BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN (GMF – GENETICALLY MODIFIED FOOD) BẰNG KỸ THUẬT DUPLEX REAL – TIME PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN QUỐC HUY Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN (GMF – GENETICALLY MODIFIED FOOD) BẰNG KỸ THUẬT DUPLEX REAL – TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN QUỐC HUY ThS TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Ban Lãnh Đạo Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3, Phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Văn Biết, ThS Phạm Vân An, ThS Trần Thị Ánh Nguyệt, CN Chu Nguyên Thanh chị phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi chu đáo suốt thời gian thực đề tài hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, xin cảm ơn quý Thầy, Cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trường, cảm ơn tập thể lớp DH08SH chia sẻ, động viên suốt thời gian học tập thực đề tài tốt nghiệp Và sau cùng, xin cảm ơn Ba, Mẹ khuyến khích, tạo điều kiện cho học tập Cám ơn gia đình thân u ln chỗ dựa vững cho vững bước qua khó khăn Xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 07 năm 2012 Nguyễn Quốc Huy i TĨM TẮT Ngày nay, sản phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen thương mại hóa ngày nhiều thị trường, lợi ích tác hại chúng chưa xác định rõ Do đó, vấn đề quản lý kiểm soát sản phẩm trở nên cần thiết Xuất phát từ thực tế đó, tơi thực đề tài “Xây dựng quy trình sàng lọc thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen kỹ thuật Duplex Real-time PCR”, nhằm thiết lập quy trình thử nghiệm phát đồng thời trình tự promoter 35S terminator nos phản ứng, có khả áp dụng phòng thí nghiệm GMO Việt Nam Đề tài gồm ba nội dung chính, khảo sát phương pháp tách chiết DNA loại mẫu khác nhau, tối ưu hóa phương pháp Duplex Real-time PCR đánh giá khả hoạt động phương pháp thông qua việc xác định độ đặc hiệu độ nhạy Các kết ghi nhận cho thấy phương pháp tách chiết DNA sử dụng CTAB cho hiệu tốt nhiều so với phương pháp phenol/chloroform bản, nhiên không phát DNA mẫu nước tương, dầu ăn Trong phản ứng Duplex Real-time PCR, nồng độ primer tối ưu để khuếch đại vùng promoter 35S terminator nos 0,3 µM; nồng độ probe tối ưu để phát vùng promoter 35S terminator nos 0,1 µM 0,3 µM; nồng độ MgCl2 tối ưu 1,5 mM Phương pháp Duplex Real-time PCR xây dựng có độ nhạy độ đặc hiệu cao, giá trị LOD thu ≤ 0,05%, không xuất hiện tượng dương tính giả hay âm tính giả ii SUMMARY Thesis title “Establishing a screening process for GMF (genetically modified foods) by Duplex Real-time PCR method” Today, the products derived from genetically modified organisms have been increasingly commercialized on the market, while their benefits and harms have not been clearly defined Therefore, control and management issues for these products are very necessary For this fact, the thesis “Establishing a screening process for GMF (genetically modified foods) by Duplex Real-time PCR method” was performed, with the purpose of establishing a testing process to detect simultanously nos terminator and 35S promoter sequences in only one reaction, so that the results of the research can be applied in laboratories for testing GMO in Vietnam The thesis includes three main contents, which are survey of the different DNA extraction methods on many sample matrices, optimization of the Duplex Real-time PCR condition and evaluation of the performance of this method through determining the sensitivity and specifictity The results indicated that the DNA extraction method using CTAB was better than the phenol/chloroform basis method, but it also could not detect DNA in samples of soy sauce and cooking oil For one optimized Duplex Real-time PCR reaction, the primer concentrations were 0.3 µM for amplification of 35S promoter and nos terminator sequences; the probe concentrations were 0.1 µM and 0.3 µM respectively for detection of 35S promoter and nos terminator sequences; and the MgCl2 concentration was 1.5 mM The designed Duplex Real-time PCR method showed good sensitivity and specificity, LOD value was less than or equal to 0.05%, and there was no case of the false positive as well as false negative result Key words: DNA extraction, Duplex Real-time PCR, GMF, GMO, 35S promoter, nos terminator iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen 2.1.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gen 2.1.2 Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen 2.2 Quá trình tạo sinh vật biến đổi gen 2.2.1 Quá trình 2.2.2 Cấu trúc gen chuyển vào thực vật 2.2.2.1 Promoter 2.2.2.2 Terminator 2.2.2.3 Marker chọn lọc 2.2.2.4 Gen mục tiêu chuyển vào thực vật 2.2.3 Thành tựu chuyển nạp gen vào trồng 2.2.3.1 Các đặc tính nơng nghiệp trồng biến đổi gen 2.2.3.2 Các đặc tính chất lượng trồng biến đổi gen 2.3 2.3.1 Lợi ích tác hại trồng biến đổi gen Lợi ích trồng biến đổi gen iv 2.3.2 Tác hại trồng biến đổi gen 2.3.2.1 Các rủi ro gặp 2.3.2.2 Tác hại môi trường 10 2.3.2.3 Tác hại sức khỏe người tiêu dùng 10 2.3.2.4 Các nghiên cứu dẫn chứng cụ thể 11 2.4 Hiện trạng trồng biến đổi gen 12 2.4.1 Hiện trạng trồng biến đổi gen giới 12 2.4.2 Hiện trạng trồng biến đổi gen Việt Nam 13 2.5 Dư luận xã hội trồng biến đổi gen 14 2.6 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen 15 2.6.1 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen giới 15 2.6.2 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen Việt Nam 16 2.7 Các phương pháp kiểm định sinh vật biến đổi gen 16 2.7.1 Phương pháp kiểm định dựa vào protein 17 2.7.1.1 Phương pháp ELISA 17 2.7.1.2 Phương pháp Western Blot 17 2.7.1.3 Phương pháp Lateral flow strip 18 2.7.2 Phương pháp kiểm định dựa vào DNA 18 2.7.2.1 Phương pháp PCR 19 2.7.2.2 Phương pháp PCR đa thành phần 19 2.7.2.3 Phương pháp PCR định lượng cạnh tranh 19 2.7.2.4 Phương pháp Real-time PCR 19 2.7.3 Mức độ chuyên biệt kiểm định sinh vật biến đổi gen 21 2.7.3.1 Phương pháp sàng lọc (Screening methods) 21 2.7.3.2 Phương pháp chuyên biệt gen (Gene-specific methods) 22 2.7.3.3 Phương pháp chuyên biệt cấu trúc (construct-specific methods) 22 2.7.3.4 Phương pháp chuyên biệt kiện (event-specific methods) 22 2.8 2.8.1 Các nghiên cứu nước kiểm định GMO kỹ thuật PCR 23 Các nghiên cứu nước kiểm định GMO kỹ thuật PCR 23 v Các nghiên cứu nước kiểm định GMO Real-time PCR 23 2.8.2 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.2 Vật liệu thí nghiệm 24 3.2.1 Hóa chất 24 3.2.1.1 Hóa chất dùng tách chiết DNA 24 3.2.1.2 Hóa chất dùng điện di 24 3.2.1.3 Hóa chất dùng phản ứng Real-time PCR 25 3.2.2 Dụng cụ thiết bị 25 3.2.3 Mẫu thí nghiệm 25 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Khảo sát phương pháp tách chiết DNA 26 3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu 26 3.3.1.2 Khảo sát phương pháp tách chiết DNA 27 3.3.1.3 Phân tích sản phẩm DNA sau tách chiết 29 3.3.2 Tối ưu phương pháp Duplex Real-time PCR 29 3.3.2.1 Tối ưu nồng độ primer 30 3.3.2.2 Tối ưu nồng độ probe 31 3.3.2.3 Tối ưu nồng độ MgCl2 32 3.3.3 Đánh giá phương pháp Duplex Real-time PCR 32 3.3.3.1 Xác định độ đặc hiệu phương pháp 32 3.3.3.2 Xác định độ nhạy phương pháp 34 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Khảo sát phương pháp tách chiết DNA 35 4.2 Tối ưu hóa phương pháp Duplex Real-time PCR 37 4.2.1 Tối ưu hóa nồng độ primer 37 4.2.1.1 Tối ưu hóa nồng độ primer cho promoter 35S 37 4.2.1.2 Tối ưu hóa nồng độ primer cho terminator nos 38 4.2.2 Tối ưu hóa nồng độ probe 39 vi 4.2.2.1 Tối ưu hóa nồng độ probe cho promoter 35S 39 4.2.2.2 Tối ưu hóa nồng độ probe cho terminator nos 40 4.2.3 Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 41 4.3 Đánh giá phản ứng Duplex Real-time PCR 42 4.3.1 Xác định độ đặc hiệu phương pháp 43 4.3.2 Xác định độ nhạy phương pháp 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 53 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABI: Applied Biosystem Bt: Bacillus thuringiensis CaMV: Cauliflower mosaic virus (virus khảm súp lơ) CP: Coat protein (protein vỏ) CRM: Certified reference material (Vật liệu chuẩn chứng nhận) Ct: Threshold cycle (Chu kỳ ngưỡng) CTAB: Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide ctv: Cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleic acid dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates EC: European Community (Cộng đồng châu Âu) EDTA: Ethylendiamin Tetraacetic Acid EEA: European Environment Agency (Cơ quan môi trường châu Âu) ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay EU: European Union (Liên minh châu Âu) FN: False negative (Âm tính giả) FP: False positive (Dương tính giả) GMC: Genetically modified crop (Cây trồng biến đổi gen) GMF: Genetically modified food (Thực phẩm biến đổi gen) GMO: Genetically modified organism (Sinh vật biến đổi gen) ISO: International Organization for Standardization (Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế) LOD: Limit of detection (Giới hạn phát hiện) No.: Number (số) Nos: Nopaline synthetase NT: Nghiệm thức viii Well Sample Name Detector Task Ct A1 0,1 TMP Unknown 29,6093 B1 0,1 TMP Unknown 29,4242 C1 0,1 TMP Unknown 29,4849 D1 0,3 TMP Unknown 29,343 E1 0,3 TMP Unknown 29,0228 F1 0,3 TMP Unknown 29,0232 G1 0,5 TMP Unknown 29,2346 H1 0,5 TMP Unknown 29,2305 A2 0,5 TMP Unknown 29,0636 B2 0,7 TMP Unknown 29,1504 C2 0,7 TMP Unknown 29,1608 D2 0,7 TMP Unknown 29,3688 E2 0,9 TMP Unknown 29,4444 F3 0,9 TMP Unknown 29,2733 G3 0,9 TMP Unknown 29,2164 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tối ưu nồng độ primer cho P-35S StdDev Ct 0.0944 0.0944 0.0944 0.185 0.185 0.185 0.0975 0.0975 0.0975 0.123 0.123 0.123 0.119 0.119 0.119 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.262 0.066 4.096 0.0321 Within 10 0.160 0.016 Total 14 0.423 Coefficient of Variation = 0.43% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tối ưu nồng độ primer cho P-35S kết bảng Original Order Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 29.51 29.13 29.18 29.22 29.31 Ranked Order A B B B AB Mean Mean Mean Mean Mean 1= 5= 4= 3= 2= 29.51 A 29.31 AB 29.22 B 29.18 B 29.13 B Phụ lục 8: Tối ưu nồng độ primer cho terminator nos Hình Đồ thị khuếch đại tối ưu hóa nồng độ primer cho terminator nos Document Name: Toi uu primer 35S_05032012 Document Name: toi uu primer T-nos_19032012 Plate Type: Standard Curve User: Administrator Document Information Operator: Administrator Run Date: Monday March 19 2012 09:35:52 Instrument Type: Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Exporting Mode: Based on Selected Wells and Report Setting Comments: SDS v1.4 Stage Thermal Cycler Profile Repetitions Temperature 95.0 °C 40 95.0 °C 60.0 °C Time 10:00 0:15 1:00 Ramp Rate Auto Increment 100 100 100 Standard 7500 Mode Data Collection : Stage Step PCR Volume: 25 µL Well Sample Name Detector Task Ct A1 0,1 Probe nos Unknown 31,0131 B1 0,1 Probe nos Unknown 30,182 C1 0,1 Probe nos Unknown 30,4972 D1 0,3 Probe nos Unknown 28,8654 E1 0,3 Probe nos Unknown 28,7159 F1 0,3 Probe nos Unknown 28,8766 G1 0,5 Probe nos Unknown 28,7041 H1 0,5 Probe nos Unknown 29,024 A2 0,5 Probe nos Unknown 28,7964 B2 0,7 Probe nos Unknown 28,6274 C2 0,7 Probe nos Unknown 28,5014 D2 0,7 Probe nos Unknown 28,4473 E2 0,9 Probe nos Unknown 28,4245 F3 0,9 Probe nos Unknown 28,6386 G3 0,9 Probe nos Unknown 28,5628 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tối ưu nồng độ primer cho T-nos StdDev Ct 0,4196 0,4196 0,4196 0,0897 0,0897 0,0897 0,1646 0,1646 0,1646 0,0924 0,0924 0,0924 0,1086 0,1086 0,1086 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 8.766 2.191 47.333 0.0000 Within 10 0.463 0.046 Total 14 9.229 Coefficient of Variation = 0.74% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tối ưu nồng độ primer cho T-nos kết bảng Original Order Mean = 30.56 Mean = 28.82 Mean = 28.84 Mean = 28.52 Mean = 28.54 A B B B B Ranked Order Mean = 30.56 Mean = 28.84 Mean = 28.82 Mean = 28.54 Mean = 28.52 A B B B B Phụ lục 9: Tối ưu nồng độ probe cho promoter 35S Hình Đồ thị khuếch đại tối ưu hóa nồng độ probe cho promoter 35S Document Name: toi uu probe-35S_03042012 Plate Type: Standard Curve User: Administrator Document Information Operator: Administrator Run Date: Monday April 03 2012 09:45:17 Instrument Type: Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Exporting Mode: Based on Selected Wells and Report Setting Comments: SDS v1.4 Thermal Cycler Profile Ramp Auto Stage Repetitions Temperature Time Rate Increment 1 95.0 °C 10:00 100 40 95.0 °C 60.0 °C 0:15 1:00 100 100 Standard 7500 Mode Data Collection : Stage Step PCR Volume: 25 µL Well Sample Detector Name Task Ct StdDev Ct A1 0,1 TMP Unknown 29,5969 0,1360 B1 0,1 TMP Unknown 29,385 0,1360 C1 0,1 TMP Unknown 29,3434 0,1360 D1 0,3 TMP Unknown 29,4793 0,1589 E1 0,3 TMP Unknown 29,4213 0,1589 F1 0,3 TMP Unknown 29,1797 0,1589 G1 0,5 TMP Unknown 29,284 0,0936 H1 0,5 TMP Unknown 29,1102 0,0936 H2 0,5 TMP Unknown 29,1369 0,0936 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tối ưu nồng độ probe cho P-35S ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between Within 0.110 0.105 0.055 3.152 0.1160 0.017 Total 0.215 Coefficient of Variation = 0.45% Phụ lục 10: Tối ưu nồng độ probe cho terminator nos Hình Đồ thị khuếch đại tối ưu hóa nồng độ probe cho terminator nos Document Name: toi uu probe Nos_20032012 Plate Type: Standard Curve User: Administrator Document Information Operator: Administrator Run Date: Tuesday March 20 2012 09:25:01 Instrument Type: Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Exporting Mode: Based on Selected Wells and Report Setting Comments: SDS v1.4 Thermal Cycler Profile Stage Repetitions Temperature Time Ramp Rate Auto Increment 95.0 °C 40 95.0 °C 60.0 °C 10:00 0:15 1:00 100 100 100 Standard 7500 Mode Data Collection : Stage Step PCR Volume: 25 µL Well Sample Name Detector Task Ct StdDev Ct A1 0,1 Probe nos Unknown 28,8665 0,2257 B1 0,1 Probe nos Unknown 29,1942 0,2257 C1 0,1 Probe nos Unknown 29,2992 0,2257 D1 0,3 Probe nos Unknown 28,6318 0,1029 E1 0,3 Probe nos Unknown 28,7909 0,1029 F1 0,3 Probe nos Unknown 28,8245 0,1029 G1 0,5 Probe nos Unknown 28,5333 0,2018 H1 0,5 Probe nos Unknown 28,8263 0,2018 H2 0,5 Probe nos Unknown 28,9201 0,2018 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tối ưu nồng độ probe cho T-nos ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between Within 0.267 0.204 0.134 3.927 0.0812 0.034 Total 0.472 Coefficient of Variation = 0.64% Phụ lục 11: Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 Hình Đồ thị khuếch đại tối ưu hóa nồng độ MgCl2 Document Name: toi uu MgCl2_25042012 Plate Type: Standard Curve User: Administrator Document Information Operator: Administrator Run Date: Wednesday April-25 2012 14:41:48 Instrument Type: Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Exporting Mode: Based on Selected Wells and Report Setting Comments: SDS v1.4 Thermal Cycler Profile Ramp Auto Stage Repetitions Temperature Time Rate Increment 1 95.0 °C 10:00 100 40 95.0 °C 0:15 100 60.0 °C 1:00 100 Standard 7500 Mode Data Collection : Stage Step PCR Volume: 25 µL Well A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 A2 B2 Sample Name 1,5 1,5 1,5 2,5 2,5 2,5 3,5 3,5 3,5 4,5 4,5 4,5 5,5 5,5 5,5 1,5 1,5 1,5 2,5 2,5 2,5 3,5 3,5 3,5 4,5 Detector TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Task Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Ct StdDev Ct 28,2014 0,1133 28,4085 0,1133 28,2251 0,1133 27,5299 0,2974 28,0262 0,2974 28,0619 0,2974 28,0791 0,2497 27,6258 0,2497 28,0341 0,2497 27,9766 0,1048 27,8294 0,1048 28,0321 0,1048 27,5082 0,2348 27,6023 0,2348 27,9536 0,2348 29,1472 0,0532 29,252 0,0532 29,2151 0,0532 28,7872 0,2127 28,3826 0,2127 28,471 0,2127 28,0186 0,1863 28,3911 0,1863 28,1994 0,1863 28,662 0,3781 C2 D2 E2 F2 G2 4,5 4,5 5,5 5,5 5,5 Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown 27,9283 28,4538 28,3437 28,3441 28,5823 0,3781 0,3781 0,1376 0,1376 0,1376 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tối ưu nồng độ MgCl2 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob Factor A 1.968 0.492 10.3675 0.0001 Factor B 2.750 2.750 57.9361 0.0000 AB 0.399 0.100 2.0990 0.1189 -7 Error 20 0.949 0.047 Total 29 6.066 Coefficient of Variation: 0.77% Bảng 10 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tối ưu nồng độ MgCl2 yếu tố MgCl2 kết bảng 11 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 28.74 28.21 28.06 28.15 28.06 Ranked Order A B B B B Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 4= 3= 5= 28.74 28.21 28.15 28.06 28.06 A B B B B Phụ lục 12: Xác định độ đặc hiệu phương pháp Duplex Real-time PCR Hình Xác định độ đặc hiệu phương pháp Duplex Real-time PCR Document Name: Xac hieu_30.05.2012 Plate Type: Standard Curve User: Administrator dinh dac Document Information Operator: Administrator Run Date: Wednesday May-30 2012 09:10:25 Instrument Type: Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Exporting Mode: Based on Selected Wells and Report Setting Comments: SDS v1.4 Thermal Cycler Profile Stage Repetitions Temperature 1 95.0 °C Time 10:00 Ramp Rate 100 40 95.0 °C 60.0 °C 0:15 1:00 100 100 Standard 7500 Mode Data Collection : Stage Step PCR Volume: 25 µL Detector TMP Probe nos Well A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 H2 A3 B3 C3 D3 E3 F3 G3 H3 A1 Reporter FAM VIC Sample Name RRS RRS Bt11 Bt11 MON 531 MON 531 NK603 NK603 MON 89034 MON 89034 MON 863 MON 863 Bt176 Bt176 MON 810 MON 810 RiceLL62 RiceLL62 1507 1507 LY 038 LY 038 GA 21 GA 21 RRS Start (Auto) (Auto) End (Auto) (Auto) Threshold 0,0374593 Auto:0.00944625 Detector Task Ct StdDev Ct TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown 22,4458 22,1984 25,3125 25,2928 31,6013 32,1155 28,0831 28,3704 0,2545 0,2545 0,0384 0,0384 0,3557 0,3557 0,2169 0,2169 TMP Unknown 29,9138 0,0246 TMP Unknown 29,7454 0,0246 TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP Probe nos Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown 34,2953 34,2489 30,7718 30,8238 31,0795 30,821 33,5871 34,4968 27,7316 27,6534 Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined 22,8343 0,0368 0,0368 0,0720 0,0720 0,2039 0,2039 0,6494 0,6494 0,0656 0,0656 0,3549 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 H2 A3 B3 C3 D3 E3 F3 G3 H3 RRS Bt11 Bt11 MON 531 MON 531 NK603 NK603 MON 89034 MON 89034 Mon 863 Mon 863 Bt176 Bt176 MON 810 MON 810 RiceLL62 RiceLL62 1507 1507 LY 038 LY 038 GA 21 GA 21 Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown 23,3362 26,2208 26,2007 26,5353 26,5801 29,2497 29,1472 0,3549 0,0142 0,0142 0,0317 0,0317 0,0725 0,0725 Probe nos Unknown 30,8864 0,0105 Probe nos Unknown 30,9013 0,0105 Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown 34,9655 35,0581 Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined 39,7727 Undetermined Undetermined Undetermined 39,2759 Undetermined 33 33,0325 0,0655 0,0655 0,0230 0,0230 Phụ lục 13: Xác định độ nhạy phương pháp Duplex Real-time PCR Hình Xác định độ nhạy phương pháp Duplex Real-time PCR Document Name: Xac dinh LOD_15.06.2012 Plate Type: Standard Curve User: Administrator Document Information Operator: Administrator Run Date: Friday June-15 2012 09:57:27 Instrument Type: Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Exporting Mode: Based on Selected Wells and Report Setting Comments: SDS v1.4 Thermal Cycler Profile Ramp Stage Repetitions Temperature Time Rate 1 95.0 °C 10:00 100 40 95.0 °C 0:15 100 60.0 °C 1:00 100 Standard 7500 Mode Data Collection : Stage Step Auto Increment PCR Volume: 25 µL Detector Reporter Start End TMP FAM (Auto) (Auto) Probe nos VIC (Auto) (Auto) Detector Task TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP TMP Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Probe nos Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Unknown Well A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 A2 B2 C2 D2 A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 A2 B2 C2 D2 Sample Name GMO 1% GMO 1% GMO 0,5% GMO 0,5% GMO 0,1% GMO 0,1% GMO 0,05% GMO 0,05% GMO 0,01% GMO 0,01% Non-GMO Non-GMO GMO 1% GMO 1% GMO 0,5% GMO 0,5% GMO 0,1% GMO 0,1% GMO 0,05% GMO 0,05% GMO 0,01% GMO 0,01% Non-GMO Non-GMO Threshold 0,028664 Auto:0.009601 Ct StdDev Ct 26,0017 0,0004 26,0012 0,0004 28,6749 0,2546 29,035 0,2546 30,4957 0,1349 30,3049 0,1349 32,134 0,3398 32,6146 0,3398 34,8653 0,1022 35,0099 0,1022 Undetermined Undetermined 27,3406 0,0002 27,3409 0,0002 30,3182 0,0482 30,3864 0,0482 33,4182 0,0514 33,3455 0,0514 36,7905 0,3043 36,3601 0,3043 Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined ... học Newcastle chuyển nạp gen cho thấy ăn thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen có tượng gen chuyển nạp chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột (Soil Association, 2004) Nghiên cứu Anh chuyển gen cừu... Association, 2004) Nghiên cứu Anh chuyển gen cừu cho thấy sau cừu ăn bắp chuyển gen khoảng phút, số gen chuyển di chuyển khỏi bắp “chuyển gen ngang” vào vi khuẩn miệng Một số gen chèn mã hóa cho đề kháng... cơng q trình Hình 2.1 Quy trình chuyển gen (Choi Cheong, 2004) Các bước bao gồm: Ly trích acid nucleic (DNA/RNA), dòng hóa gen, thiết kế gen cho trình chuyển gen, chuyển gen lai backcross Đây thật