Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don)

137 94 0
  • Loading ...
    Loading ...
    Loading ...

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Tài liệu liên quan

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 11/04/2018, 14:55

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) LU N ÁN TI N S SINH HỌC Thái Nguyên - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Chuyên ngành: Di truyền học số: 42 01 21 LU N ÁN TI N S SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học cơng nghệ, phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Bùi Thị Hà ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Nguyễn Thị Tâm bảo, động viên tận tình hướng dẫn suốt trình học tập, nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh học đại Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi có nhiều góp ý sâu sắc cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài nghiên cứu Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Sinh học, thầy cô cán bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Y Dược, chân thành cảm ơn đồng nghiệp Khoa Khoa học bản, Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt q trình học tập cơng tác Tơi biết ơn người thân gia đình, bạn bè động viên, quan tâm, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng 02 năm 2018 TÁC GIẢ Bùi Thị Hà iii MỤC LỤC Lời cam đoan………………………………………………… i Lời cảm ơn……………………………………………………… … ii Mục lục……………………………………………………… ………… iii Danh mục chữ viết tắt luận án…………………………… vi Danh mục bảng luận án…………………………………………… ix Danh mục hình luận án…………………………………………… xi MỞ ĐẦU………………………………………………… …………… 1.Đặt vấn đề…………………………………………………………… Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………… Nôi dung nghiên cứu……………………………………………… Những đóng góp luận án……………………………… … Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án…………………… Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………… 1.1.Alkaloid ……………………………………………… ………… 1.1.1 Vai trò alkaloid thực vật 1.1.2 Alkaloid dừa cạn………………………………………… 1.2 Sinh tổng hợp alkaloid hoạt động enzyme DAT dừa cạn 10 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp alkaloid dừa cạn………… …… 10 1.2.2 Hoạt động enzyme DAT gen DAT 16 1.3 Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid dừa cạn 18 1.3.1 Nâng cao hàm lượng alkaloid dừa cạn phương pháp iv nuôi cấy mô tế bào thực vật…………………… 18 1.3.2 Nâng cao hàm lượng alkaloid kỹ thuật chuyển gen……… 21 Chƣơng V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………… 27 2.1.1 Vật liệu thực vật………………………………………………… 27 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector……………………………… 27 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu……………………… 27 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu…………………………………… 27 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận án…………………… 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 29 2.3.1 Các phương pháp sinh học phân tử……………………………… 29 2.3.2 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 33 2.3.3 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc 37 2.3.4 Tái sinh chuyển gen gus dừa cạn 38 2.3.5 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào dừa cạn thông qua A.tumefaciens 43 2.3.6 Phương pháp phân tích chuyển gen 45 2.3.7 Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen………………………… 49 2.3.8 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu……………………… 49 Chƣơng K T QUẢ VÀ THẢO LU N………………………… 50 3.1 Đặc điểm gen CrDAT phân lập từ dừa cạn 50 3.1.1 Kết tách dòng xác định trình tự nucleotide gen v CrDAT………………………………………………………………………… 50 3.1.2 So sánh trình tự nucleotite gen CrDAT 52 3.2 Thiết kế vector chuyển gen biểu gen CrDAT thuốc 56 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT…… 56 3.2.2 Phân tích biểu gen CrDAT thuốc chuyển gen 61 3.2.3 Thảo luận kết thiết kế đánh giá hoạt động vector chuyển gen pBI121-CrDAT………………………………………………… 67 3.3 Nghiên cứu hệ thống tái sinh xây dựng quy trình chuyển gen dừa cạn 70 3.3.1 Nuôi cấy in vitro dừa cạn…………………………………… 70 3.3.2 Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen gus……………… 76 3.3.3 Kết chuyển gen gus vào dừa cạn 82 3.4 Kết chuyển gen CrDAT tạo dừa cạn chuyển gen 87 3.4.1 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT tái sinh dừa cạn chuyên gen 87 3.4.2 Xác định có mặt hợp gen chuyển CrDAT hệ gen dừa cạn chuyển gen hệ T0 89 3.4.3 Phân tích biểu protein DAT tái tổ hợp hệ T1 92 3.4.4 Thảo luận kết tăng cường biểu gen CrDAT dừa cạn chuyển gen…………………………………………………… 96 K T LU N VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………………… 100 CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIỆN QUAN Đ N LU N ÁN… 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 102 PHỤ LỤC…………………………………………………………… 119 vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VI T TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh AS Acetosyringone A Tumefaciens Agrobacterium tumefaciens A Rhizogenes Agrobacterium rhizogenes BAP Benzylaminopurine 35S Promoter CaMV 35S bp base pair Tiếng Việt Cặp bazơ nitơ cộng cs Môi trường đồng nuôi cấy CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary DNA CTAB Cetyltrimethyl ammonium Bromide CrDAT Cathanthus roseus Deacetyl vindoline 4-O-acetyltransferase DEPC Diethyl pyrocarbonate dNTP Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Phản ứng ELISA GM Germination Medium Môi trường tái sinh gus β-Glucuronidase IAA Indole Acetic acid IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside DNA bổ sung Gen CrDAT vii Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật mRNA Messenger ribonucleic acid NAA Naphthaleneacetic acid NptII Neomycyn phosphatranferaseII Gen kháng kanamycine OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RNA Ribonucleic acid RM Rooting medium Môi trường tạo rễ rCrDAT Recombinant CrDAT protein Protein DAT tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulfate SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật T0, T1 Các hệ chuyển gen T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi ống nghiệm T1 Hạt chuyển gen T0 nảy mầm thành viii T1 TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine WT Wild type X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galacto-pyranoside WHO World Health Organization Cây không chuyển gen Tổ chức y tế giới ... luận án: Nghiên cứu tăng cường biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm biểu gen mã hóa C roseus deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase... SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LU... SINH TỔNG HỢP ALKALOID VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME DAT Ở CÂY DỪA CẠN 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp alkaloid dừa cạn Trong năm gần đây, đường chuyển hóa tổng hợp alkaloid dừa cạn nghiên cứu chi tiết Ở
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don) , Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don)

Từ khóa liên quan