất phân tích  Tỷ lệ % diện tích pic cho biết hàm lượng tương đối chất  Nên sử dụng pha động làm dung môi pha mẫu thử Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng HPLC KN dược liệu HCTN Xác định độ tinh khiết Kiểm tra độ tinh khiết ginsenosid-Rg1 trước sau tinh chế Cột Supelcosil LC-18 (250 x 4,6 mm; µm); Pha động: MeOH – H2O (60:40); F = 0,9 ml/phút; Đầu dò PDA: 203 nm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi lên độ phân giải 30% MeOH 40% MeOH 50% MeOH 70% MeOH 60% MeOH Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ảnh hưởng dung môi lên độ phân giải 50% MeOH 50% H2O Nguyễn Đức Tuấn 32% THF 68% H2O 25% THF 17% MeOH 58% H2O Đại học Y Dược TPHCM Ảnh hưởng pha tĩnh lên độ phân giải Cột C18 Cột phenyl Cột cyano A cortison; B dexamethason; C corticosteron; D orthonitrophenol; E flourobenzen Bước sóng phát hiện: 254 nm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng sắc ký  Phương pháp nội chuẩn  Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic Thuốc bảo vệ thực vật lân hữu Nguyễn Đức Tuấn Các dẫn chất nitro benzen Methyl parathion Ciodrin Parathion Dyfonat Diazinon EPN Ronnel Trithion (nội chuẩn) Đại học Y Dược TPHCM ... mỏng  Sắc ký giấy Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phân loại phương pháp sắc ký  Theo chất trình sắc ký  Sắc ký hấp phụ  Sắc ký rây phân tử  Sắc ký phân bố  Sắc ký lực  Sắc ký trao.. .Đại Cương Về Sắc Ký Mục tiêu - Trình bày đònh nghóa sắc ký, giai đoạn trình sắc ký, phân loại sắc ký, hai yếu tố chủ yếu đònh trình tách sắc ký, nguyên tắc sắc ký hấp phụ, phân... phương pháp sắc ký - Sự tách sắc ký sắc ký đồ - Các thông số đặc trưng sắc ký - Ứng dụng sắc ký Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Lòch sử - Đònh nghóa  1906: Mikhail Tswett – sắc ký lỏng hấp