Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguồn phân lập Nguồn mẫu phân lập: đất mùn, đất ruộng, đất thịt, phân trùng quế thu nhận nhiều địa điểm khác Kiên Giang, An Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An, Tây Ninh, Đồng Nai, Thành Phố Hồ Chí Minh (phụ lục 1) 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 2.1.2.1 Thiết bị thông dụng Bể ổn nhiệt Cole Parmer BT-15 Máy Votex Scientific Industries Bộ điện di Protein Biorad Máy li tâm Hettich EBA 20 Bộ điện di DNA Cole Pamer Máy li tâm Hettich Mikro 20 Bếp Microwave Máy nước cất Aquatron Cân phân tích A&D HR-200 Máy đo OD Cole Parmer 1100 RS Spectrophotometer Đèn soi UV UVitec Máy PCR Thermocycler Kính hiển vi Nikon eclipse 80i Máy khuấy từ Cole Palmer Nồi hấp vô trùng Hirayama HVA-85 Máy đo pH Tủ ấm Sanyo Incubator MIR-162 Tủ sấy Tủ cấy vô trùng Sanyo MCV-710 ATS Pipepman, đầu tip, eppendorf, cốc thủy tinh, đèn cồn, bóp cao su, que tạo giếng thạch 2.1.2.2 Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí Ống nghiệm kị khí Hungate, parafin lỏng, cysteine hydrochloride, chất thị oxy hóa-khử resazurin Bộ thiết bị kị khí: bình khí hydrogen, bình hỗn hợp khí 80% N2 20% CO2, điều khiển luồng khí Sanshin GR-8, thiết bị quay roll tube, đầu kim thổi khí 29 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 2.1.2.3 Mơi trường Mơi trường phân lập CT (DSMZ 122) (NH4)2SO4 1.3g MgCl2.6H2O 2.6g KH2PO4 1.43g CaCl2.2H2O 0.13g NaCO3 5g FeSO4.7H2O 1.1mg Cysteine hydrochloride 1.5g Yeast extract 4.5g Resazurin 0.1% 1ml Cellulose tinh thể 10g Nước cất 1000ml pH 7.0 - 7.2 Môi trường chuẩn bị điều kiện thổi khí N2 CO2 Hấp khử trùng 121oC, 15 phút Môi trường CT agar cải biên (NH4)2SO4 1.3g MgCl2.6H2O 2.6g KH2PO4 1.43g CaCl2.2H2O 0.13g NaCO3 5g FeSO4.7H2O 1.1mg Cysteine hydrochloride 1.5g Yeast extract 4.5g Resazurin 0.1% 1ml Glucose 10g Nước cất 1000ml pH 7.0 - 7.2 30 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Mơi trường chuẩn bị điều kiện thổi khí N2 CO2 Hấp khử trùng 121oC, 15 phút Môi trường khảo sát hoạt tính cellulase PCS Trypton 5g Yeast extract 1g NaCl 5g CaCO3 5g Giấy lọc 1x6mm (50mg) 20 miếng Rơm rạ xay nhuyễn 10g Cysteine hydrochloride 1.5g Resazurin 0.1% 1ml Nước cất 1000ml pH 7.0 - 7.2 Môi trường chuẩn bị điều kiện thổi khí N2 CO2 Hấp khử trùng 121oC, 15 phút [42] CMC agar 1% CMC 1g Agar 17g Nước cất 1000ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút 2.1.2.4 Dung Dịch Hóa Chất Dung dịch ly giải cellulosome (cellulosome lysis buffer): đệm Natri acetate 50 mM (pH 5.0), DTT 10 mM, EDTA 10 mM SDS 0.2% [11] Dung dịch đệm PBS buffer: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g hòa tan khoảng 800ml nước cất, điều chỉnh pH 7.4 với HCl NaOH, thêm nước lít Thuốc nhuộm congo red 0.1%: congo red 1g, pH 7.6±0.2, nước cất 1lít Thuốc nhuộm Gram 31 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun o Dung dịch crystal violet: 2g tím kết tinh hòa tan 20ml ethanol 95%, 0,8g ammon oxalat hòa tan 80ml nước cất Trộn hai dịch nói lại với nhau, giữ 48 lọc Bảo quản lọ tối [8] o Dung dịch iod: Hoà tan 1g iod 3-5ml nước cất, thêm 2g KI khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản lọ tối [8] o Dung dịch safranin: nghiền 0.25g safranin cối sứ với 10ml ethanol 95%, rửa nước cất thu gộp nước rửa vào ống đong Bổ sung nước cất cho đủ 100ml [8] Thuốc nhuộm bào tử o Dung dịch lục malachite bão hoà 7,6% [8] o Dung dịch safranin 0,5% [8] Thuốc thử Bradford o Thuốc thử coomassie blue G250: 5mg coomassie, 22.5g ethanol, 43.5g H3PO4, 500 ml nước cất [3], [4] o Dung dịch albumin gốc: 10mg/ml, pha dãy nồng độ albumin chuẩn từ dung dịch gốc với nồng độ từ 10-90 µg/ml [3], [4] Hóa chất xác định hoạt tính cellulase tổng số o Thuốc thử DNS: hòa tan 10.6g DNS 9.8g NaOH 1416ml nước cất Sau hòa tan hồn tồn, thêm 306g sodium potassium tartrate, 7.6ml phenol (500C), 8.3g sodium metabisulfite, trộn [44] o Đệm citrate 1M, pH 4.5: hòa tan 210g citric acid monohydrate 750ml nước cất, thêm 10-60g NaOH pH 4.3 Hòa tan hỗn hợp đến gần 1000ml kiểm tra pH cuối, dùng NaOH điều pH đến 4.5 [44] o Đệm citrate 50mM, pH 5: hòa tan đệm citrate 1M pH 4.5 19 lần nước cất [44] o Giấy lọc: 50mg/miếng, 1x6mm [44] o Dung dịch glucose chuẩn: 10g/l [44] Hóa chất điện di SDS – PAGE Hóa chất điện di o Tris-HCl 2M, pH 8.8: Tris 24.2g, thêm 50ml nước cất, thêm HCl đậm đặc pH 8.8 sau thêm nước cho đủ 100ml [3], [4], [36], [10] 32 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun o Tris-HCl 1M, pH 6.8: Tris 12.1g, thêm 50ml nước cất, thêm HCl đậm đặc pH 6.8 sau thêm nước cho đủ 100ml [3], [4], [36], [10] o Ammonium persulfate 10%: ammonium persulfate 1g, nước cất 10ml [3], [4], [36], [10] o Electrophoresis buffer: Tris 3g, glycine 14.4g, SDS 1g, thêm nước cất lít [3], [4], [36], [10] o Separating gel 9%: acrylamide stock 30% 3ml, Tris-HCl 2M pH 8.8 2.5ml, TEMED 5µl, nước khử ion 4.945ml, ammonium persulfalt 10% 50µl [3], [4], [36], [10] o Stacking gel 5%: acrylamide stock 30% 0.67ml, Tris-HCl 1M pH 6.8 1ml, TEMED 4µl, nước khử ion 2.3ml, ammonium persulfalt 10% 20µl [3], [4], [36], [10] Hóa chất nạp mẫu protein o 5x sample buffer: Tris-HCl 1M 0.6 ml, glycerol 50% 5ml, SDS 10% 2ml, 2-mercaptoethanol 0.5ml, bromophenol blue 1% 1ml, nước cất 0.9ml [3], [4], [36], [10] Hóa chất nhuộm giải nhộm protein o Thuốc nhuộm coomassie blue: coomassie blue R-250 1g, methanol 450ml, glacial acetic acid 100ml, nước cất 450ml [3], [4], [36], [10] o Thuốc giải nhuộm gel coomassie blue: methanol 100ml, glacial acetic acid 100ml, nước cất 800ml [3], [4], [36], [10] Hóa chất hồi tính nhộm CMC o Hóa chất hồi tính protein sau điện di SDS-PAGE: Tris-HCl buffer 0.0625 M pH 6.8, sodium acetate buffer pH 4.8 [36] o CMC ( % ): CMC 1g, 100ml đệm sodium acetate, pH [36] Thang chuẩn protein (161-0304, Low range Biorad) Protein Trọng lượng phân tử (Daltons) Phosphorylase b 97.400 Serum albumin 66.200 Ovalbumin 45.000 33 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Carbonic anhydrase 31.000 Trypsin inhibitor 21.500 Lysozyme 14.000 Dung dịch đệm Citrate buffer (pH 3-6.2) o Dung dịch Citric acid 0.1M: 21.01g, nước cất lít [2] o Dung dịch Trinatri Citrate 0.1M: 29.41g, nước cất lít [2] Giá trị pH Dung dịch Citric acid 0.1M (ml) 33 20.5 9.5 Dung dịch Citrate trinatri 0.1M (ml) 17 29.5 40.5 Dung dịch đệm Tris-HCl (pH 7-9) o Dung dịch Tris 0.2M: 24.24g, nước cất lít [2] o Dung dịch HCl 0.2M: 16.8ml HCl 37%, nước cất lít [2] Giá trị pH Dung dịch Tris 0.2M (ml) 50 50 50 Dung dịch HCl 0.2M (ml) 44.2 26.8 Hóa chất phản ứng PCR o Thành phần phản ứng PCR: DNA khuôn mẫu, dNTP 2.5mM, mồi xuôi 10mM, mồi ngược 10mM, MgCl2 50mM, 10X amonium buffer, Tag polymerase, nước khử ion o Hóa chất tách DNA trực tiếp: DNAzol® Direct o Trình tự mồi sử dụng: [20], [32] Primer Trình tự Vị trí Chun biệt 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 8-27 16S rDNA 1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ 1492-1533 16S rDNA Primer Trình tự (5’-3’) Vị trí Chun biệt S-G-Clos-0586-S-21 CTCAACTTGGGTGCTGCATTT 586 - 607 Clostridium S-G-Clos-1205-A-21 ATTGTAGTACGTGTGTAGCCC 1205 - 1226 Clostridium 34 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Hóa chất điện di DNA o Agarose Sigma o Ethidium Bromide: 10mg/ml o TAE buffer 50X: tris 242g acetic acid 57.1ml, EDTA 0.5M pH 8, 100ml, thêm nước cất cho đủ 1000ml Từ dung dịch mẹ pha loãng thành TAE buffer 1X o 10X loading buffer: 0.25% bromophenol blue, 40% glycerol TAE buffer 1X o Thang chuẩn D0428 Sigma (Kb): 10, 8, 6, ,4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5 Bộ kit tinh sản phẩm PCR The illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit: cột GFX, Capture buffer, Washing buffer, colection buffer (Tris-HCl nước cất) 2.1.2.5 Chủng vi khuẩn đối chứng o E coli DH5α o C saccharobutylicum 2.2 Phương pháp thực 2.1.1 Phương pháp tạo mơi trường kị khí Mục đích Loại bỏ oxy chuẩn bị môi truờng cho nuôi cấy vi khuẩn kị khí Mơi trường đun nóng sục hỗn hợp khí N2 CO2 đẩy oxy khỏi môi trường chất thị resazurin chuyển từ màu hồng sang không màu Trong môi trường nuôi cấy, tác nhân khử (cysteine hydrochloride Lglutathione) thêm vào để làm giảm oxy hố-khử mơi trường pH môi trường trùng vào khoảng 7.0±0.2 Để giữ pH mong muốn ổn định trùng nên chỉnh pH cao 0.1-0.2 đơn vị pH mong muốn Những ống mơi trường có màu hồng sau trùng bị loại bỏ Phương pháp thực o Cân trọng lượng thành phần môi trường cần pha 35 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun o Hồ tan thành phần mơi trường vào erlen nước cất cho thể tích mơi trường gần với thể tích erlen o Chỉnh pH mơi trường giá trị mong muốn o Đậy kín bình erlen giấy bạc cho ống sục khí N2 CO2 qua miếng giấy bạc o Tiến hành vừa sục khí vừa khuấy máy khuấy từ nhiệt độ 60oC môi trường chuyển dần từ màu hồng sang không màu o Làm lạnh môi trường đến khoảng nhiệt độ phòng thêm tác nhân khử vào mơi trường o Tiếp tục sục khí khuấy máy khuấy từ nhiệt độ 60oC môi trường chuyển dần từ màu hồng sang không màu o Phân phối môi trường vào ống nghiệm Hungate sục khí vào ống nghiệm để tạo mơi trường kị khí o Nhẹ nhàng đậy kín nắp ống Hungate đem hấp khử trùng 121oC 15 phút o Môi trường giữ điều kiện tránh ánh sáng sử dụng trước resazurin chuyển sang màu hồng Kết Môi trường ống nghiệm kị khí khơng màu 2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase Mục đích Sử dụng phương pháp ống roll tube (1950, Hungate) môi trường phân lập có cellulase tinh thể (CT agar) cho ni cấy vi khuẩn kị khí, sinh cellulase Trong ống roll tube, mơi trường hình thành lớp màng mỏng mơi trường thành ống Hungate Sau ủ với thời gian thích hợp hình thành vòng phân giải cellulose tinh thể ống roll tube Tiến hành thu nhận khuẩn lạc làm môi trường thạch nghiêng CT agar cải biên Cách thực o Cân 1g mẫu tiến hành pha lỗng 10ml mơi trường CT lỏng điều kiện kị khí đến độ pha lỗng 10-3 36 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Nguyên o Cấy 0.5ml dịch pha loãng vào ống nghiệm Hungate có 7.5ml mơi trường CT agar làm tan chảy để nguội nhiệt độ khoảng 6070oC o Xoay tròn ống nghiệm dụng cụ xoay tròn với tốc độ 60 vòng/phút nước lạnh agar đông o Nuôi cấy thời gian 7-10 ngày nhiệt độ 60oC o Quan sát khả tạo vòng phân giải cellulase tinh thể ống roll tube cấy truyền sang môi trường thạch nghiêng Kết Thu nhận khuẩn lạc ống roll tube có vòng phân giải cellulase tinh thể 2.2.2 Đặc điểm sinh lí hình thái vi khuẩn 2.2.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc Mục đích Ghi nhận hình thành, màu sắc, kích thước khuẩn lạc sau 10 ngày nuôi cấy môi trường thạch nghiêng CT agar cải biên Cách tiến hành o Cấy ria chủng vi khuẩn phân giải cellulose tinh thể môi trường CT agar cải biên o Nuôi cấy nhiệt độ 60oC 10 ngày o Quan sát khả hình thành khuẩn lạc 7-10 ngày Kết Ghi nhận hình thành, màu sắc, kích thước khuẩn lạc 2.2.2.2 Phương pháp nhuộm Gram Mục đích Thí nghiệm thực theo phương pháp Hucker cải tiến [8] Nhuộm Gram phương pháp nhằm phân biệt lồi vi khuẩn thành nhóm: Gram dương Gram âm, dựa đặc tính hố lý thành tế bào Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dầy, dạng lưới cấu tạo peptidoglycan, chất 37 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun có khả giữ phức hợp tím tinh thể iod Trong đó, lớp thành tế bào peptidoglycan vi khuẩn Gram âm mỏng thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên [8] Nhuộm Gram dựa khả bắt màu tế bào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh lugol Dựa vào phản ứng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng [8] Ngồi nhuộm Gram giúp ta quan sát rõ phân biệt hình dáng, cấu tạo, cách phân bố vi khuẩn khác [8] Cách thực o Nuôi cấy chủng vi khuẩn môi trường CT cải biên lỏng 10 ngày o Hút 0.1ml môi trường cố định tế bào lam kính o Nhuộm tế bào vi khuẩn crystal violet 20 giây, dùng nước cất vô trùng rửa vết nhuộm o Nhuộm lại dung dịch iodine phút Đổ thuốc nhuộm iodine, tẩy màu với alcohol 95% 10-20 giây Ngừng rửa vết nhuộm bị màu, rửa nước giây o Nhuộm dung dịch safranin 2-3 phút, dùng nước cất vô trùng rửa vài giây, thấm nước với giấy thấm để khô tự nhiên o Xem mẫu vật kính hiển vi với độ phóng đại 100X Kết Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng 2.2.2.3 Phương pháp nhuộm bào tử Mục đích Thí nghiệm thực theo phương pháp Schaeffer-Fulton [8] Nội bào tử tạo nhiều lồi vi khuẩn, đáng ý hai giống Clostridium Bacillus Những cấu trúc bảo vệ hình thành để đáp ứng với điều kiện khắc nghiệt môi trường như: nhiệt độ, khan nước, chất hóa học, thay đổi pH thiếu chất dinh dưỡng Khi tồn hình thức bào tử, vi khuẩn không biến dưỡng sinh sản, chúng tồn dạng không hoạt 38 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun động Khi điều kiện mơi trường trở nên thích hợp, nội bào tử “nảy mầm” trở lại hình thức hoạt động vi khuẩn Những kĩ thuật nhuộm thông thường nhuộm Gram, không nhuộm cấu trúc cứng bền Để nhuộm bào tử, malachite green dùng để nhuộm bào tử nhiệt độ cao Phương pháp Schaeffer-Fulton dùng malachite green nhuộm bào tử safranin nhuộm phần sinh dưỡng tế bào [8] Cách thực o Vi khuẩn kị khí sinh cellulase ni mơi trường CT cải biên lỏng 30 ngày o Dùng pipepman đưa 100µl dịch ni cấy lên lam kính o Phủ lên mảnh giấy thấm nhỏ thấm ướt với malachite green Xông nước sôi khoảng 5-10 phút vết nhuộm malachite khô o Sau miếng lam làm nguội loại bỏ giấy thấm rửa với nước 30 giây o Nhuộm với safranin khoảng 20 giây, rửa nhanh với nước cất để loại bỏ safranin o Làm khô vết trải với giấy thấm kiểm tra khả tạo bào tử kinh hiển vi Kết Nội bào tử có màu xanh tế bào sinh dưỡng có màu hồng 2.2.3 Khảo sát khả sinh cellulase mơi trường PCS Mục đích Điều kiện phát triển ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính thủy giải cellulose vi khuẩn Để vi sinh vật tổng hợp cellulase mơi trường ni cấy phải có cellulose vừa nguồn carbon vừa chất cảm ứng C thermocellum điều hòa sản xuất cellulase phụ thuộc vào nguồn carbon nguồn lượng có sẵn Mức độ sản xuất enzyme c a o nguồn carbon lượng có sẵn bị giới hạn có diện cellulose tinh thể Các nguồn carbon thường dùng nuôi cấy tổng hợp cellulase giấy lọc, giấy báo… phế thải công nông nghiệp 39 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun rơm rạ, bã mía… Nhiều lồi vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase có phạm vi rộng việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau: cellulose tinh thể, hemicellulose, pectin, tinh bột, lignin Trong mơi trường ni cấy có nguồn chất giới hạn chúng biểu enzym mà có khả sử dụng nguồn carbon Thử nghiệm nhằm xác định khả sinh trưởng vi khuẩn môi trường có rơm rạ giấy lọc nguồn carbon Sơ đồ thí nghiệm: Dịch ni cấy sau 20 ngày Xử lý Cellulosome lysis buffer Lọc qua giấy lọc Lọc qua giấy lọc Ly tâm Ly tâm Bã rơm rạ giấy lọc Tủa protein Dịch lọc Cân, xác định trọng lượng Dịch tủa protein (A) Dịch tủa protein (B) Cách tiến hành Các chủng nuôi cấy môi trường PCS quan sát khả sử dụng giấy lọc rơm rạ q trình ni cấy Sau 20 ngày, dịch nuôi cấy lọc qua giấy lọc Phần dịch ly tâm 5000 vòng/ phút phút, loại bỏ tủa thu dịch lỏng Dịch lỏng tủa với cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:3, ly tâm 13000 vòng/phút phút thu nhận tủa hòa tan 5ml đệm PBS buffer (Dung dịch protein A) Sau 20 ngày, dịch nuôi cấy xử lý dung dịch cellulosome lysis buffer 30 phút, lắc nhẹ máy lắc lọc qua giấy lọc Phần dịch ly tâm 40 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 5000 vòng/ phút phút loại bỏ tủa, thu dịch lỏng Phần dịch tủa với cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:3, ly tâm 13000 vòng/phút phút thu nhận tủa hòa tan 5ml đệm PBS buffer (Dung dịch protein B) Phần cặn sấy khô 60oC, cân trọng lượng giấy lọc rơm rạ Xác định phần trăm trọng lượng giấy lọc rơm rạ bị giảm so với đối chứng không Dung dịch protein A B sử dụng để: o Định lượng hoạt tính cellulase tổng số o Định lượng cellulase ngoại bào o Bán định lượng hoạt tính endoglucanase đĩa thạch CMC o Xác định vạch phân giải CMC SDS-PAGE o Xác định hoạt tính cellulase tối ưu 2.2.3.1 Khả sử dụng giấy lọc Mục đích Xác định % giấy lọc tiêu thụ sau 20 ngày nuôi cấy Cách thực Phần giấy lọc sấy khô 60oC, cân trọng lượng giấy lọc lại xác định phần trăm trọng lượng giấy lọc bị giảm so với đối chứng không Kết Xác định % giấy lọc tiêu thụ 2.2.3.2 Khả sử dụng rơm rạ Mục đích Xác định % rơm rạ tiêu thụ sau 20 ngày nuôi cấy Cách thực Phần rơm rạ sấy khơ 60oC, cân trọng lượng rơm rạ lại xác định phần trăm trọng lượng giấy lọc bị giảm so với đối chứng không Kết Xác định % rơm rạ tiêu thụ 41 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 2.2.3.3 Xác định hàm lượng protein ngoại bào Mục đích Nguyên tắc dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm coomassie blue G250 tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, chưa kết nối với protein thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465nm, kết hợp với protein thuốc nhuộm hấp thu cực đại bước sóng 595nm Độ hấp bước sóng 595nm có liên hệ cách trực tiếp với nồng độ protein Phương pháp thực đơn giản, nhanh chóng xác phương pháp Lowry [3] Xác định hàm lượng protein ngoại bào sinh sau nuôi cấy môi trường PCS medium So sánh lượng protein A B thu Cách thực o Chuẩn bị mẫu protein: dung dịch protein A B thu nhận sử dụng cho định lượng protein ngoại bào Các mẫu enzym pha loãng 50 lần cho định lượng o Dựng đường chuẩn: Xây dựng đường chuẩn protein với nồng độ từ 10-90µg/ml Dùng micropipet hút 1ml dung dịch albumin chuẩn với nồng độ cho vào ống nghiệm Thêm vào ống nghiệm chứa albumin 2ml dung dịch thuốc thử coomassie, trộn đo độ hấp thu máy đo OD Cole Parmer 1100 RS Spectrophotometer bước sóng 595nm Ống blank tiến hành song song, thay 1ml dung dịch albumin 1ml nước cất o Tiến hành phản ứng: Hút 1ml mẫu pha loãng 50 lần cho vào ống nghiệm Thêm 2ml thuốc thử coomassie blue, lắc Đo độ hấp thu máy quang phổ bước sóng 595nm Kết Hàm lượng protein (µg/ml) xác định 1ml dịch ni cấy Hàm lượng protein =A*n*V (µg/ml dịch ni cấy) Trong đó: + A: Lượng protein mẫu xác định từ đường chuẩn (µg/ml) + V: thể tích pha loãng mẫu (ml) + n: 42 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 2.2.3.4 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số Mục đích Hệ thống cellulase tổng số bao gồm hoạt tính ba loại enzym: endoglucanase, exoglucanase β-glucosidase Hoạt tính cellulase tổng số ln đo chất khơng hòa tan bao gồm loại chất cellulose tinh khiết: giấy lọc Whatman No.1, cellulose tinh thể, cellulose vi khuẩn, cellulose tảo chất chứa cellulose: α- cellulose, lignocellulose tiền xử lý [44] Thử nghiệm giấy lọc (FPA) thử nghiệm hoạt tính cellulase tổng số sử dụng IUPAC Thử nghiệm dựa mức độ chuyển đổi chất giấy lọc thành đường khử (được xác định dựa đường khử tạo đo thuốc thử DNS) phóng thích từ 50mg giấy lọc thời gian cố định 60 phút [44] Hoạt tính cellulase tổng số tính theo đơn vị FPU/ml dung dịch enzym ban đầu Ưu điểm phương pháp nguồn chất sử dụng phong phú Tuy nhiên thử nghiệm giấy lọc phức tạp có sai số lớn [44] Cách thực o Đặt cuộn giấy lọc cuộn tròn vào ống nghiệm o Thêm 1ml dung dịch đệm citrate 50mM (pH 4.8) vào ống nghiệm, cuộn giấy lọc phải ngập hết dung dịch đệm o Chuẩn bị dịch enzym: dịch nuôi cấy vi khuẩn môi trường PCS sau 20 ngày, dung dịch protein A B sử dụng để xác định hoạt tính enzym Cả hai dung dịch pha loãng 10 lần cho xác định hoạt tính enzym cellulase o Dung dịch glucose chuẩn (GSs) với nồng độ từ 100-900 µg/ml o Chuẩn bị ống Blank ống control Reagent blank (RB): 1.5ml đệm citrate 50mM Enzym controls (EC): 1ml đệm citrate 50mM + 0.5ml enzym Substrate controls (SC): 1.5ml đệm citrate 50mM + mảnh giấy lọc o Dung dịch enzym E, RB, EC, SC cân nhiệt độ 50oC o Thêm 0.5ml dung dịch enzym vào ống nghiệm có chất giấy lọc E, 0.5ml dung dịch enzym vào ống nghiệm khơng có chất giấy lọc EC 43 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun o Ủ ống E, GSs, RB, EC, SC bể điều nhiệt 50oC 60 phút để thực phản ứng o Thêm 3ml DNS reagent để ngừng phản ứng trộn o Đun cách thủy ống nghiệm phút o Chuyển ống nghiệm vào nước lạnh để làm nguội o Hút 0.5ml dung dịch thí nghiệm vào effendorf 1.5ml ly tâm 10000 vòng/ phút phút o Sau ly tâm, hút 0.2ml dung dịch phía vào ống nghiệm khác thêm 2.5ml nước cất trộn o Đem đo độ hấp thụ bước sóng 540nm RB sử dụng làm ống blank Kết Dựng đường chuẩn glucose (trục x: hàm lượng glucose, trục y: OD540) Tính OD540nm ∆E = E - [(EC) + (SC)] Tính nồng độ glucose giải phóng dựa theo đường chuẩn glucose Tính FPA dung dịch enzym gốc ban đầu theo đơn vị FPU/ml FPU = lượng glucose phóng thích x 0.185 1mg glucose = 1mg/(0.18mg/µmol)x0.5mlx60min = 0.185 µmol/min/ml 2.2.3.5 Bán định lượng hoạt tính endoglucanase Mục đích Hoạt tính endoglucanase bán định lượng đĩa thạch chứa CMC Các phân tử polysaccharide dài hấp thụ số loại thuốc nhuộm có congo red Trên đĩa thạch chứa CMC, đĩa thạch congo red nhuộm màu đỏ Khi CMC bị thủy phân hoạt tính endoglucanase, thuốc nhuộm congo red giải phóng tạo vòng phân giải đĩa thạch Hoạt tính endoglucanase mạnh vòng phân giải lớn [44] Bán định lượng hoạt tính endoglucanase phân giải CMC đĩa thạch, so sánh hoạt tính endoglucanase dung dịch protein A protein B Cách thực o Tạo lỗ nhỏ khoảng 4mm đĩa thạch CMC 44 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun o Hút lượng dung dịch protein A protein B cho lượng protein giếng 30 µg o Ủ nhiệt độ 50oC 24 o Nhuộm đĩa thạch với 20ml thuốc nhuộm congo red 1% 30 phút, rửa đĩa thạch nước cất o Rửa giải thuốc nhuộm congo red thạch dung dịch giải nhuộm NaCl 1M 30 phút Kết Ghi nhận so sánh vòng phân giải dung dịch protein A B đĩa thạch 2.2.3.6 Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ gel polyacrylamide Vi khuẩn kị khí sinh cellulase sản xuất enzym phụ thuộc vào nguồn carbon nguồn lượng có sẵn Mức độ sản xuất enzyme c a o nguồn carbon lượng có sẵn bị giới hạn có diện cellulose tinh thể Sự biểu gen điều kiện giới hạn carbon cao điều kiện hạn nitrogen, cho thấy tác động lớn nguồn carbon biểu gen Trong mơi trường PCS có nguồn carbon giấy lọc rơm rạ cho chủng vi khuẩn biểu nhiều enzym cho việc sử dụng nguồn carbon Vì vậy, thực điện di SDS- PAGE thủy phân CMC gel với mục đích: o Xác định hàm lượng protein tối ưu thủy phân CMC gel polyacrylamide o Xác định khác biệt dung dịch protein A Protein B o Xác định khả thủy phân CMC gel polyacrylamide chủng khảo sát SDS-PAGE, kỹ thuật sử dụng rộng rãi sinh hóa để phân tách protein tùy theo trọng lượng phân tử SDS liên kết với phần kị nước protein, với 2-mercaptoethanol phá vỡ cấu trúc cho phép chúng tồn bền vững dạng thẳng Đồng thời, SDS gắn vào phân tử protein làm chúng tích điện âm Kết protein tồn dạng thẳng cấu trúc bậc tích điện âm Chúng 45 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun di chuyển phía cực dương đặt điện trường [2], [3] Dưới tác dụng điện trường, protein đặt môi trường đặc biệt cho phép chúng di chuyển theo tỷ lệ khác tùy theo trọng lượng chúng Môi trường thường sử dụng gel polyacrylamide, polymer tạo nên đơn phân acrylamide Trong gel polyacrylamide, chúng hình thành nên hệ thống kênh có kích thước khác mà cho phép phân tử protein có kích thước nhỏ di chuyển nhanh phân tử protein có kích thước lớn di chuyển chậm Kết hình thành nên vạch protein có kích thước khác gel phát theo nhiều phương pháp khác [2], [3] Để đưa phân tử mẫu vạch xuất phát đồng thời tạo phân tách tốt, người ta thường dùng phương pháp điện di không liên tục Theo phương pháp gel thường có lớp [2], [3]: o Lớp gel gom (stacking gel): protein mẫu dồn lại tạo thành băng mỏng o Lớp gel phân tách (separating gel): tạo băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác từ hỗn hợp protein xuất phát ban đầu Phân tử lượng protein xác định so sánh với thang phân tử lượng protein chuẩn, hỗn hợp protein có phân tử lượng biết Lượng protein mẫu điện di tối ưu nằm khoảng 20-40µg [2], [3] Điện di SDS-PAGE phân tách thành phần protein phát hoạt tính endoglucanase gel polyacrylamide Khi SDS-PAGE sử dụng, hoạt tính endoglucanase phát sau loại bỏ SDS làm hồi tính protein dung dịch đệm hồi tính protein Khả phân giải CMC gel polyacrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hoạt tính enzym, nồng độ enzym thời gian thủy phân CMC 46 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 2.2.3.6.1 Lượng protein tối ưu thủy phân CMC o Thực điện di SDS-PAGE với mẫu protein B chủng TQ1-2 pha loãng 1, 2, 4, lần đệm PBS buffer o Hồi tính protein buffer hồi tính thủy giải CMC gel o Xác định vạch phân giải CMC gel o Kết luận hàm lượng protein tối ưu cho khả phân giải CMC gel polyacrylamide (xem thêm phụ lục 3) 2.2.3.6.2 Sự khác biệt dung dịch protein A protein B o Thực điện di SDS-PAGE sử dụng dung dịch Protein A protein B chủng khảo sát Các dung dịch enzym pha loãng theo hàm lượng xác định phần 2.2.3.6.1 đệm PBS buffer o Nhuộm gel polyacrylamide thuốc nhuộm coomassie blue o Xác định kích thước vạch protein gel polyacrylamide (xem thêm phụ lục 3) 2.2.3.6.3 Khả thủy phân CMC chủng o Thực điện di SDS-PAGE sử dụng mẫu protein A mẫu protein B chủng khảo sát Các dung dịch protein mẫu tính tốn cho lượng protein xác định phần 2.2.3.6.1 lần đệm PBS buffer o Sau điện di, hồi tính protein buffer hồi tính thủy giải CMC gel o Xác định vạch phân giải gel o Đối chiếu với thang chuẩn xây dựng từ xác định vạch phân giải CMC gel (xem thêm phụ lục 3) 47 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 2.2.3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh cellulase o Nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát môi trường PCS o Tại thời điểm 4, 8, 12, 16, 20 ngày thu nhận 5ml dịch nuôi cấy o Xử lý với Cellulosome lysis buffer tủa protein o Định lượng hoạt tính cellulase tổng số chủng khảo sát phương pháp DNS thời điểm nuôi cấy 4, 8, 12, 16, 20 ngày (cách thực theo mục 2.2.3.4) o Phản ứng enzym thực nhiệt độ 50oC o Sử dụng dung dịch đệm citrate 50mM, pH o Xác định thời gian ni cấy tối ưu cho hoạt tính enzym cellulase 2.2.3.8 Tối ưu hóa hoạt tính enzym cellulase Các emzym cellulase thu từ nguồn khác có điều kiện phản ứng tối ưu khác Nhiệt độ, pH hai yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính cellulase Do đó, điều kiện tối ưu cho hoạt tính cellulase cần xác định Trong thí nghiệm dung dịch protein B sử dụng 2.2.3.8.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase o Định lượng hoạt tính cellulase tổng số chủng khảo sát phương pháp DNS nhiệt độ phản ứng khác 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC (cách thực theo mục 2.2.3.4) o Sử dụng dung dịch đệm citrate 50mM, pH o Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzym cellulase 2.2.3.8.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase o Định lượng hoạt tính cellulase tổng số chủng khảo sát phương pháp DNS dung dịch đệm có pH khác 3, 4, 5, 6, 7, 8, (cách thực theo mục 2.2.3.4) 48 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun o Sử dụng dung dịch đệm Citrate buffer pH 3, 4, 5, dung dịch đệm Tris-HCl pH 7, 8, o Phản ứng enzym thực nhiệt độ 50oC o Xác định pH tối ưu cho hoạt tính enzym cellulase 2.2.4 Định danh vi khuẩn Các chủng vi khuẩn có nhiều nhu cầu dinh dưỡng tăng trưởng tương khó cho việc định danh theo phương pháp truyền thống dựa vào đặc điểm sinh lý hình thái, sinh hóa Hiện việc ứng dụng sinh học phân tử nhằm phân biệt loài vi sinh vật nói chung lồi vi khuẩn nói riêng ngày nên phổ biến Do tính bảo tồn cao vùng gen DNA ribosome mã hóa cho tiểu phần 16S nên đoạn gen vùng thường dùng làm công cụ cho việc định danh Hai cặp mồi universal cặp mồi S-G-Clos-0586-S21 S-G-Clos-1205-A-21 sử dụng cho việc định danh khóa luận Sơ đồ thí nghiệm: Chủng vi khuẩn Phản ứng PCR S-G-Clos-0586- Phản ứng PCR 27f 1492r S-21 S-G-Clos-1205-A-21 Kiểm tra kết PCR gel agerose Kiểm tra kết PCR gel agerose Tinh sản phẩm PCR Kết luận vi khuẩn thuộc giống Clostridium Giải trình tự xây dựng phát sinh loài Phản ứng PCR kỹ thuật sinh học phân tử để khuếch đại trình tự DNA tạo hàng ngàn trình tự DNA mục tiêu Trong phản ứng PCR, DNA polymerase có khả tổng hợp mạch từ khn mẫu DNA điều kiện invitro Khi enzym hoạt động chúng tổng hợp mạch theo khuôn mẫu đoạn oligonucleotide mồi theo chiều 3’-5’ Mồi đoạn 49 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun oligonucleotide có khả bắt cặp với mạch khuôn Khi cung cấp hai cặp mồi (mồi xuôi mồi ngược) có khả bắt cặp chuyên biệt với hai đầu trình tự DNA, phản ứng PCR nhân trình tự hai mồi Phản ứng PCR gồm bước: biến tính, bắt cặp kéo dài, ba bước nêu hình thành chu kì PCR Để tạo thành lượng lớn DNA cần lặp lại nhiều chu kì kết tạo lượng lớn trình tự khn mẫu DNAzol® Direct hóa chất sử dụng rộng rãi cho phản ứng PCR mà không cần phân tách DNA Q trình thực đơn giản, tốn thời gian, cơng sức khuếch đai đoạn DNA lên đến Kb Sản phẩm PCR phân tích kỹ thuật điện di gel agarose Vị trí DNA gel phát thuốc nhuộm ethidium bromide, chất có khả gắn vào DNA phát huỳnh quang tia tử ngoại Để biết kích thước trình tự DNA người ta sử dụng thang chuẩn, tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết Trước giải trình tự, sản phẩm PCR cần tinh Bộ kit The illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit sử dụng cho mục đích tinh DNA nhanh chóng Bộ kit tinh đoạn DNA có kích thước từ 50bp đến 40Kb từ phản ứng PCR gel agarose 2.2.4.1 Định danh nhanh vi khuẩn phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium Mục đích Đối với vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase, phần lớn chúng thuộc Clostridiales có quan hệ gần với giống Clostridium Cặp mồi S-G-Clos-0586S-21 S-G-Clos-1205-A-21 có khả khuếch đại từ base 586 - 1205 rDNA 16S tạo sản phẩm dài 619 base đặc hiệu cho giống Clostridium Cặp mồi Menaja cộng (1996) sử dụng để xác định loài thuộc giống Clostridium Dùng phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại gen 16S rDNA giống Clostridium để xác định chủng vi khuẩn khảo sát Cặp mồi cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích thước 619 bp Chủng vi khuẩn C.Sbu 50 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun dùng làm chủng đối chứng dương chủng vi khuẩn E.coli làm chủng đối chứng âm cho phản ứng PCR [32] Cách thực o Thực PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 S-G-Clos-1205A-21 o Quy trình thực PCR cho cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 S-GClos-1205-A-21 thiết lập sau: 95°C phút để phân tách hồn tồn DNA; 30 chu trình 95°C 30 giây, 54°C 30 giây, 72°C 60 giây chu trình cuối 72°C 10 phút o Điện di sản phẩm PCR gel Agarose 1% với hiệu điện 115 volt 45 phút o Quan sát kết tia UV, đối chiều với thang chuẩn để xác định kích thước sản phẩm PCR (xem thêm phụ lục 3) Kết Kết dương tính chủng thuộc giống Clostridium âm tính với chủng khơng thuộc giống Clostridium 2.2.4.2 Phản ứng PCR với cặp mồi universal xây dựng phân loại Mục đích Cặp mồi universal cho phép khuếch đại toàn đoạn gen 16S rRNA từ nhiều loài vi khuẩn, dùng nghiên cứu hầu hết loài vi khuẩn môi trường Cặp mồi tạo đoạn sản phẩm PCR dài khoảng 1526 bp Chủng vi khuẩn E.Coli dùng làm chủng đối chứng dương [20], [32] Phương pháp giải trình tự đoạn gen khuếch đại cặp mồi universal xây dựng phát sinh chủng loài trở nên phổ biến định danh vi khuẩn Cây phân loại loài xây dựng dựa kết hợp sinh học phân tử với phần mềm phân tích máy tính Dựa vào phân tích, mối liên hệ tiến hóa chủng khảo sát chủng ngân hàng liệu xác định 51 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Cách thực o Thực phản ứng PCR với cặp mồi universal với quy trình thực PCR thiết lập sau: 95°C phút để phân tách hoàn toàn DNA; 30 chu trình 95°C 30 giây, 55°C 60 giây 72°C phút chu trình cuối 72°C 10 phút o Điện di sản phẩm PCR agarose 1% với hiệu điện 115 volt 45 phút o Quan sát kết tia UV, đối chiếu với thang chuẩn để xác định kích thước sản phẩm PCR o So sánh với kết với đối chứng dương ghi nhận kết o Sản phẩm phản ứng PCR với cặp mồi universal tinh với Kit The illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit gửi giải trình tự cơng ty Nam Khoa BIOTEK o Kết giải trình tự so sánh với trình tự ngân hàng liệu gen cách sử dụng chương trình BLAST trang chủ NCBI Ghi nhận lồi có số trình tự tương đồng cao o Sử dụng phần mềm ClustalX để xắp xếp hàng Treeview để xây dựng phát sinh chủng loài cặp mồi universal (xem thêm phụ lục 3) Kết Dựa vào kết BLAST phân loại, xác định mối quan hệ tiến hóa lồi phân loại 950C 720C 550C Hình 2.1 Quy trình phản ứng PCR với cặp mồi universal 52 ... 2.2.4 Định danh vi khuẩn Các chủng vi khuẩn có nhiều nhu cầu dinh dưỡng tăng trưởng tương khó cho vi c định danh theo phương pháp truyền thống dựa vào đặc điểm sinh lý hình thái, sinh hóa Hiện vi c... ứng PCR gel agarose 2.2.4.1 Định danh nhanh vi khuẩn phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium Mục đích Đối với vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase, phần lớn chúng thuộc... pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase Mục đích Sử dụng phương pháp ống roll tube (1950, Hungate) mơi trường phân lập có cellulase tinh thể (CT agar) cho ni cấy vi khuẩn kị khí, sinh cellulase