VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *_* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5” Giáo viên hướng dẫn : Ts.Hồ Tuyên Sinh viên thực : Nguyễn Thị Diệu Linh Lớp : 1302 Hà Nội-2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *_* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5” Giáo viên hướng dẫn : Ts.Hồ Tuyên Sinh viên thực : Nguyễn Thị Diệu Linh Lớp : 1302 Hà Nội-2017 LỜI CẢM ƠN Để thực tốt đề tài nghiên cứu này, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ tận tình từ phía gia đình, thầy cô bạn bè Trước hết xin gửi lời cảm ơn tới TS Hồ Tuyên người hướng dẫn giúp đỡ tơi thực khóa luận tốt nghiệp với cán bộ, nhân viên, sinh viên thực tập phòng Cơng nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam bảo giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn người thân gia đình, cảm ơn anh chị em, bạn bè ln động viên, khích lệ tạo động lực cho tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Diệu Linh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU PHẦN - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nattokinase 1.1.1 Nguồn gốc đặc tính nattokinase 1.1.2 Cơ chế hoạt động nattokinase 1.1.3 Ứng dụng nattokinase 1.1.4 Nguồn gốc thu nhận nattokinase 10 1.2 Tình hình nghiên cứu nattokinase Thế giới Việt Nam 11 1.2.1 Tình hình nghiên cứu Thế giới 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 12 1.3 Giới thiệu Bacillus Subtilis natto 14 1.3.1 Hệ thống phân loại phân bố tự nhiên 14 1.3.2 Đặc điểm hình thái 15 1.3.3 Đặc điểm sinh hóa 16 1.3.4 Đặc điểm nuôi cấy 17 1.4 Ảnh hưởng nguồn carbon nitơ tới sinh trưởng phát triển vi sinh vật 18 1.4.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 18 1.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 19 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận nattokinase 19 1.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 19 1.5.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường 20 1.5.3 Ảnh hưởng pH môi trường 20 ii 1.5.4 Ảnh hưởng thời gian lên men 20 1.5.5 Độ thơng khí 21 PHẦN – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 2.1.1 Chủng giống 22 2.1.2 Mơi trường hóa chất 22 2.1.3 Chất mang 23 2.1.4 Thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp xác định mơi trường có nguồn carbon nguồn nitơ tối ưu sử dụng lên men Baccilus subtilis natto 25 2.2.2 Phương pháp kết tủa nattokinase muối ammonium sulphate 26 2.2.3 Phương pháp kết tủa nattokinase acetone 27 2.2.4 Phương pháp đông khô để thu nhận enzyme tạo chế phẩm 28 PHẦN - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Lựa chọn mơi trường lên men có nguồn carbon nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp nattokinase Bacillus Subtilis Natto 30 3.1.1 Nguồn carbon 30 3.1.2 Nguồn nitơ 31 3.2 Kết xác định điều kiện thu hồi enzyme nattokinase 32 3.2.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa nattokinase có dịch lên men 32 3.2.2 Xác định nồng độ acetone thích hợp để kết tủa nattokinase có dịch lên men 32 3.3 Xác định điều kiện quy trình tạo chế phẩm nattokinase 34 3.3.1 Chất mang tạo chế phẩm 34 3.3.2 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto 36 PHẦN – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 iii 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ AA Amino acid ACE Angiotensin converting enzyme B.natto Bacillus natto B.subtilis Bacillus subtilis BSD Bột sắn dây DNA Deoxyribonucleic acid HATT Huyết áp tâm thu HATTr Huyết áp tâm trương LDL Low-density lipoprotein 10 MT Môi trường 11 NK Nattokinase 12 PAI-1 Plasminogen-Activator Inhibitor 13 Pr Protein 14 THA Tăng huyết áp 15 t-PA Tissue plasminogen activator 16 UK Urokinase 17 VSV Vi sinh vật 18 WHO Tổ chức Y tế Thế giới v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm nattokinase Bảng 1.2 Phản ứng sinh hóa Bacillus subtilis 17 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.3 Thành phần nguồn carbon nitơ môi trường MT2 25 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Natto truyền thống Nhật Bản Hình 1.2 Mơ cấu trúc khơng gian nattokinase Hình 1.3 Huyết khối hình thành thơng qua nút tiểu cầu Hình 1.4 Các tác dụng sinh lý nattokinase fibrin Hình 1.5 Mơ hệ thống phân loại Bacillus subtilis natto 14 Hình 1.6 Hình thái Bacillus subtilis 16 Hình 3.1 Ảnh hưởng nguồn carbon mơi trường lên men đến hoạt tính nattokinase B.subtilis natto 30 Hình 3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ mơi trường lên men đến hoạt tính nattokinase B.subtilis natto 31 Hình 3.3 Biểu đồ thể hoạt tính nattokinase sau tủa (NH4)2SO4 nồng độ khác 32 Hình 3.4 Biểu đồ thể hoạt tính nattokinase sau tủa acetone tỷ lệ khác 33 Hình 3.5 Ảnh hưởng loại, tỉ lệ chất mang tới khả làm tan huyết khối chế phẩm nattokinase tạo từ enzyme trộn với chất mang sau đơng khơ 34 Hình 3.6 Ảnh hưởng loại, tỉ lệ chất mang tới khả làm tan huyết khối chế phẩm nattokinase tạo từ cặn enzyme đơng khơ sau trộn với chất mang 35 Hình 3.7 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 38 vii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong thời gian gần đây, nghe nhắc nhiều đến nattokinase với nhiều tác dụng khác nhau, đặc biệt mang tới cho sức khỏe tốt hơn, nâng cao chất lượng sống người Vậy nattokinase gì? Nattokinase enzyme tìm thấy sản phẩm “Natto” - ăn truyền thống người Nhật Bản Nattokinase protease chuỗi đơn chứa 275 amino acid Hyroyuki Sumi phát thấy khả làm tan huyết khối vào năm 1980 [11] Huyết khối tượng máu đông động mạch hay tĩnh mạch nằm bên thể Cục huyết khối sản phẩm cuối q trình đơng máu Bình thường có tác dụng cầm máu trường hợp chảy máu tổn thương mạch máu (đứt rách) Khi q trình đơng máu xảy mạch máu khơng bị đứt rách gọi chứng huyết khối bệnh lý dẫn tới bệnh tim mạch như: nhồi máu tim, tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ…và nguy hiểm dẫn đến tử vong đột ngột Theo WHO năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong mắc phải bệnh tim mạch dự đốn đến 2020 số đạt tới 25 triệu người, mà nguyên nhân hậu cục máu đông (huyết khối) Theo ước tính thị trường tồn cầu thuốc làm tan huyết khối gần 14 tỉ USD [12] Các loại thuốc làm tan huyết khối Alteplase, Streptokinase, Urokinase… có hiệu lực tức sau tiêm vào tĩnh mạch Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học loại thuốc tạm thời, tồn không lâu sau tiêm, giá cao mà tác động vào triệu chứng, không chữa nguyên bệnh, đồng thời có nguy biến chứng gây xuất huyết Trong nattokinase coi thực phẩm chức hỗ trợ làm tan huyết khối sở hữu nhiều ưu điểm an toàn, chi phí thấp dễ sử dụng kèm theo khả ngăn ngừa bệnh PHẦN - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lựa chọn môi trường lên men có nguồn carbon nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp nattokinase Bacillus Subtilis Natto Chất dinh dưỡng bao gồm nguồn carbon, nguồn nitơ, muối khoáng vitamin nguyên liệu cung cấp cho trình sinh tổng hợp chất, enzyme, tạo thành phần tế bào phục vụ cho trình trao đổi lượng vi sinh vật Trong việc xác định nguồn carbon nguồn nitơ quan trọng Theo phương pháp xác định đưa mục 2.2.1 thu nhận kết sau: Lượng huyết khối tan (%) 3.1.1 Nguồn carbon 120 100 80 60 40 20 Nguồn carbon Hình 3.1 Ảnh hưởng nguồn carbon mơi trường lên men đến hoạt tính nattokinase B.subtilis natto Từ kết thu nhận được, mơi trường lên men có chứa nguồn carbon khác hoạt tính nattokinase thay đổi Cụ thể, hoạt tính enzyme cao thu hồi mơi trường lên men chứa maltose với lượng huyết tan 96%; hoạt tính enzyme giảm xuống mơi trường có nguồn carbon glucose với kết lượng huyết tan đạt 93%; hoạt 30 tính enzyme thấp 66% mơi trường có nguồn carbon dextrin Như vậy, maltose nguồn carbon tối ưu để lên men B.subtilis natto sinh tổng hợp nattokinase Lượng huyết khối tan (%) 3.1.2 Nguồn nitơ 120 100 80 60 40 20 Nguồn nitơ Hình 3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ môi trường lên men đến hoạt tính nattokinase B.subtilis natto Cũng tương tự kết phương pháp xác định nguồn carbon, mơi trường lên men có nguồn nitơ khác nhau, hoạt tính nattokinase nhu nhận thay đổi Sữa đậu nành nguồn nitơ tốt để chủng B.subtilis natto sinh tổng hợp nattokinase có hoạt tính cao làm tan 96% huyết khối; đó, lượng huyết tan thấp 59% môi trường lên men sử dụng sodium glutamate nguồn nitơ Cao nấm men casein nguồn cung cấp nitơ tốt, bổ sung vào môi trường hoạt tính nattokinase cao (trên 80%) Kết luận: Môi trường tối ưu để lên men B.subtilis natto sinh tổng hợp nattokinase MT2-a12 với thành phần: Sữa đậu nành 20,0 (g/l); Maltose 30,0 (g/l); K2HPO4 1,0 (g/l); MgSO4 0,2 (g/l); pH 7-7,2 Thời gian lên men 72 37oC 31 3.2 Kết xác định điều kiện thu hồi enzyme nattokinase 3.2.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa nattokinase có dịch lên men Sử dụng (NH4)2SO4 để tủa protein-enzyme phương pháp sử dụng đơn giản phổ biến Kết phương pháp nattokinase sau: Lượng huyết khối tan (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Đối chứng Nồng độ (NH4)2SO4 dịch lên men (%) Hình 3.3 Biểu đồ thể hoạt tính nattokinase sau tủa (NH4)2SO4 nồng độ khác Từ hình 3.3, dịch enzyme có hoạt tính cao tủa (NH4)2SO4 với nồng độ muối 50% Ở nồng đồ này, tỷ lệ huyết tan sau ủ 37oC 82% ứng với lượng huyết khối lại 18% Ở mức nồng độ muối thấp 50% enzyme thu có hoạt tính khơng cao Cụ thể, nồng độ 10% 20% muối, lượng huyết lại 55% Ở nồng độ muối cao 50% hoạt tính enzyme khơng cho kết tốt nồng độ muối cao làm biến tính enzyme nên hoạt tính khơng giữ mức ổn định 3.2.2 Xác định nồng độ acetone thích hợp để kết tủa nattokinase có dịch lên men Theo phương pháp tủa protein acetone nêu mục 2.2.3 ta có kết sau: 32 Hình 3.4 Biểu đồ thể hoạt tính nattokinase sau tủa acetone tỷ lệ khác Lượng huyết khối tan (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 1:2 1:4 1:6 1:8 Đối chứng Tỷ lệ enzyme thơ:acetone (ml/ml) Qua đồ thị (hình 3.4) ta thấy tỷ lệ dịch enzyme : acetone lượng huyết khối tan cao (86,5%) Nhìn chung, khối lượng huyết khối lại sau bổ sung enzyme tủa acetone mức thấp Phương pháp tủa acetone phương pháp thu nhận enzyme đem lại kết cao mà khơng làm hoạt tính Ở tỷ lệ acetone khác thể khả Tỷ lệ 1:2, lượng acetone so với khối lượng cặn nên không đủ để tủa protein Tại tỷ lệ cao 1:6; 1:8 phần trăm khối lượng huyết tan giảm dần theo tỉ lệ acetone bổ sung, lượng acetone nhiều hoạt tính enzyme bị giảm Như vậy, tỉ lệ dịch enzyme acetone thích hợp để tủa nattokinase 1:4 Kết luận: Qua kết hai phương pháp, ta kết luận rằng, tủa acetone giữ hoạt tính cao so với tủa muối, thể qua phần trăm khối lượng lại huyết khối Để đáp ứng nhu cầu kinh tế chất lượng sản phẩm, acetone dung môi cho giá thành rẻ so với muối (NH4)2SO4 đồng thời cho hoạt tính mức ổn định Vì tiến hành thu hồi nattokinase phương pháp tủa acetone chọn phương pháp 33 3.3 Xác định điều kiện quy trình tạo chế phẩm nattokinase 3.3.1 Chất mang tạo chế phẩm Để thu nhận chế phẩm sinh học nattokianse từ B.subtilis natto ta sử dụng phương pháp đông khô, để đánh giá khả phương pháp đơng khơ có giữ hoạt tính enzyme mức ổn định thích hợp cho việc trộn chế phẩm khơng ta đánh giá qua cách thức: Cách 1: Cặn enzyme trộn với chất mang đem đông khô, sau thử hoạt tính với huyết khối Cách 2: Cặn enzyme đơng khơ trước, sau trộn với chất mang, sau thử hoạt tính với huyết khối a, Chế phẩm tạo từ cặn enzyme trộn với chất mang đông khô Dịch lên men sau thu hồi phương pháp tủa acetone với tỉ lệ 1:4 trộn riêng rẽ với hai chất mang bột đậu tương bột sắn dây theo tỉ lệ khác sau đơng khơ Kết thể hình 3.5 Hình 3.5 Ảnh hưởng loại, tỉ lệ chất mang tới khả làm tan huyết khối chế phẩm nattokinase tạo từ enzyme trộn với chất mang sau đơng khơ Lượng huyết khối tan (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 1:1 1:2 Tỷ lệ chất mang:enzyme (g/ml) Bột đậu tương Bột sắn dây Đối chứng Từ kết thấy việc tạo chế phẩm cách trộn enzyme với bột sắn dây cho hiệu tan huyết tốt chế phẩm trộn enzyme với bột 34 đậu tương Việc giữ lại hoạt tính sau đông khô chất mang tương đối tốt tỉ lệ 1:2 đánh giá qua phần trăm khối lượng huyết khối lại Ở tỉ lệ 1:1, lượng enzyme không đủ để kết hợp với chất mang nên hoạt tính thấp, khối lượng tan đạt xấp xỉ 38% Đặc biêt, sử dụng 1g bột sắn dây trộn với 2ml dịch nattokinase hiệu tan huyết tốt, lượng huyết tan sau bổ sung chế phẩm qua nhiêt độ 37oC 88,5% b, Chế phẩm tạo từ cặn enzyme đông khô trộn với chất mang Dịch lên men sau thu hồi phương pháp tủa aceton với tỉ lệ 1:4 đơng khơ sau trộn riêng rẽ với hai chất mang bột đậu tương Hình 3.6 Ảnh hưởng loại, tỉ lệ chất mang tới khả làm tan huyết khối chế phẩm nattokinase tạo từ cặn enzyme đông khô sau trộn với chất mang Lượng huyết khối tan (%) bột sắn dây theo tỉ lệ khác Kết thu sau: 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 1:1 1:2 Tỷ lệ chất mang:enzyme (g/g) Bột đậu tương Bột sắn dây Đối chứng Qua kết thu thấy dịch lên men sau tủa acetone đông khơ trộn với chất mang chế phẩm giữ hoạt tính enzyme với tỷ lệ 1:2 cho kết tốt (89%) Sau đông khô, hoạt tính enzyme khơng giữ mức ổn định Bột sắn dây mang lại hiệu tốt khả trì hoạt tính enzyme Kết luận: Qua hai phương pháp ta thấy bột sắn dây chất mang phù hợp cho việc giữ lại hoạt tính enzyme cách tốt Chế 35 phẩm nattokinase thu cách trộn dịch bột nattokinase với bột sắn dây theo tỉ lệ 2ml dịch enzyme:1g bột sắn sau đơng khơ 2g bột enzyme đông khô:1g bột sắn dây, cho tác dụng làm tan huyết khối chế phẩm tốt 3.3.2 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto Sau trình nghiên cứu, tơi xác định quy trình công nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto (hình 3.7) với bước: Hoạt hóa chủng: Chủng B.subtilis natto sau q trình giữ giống cấy ria đĩa peptri chứa môi trường MPA rắn để hoạt hóa chủng Thời gian ni 24 tủ ấm 37oC Nhân giống: Sau chủng giống hoạt hóa, cấy B.subtilis natto vào bình tam giác chứa 100ml mơi trường MPA lỏng; ni điều kiện lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 37oC; thời gian nuôi 24 Lên men: Tiếp giống vào bình tam giác chứa 250ml mơi trường MT2 với tỉ lệ tiếp giống 5%; nuôi điều kiện lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 37oC; thời gian nuôi 72 Thu hồi dịch nattokinase thô: Ly tâm lạnh dịch sau lên men tốc độ 6000-8000 vòng/phút thời gian 5-10 phút để loại bỏ sinh khối tế bào thu dịch enzyme Tủa nattokinase thô acetone: tủa enzyme acetone với tỷ lệ dịch enzyme thô : aceton Loại bỏ acetone cách sấy gió thời gian 30-60 phút Kết thúc bước 5, thu hồi nattokinase dạng dịch đặc, có hai cách tạo chế phẩm sau: 36 Cách Cách Phối trộn: Nattokinase Đông khô: Nattokinase phối trộn với chất mang chuyển vào hệ thống đông bột sắn dây với tỷ lệ 2ml khơ thành dịch đặc sau sấy NK-1g BSD 35oC khô Đông khô: Hỗn hợp sau phối Phối trộn: Nattokinase sau trộn chuyển vào hệ đông khô dạng bột thống đông khô thành dịch phối trộn với chất mang bột đặc sau sấy 35oC cho sắn dây theo tỷ lệ 2g NK-1g đến khơ BSD Kiểm tra chất lượng hoạt tính nattokinase: Để kết thúc quy trình cần kiểm tra hoạt tính nattokinase Sản phẩm thu sau quy trình chế phẩm nattokinase 37 Chủng B.subtilis natto MPA rắn Hoạt hóa chủng MPA lỏng Nhân giống MT2 Lên men Thu hồi dịch nattokinase thô Sinh khối tế bào Tủa nattokinase thô acetone Nước + acetone Acetone Dịch đặc nattokinase Phối trộn với bột sắn dây Đông khô Đông khô Phối trộn với bột sắn dây Kiểm tra chất lượng hoạt tính nattokinase Kiểm tra chất lượng hoạt tính nattokinase Chế phẩm nattokinase Chế phẩm nattokinase Hình 3.7 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto 38 PHẦN – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau hoàn thành thí nghiệm, phân tích, xử lý số liệu đánh giá kết quả, rút kết luận sau:  Mơi trường lên men thích hợp cho chủng B.subtilis natto sinh tổng hợp nattokinase xác định gồm thành phần: Sữa đậu nành 20,0 (g/l); Maltose 30,0 (g/l); K2HPO4 1,0 (g/l); MgSO4 0,2 (g/l); pH 77,2  Enzyme nattokinase từ B.subtilis natto thu hồi tốt tủa acetone với tỷ lệ enzyme thơ:acetone 1:4  Chất mang thích hợp để tạo chế phẩm nattokinase bột sắn dây Có thể trộn dịch enzyme với bột sắn dây sau tiến hành đông khô theo tỉ lệ 2ml dịch enzyme: 1g bột sắn dây đông khô để thu bột enzyme trộn với bột sắn dây theo tỉ lệ 2g bột enzyme đông khô: 1g bột sắn dây để tạo chế phẩm nattokinase, chế phẩm thu theo hai cách cho hiệu làm tan huyết 4.2 Kiến nghị Trong trình tiến hành đề tài, hạn chế thời gian điều kiện nghiên cứu Vì vậy, tơi xin đưa số đề nghị sau:  Cần nghiên cứu thêm ảnh hưởng điều kiện môi trường nhiệt độ, độ ẩm, thời gian đến trình bảo quản chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto  Nghiên cứu tạo chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto để hướng tới thực phẩm chức 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạch Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê thị Hương, 2012 Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase Tạp chí sinh học 2012, 34(3SE): 99-104 Lý Thị Bích Thủy, Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Dao, 2006 Tinh xác định số tính chất enzym thủy phân fibrin tách chiết từ loài giun quế (Perionyx excavatus) Tạp chí Sinh học 28(3): 77-82 Vũ Hồng Diệp, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Quyền Đình Thi, 2008 Nhân dòng phân tích trình tự gene mã hóa SK từ chủng Streptococcus pyogenes DT7 Tạp chí Cơng nghệ sinh học (4A): 757-763 Quyền Đình Thi, 2010 Nghiên cứu xây dụng quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩn enzym tái tổ hợp Streptokinase yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng điều trị Viện công nghệ sinh học Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Duy Khánh, 2006 Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bảo tử vi khuẩn Bacillus Subtilis Đại học nông lâm tp.HCM Đặng Tuyết Phương, Lê Gia Hy, 2010 Enzym vi sinh vật chuyển hóa sinh học –Nguyên lý, ứng dụng Nxb Khoa học tự nhiên công nghệ, pp.82-106 Bùi Thái Hằng, Phạm Thị Thanh Mai, 2010 Công nghệ vi sinh vật Nxb Trường Cao đẳng lương thực – thực phẩm, pp.69-72 40 Nguyễn Đức Lượng, 2004 Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TPHCM 10 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phan Thị Trâu Châu, Nguyễn Lâm Dũng, 1982 Enzym vi sinh vật NSB khoa học kĩ thuật, tập Tài liệu tiếng Anh 11 Sambrook J., Russel DW., 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, NY 12 Cong W., Ming D., Dongmei Z., Fandong K., Guoren Z., Yibing F., 2009 Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B12, J.Agric.Food Chem 57: 9722-9729 13 Ruei LH., Rym A., Anissa H., Mohamed H., Fakher F., Laila M., Kemel J., Moncef N., 2009 Fibrinolytic enzymes from a newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis A26: characterization and statistical media optimization Can J Microbiol 55: 1049- 1061 14 Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., Hiratani H., 1990 Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase Acta Haematol 84(3): 139-43 15 Wei W., Li M., Wang J., Nie F., Li L., 2012 The E3 ubiquitin ligase ITCH negatively regulates canonical Wnt signaling by targeting dishevelled protein Mol Cell Biol 32(19): 3903-12 16 Kim W., Choi K., Kim Y., Park H., Choi J., Lee Y., Oh H., Kwon I., Lee S., 1996 Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang Appl Environ Microbiol 62(7): 1488-2482 17 Fujita M., Hong K., Ito Y., Misawa S., Takeuchi N., Kariya K., Nishimuro S., 1995 Transport of nattokinase across the rat intestinal tract Biol Pharm Bul1., 18: 1194-1196 41 18 Meruvu H., Vangalapati M., 2011 Nattokinase: A Review on Fibrinolytic Enzyme International Journal of Chemical, 2(1): 61-66 19 Astrup T., Mullertz S., 1952 The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity Archives of biochemistry and biophysics 40 (2): 346-351 20 Deepak V., Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Babu SV., Senthilkumar SR., Sangiliyandi G., 2008 Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology, Bioresour Technol, 99 (17): 81708174 21 Ku TW., Tsai RL., Pan TM., 2009 A simple and cost-saving approach to optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis natto J Agric Food Chem 57(1): 6-292 22 Chen PT., Chao YP., 2006 Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors Biotechnology letters 28 (19): 1595–1600 23 Peng Y., Huang Q., Zhang R H., Zhang Y Z., 2003 Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food Comp Biochem Physiol., 134: 45-52 24 Lyden P., 2005 Thrombolytic Therapy for Acute Stroke Second Edition.Humana Press Inc 25 Wang C., Ji B., Li B., Ji H., 2006a Enzymatic properties and identification of a fibrinolytic serine protease purified from Bacillus subtilis DC33 World J Microbiol Biotechnol 26 Sahelian R., Borkens., 1998 Dehydroepiandrosterone and cardiac arrhythmia Annals of internal medicin, 129 (7): 588-595 42 27 Kim JY., Gum SN., Paik JK., Lim HH., Kim K., Ogasawara K., 2008 Efcsof nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial Hypertension Research 31(8): 1583–1588 28 Chang YY., Liu JS., Lai SL., Wu HS., Lan MY., 2008 Cerebellar hemorrhage provoked by combined use of nattokinase and aspirin in a patient with cerebral microbleeds" Intern Med 47 (5): 9-467 29 Juan MY., Wu CH., Chou CC., 2010 Fermentation with Bacillus sp As a bioprocess to enhance anthocyanin content, the angiotensin converting enzyme inhibitory effect, and the reducing activity ò black soybeans, Food Microbioloogy 15: 261–266 30 Chen PT., Chiang CJ., Chao YP., 2007 Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis Biotechnol 23 (4): 808-813 31 Lee J., Park S., Choi Won A., Lee KyungHee., Jeong Y K., Kong InSoo., Park S., 1999.Production of a fibrinolytic enzyme in bioreactor culture by Bacillus subtilis BK-17 J Microbiol Biotechnol 9(4): 443-449 32 Liang X., Jia S., Sun Y., Chen M., Chen X., Zhong J., Huan L., 2007 Secretory expression of nattokinase from Bacillus subtilis YF38 in Escherichia coli Mol Biotech., 37(3): 187-194 33 Wang JK., Chiu HH., Hsieh CS., 2009 Optimization of the Medium Components by Statistical Experimental Methods to Enhance Nattokinase Activity, Fooyin J Health Sci 1(1): 21 -27 34 Liu J G., Xing J M., Chang T S., Ma Z Y., Liu H Z., 2005 Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods Process Biochem., 40: 2757-2762 35 Wang S H., Zhang C., Yang Y L., Diao M., Bai M F., 2008 Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and 43 characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547, World J Microbiol Biotechnology 24: 475482 36 Zu X., Zhang Z., Yang Y., Che H., Zhang G., Li j., 2010 Thrombolytic Activities of Nattokinase Extracted from Bacillus Subtilis Fermented Soybean Curd Residues International Journal of Biology, 2(2) 37 Jonh G.Holt., 1992., Stedman’s Bergey’s Bacteria Words., Williams & Wilkins 38 Hui Yiu U., Lisbeth Meunier – Goddik, Josephesen Jiste, Nip WaiKit., 2005 Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology, pp.612-620 Tài liệu Internet 39 Huỳnh Văn Minh, 2015 Đôi điều chưa biết men đậu nành Natto http://www.vusta.vn/vi/news/Thong-tin-Su-kien-Thanh-tuu-KHCN/Doi-dieu-chua-biet-ve-men-dau-nanh-NATTO-57090.html 40 Tống Ngọc Triêm, 2016 Đặc tính sinh học vi khuẩn Bacillus sutilis http://kythuatnuoitrong.com/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan- bacillus-sutilis/ 41 Đông khô: Phương pháp đông khô (phần 1) Nguồn Labacon http://www.biomedia.vn/review/dong-kho-phuong-phap-say-dongkho-phan-1.html 42 https://www.researchgate.net/figure/228117497_fig9_Figure-8Physiologic-effects-of-nattokinase-on-fibrin-Nattokinase-lyses-fibrindirectly 44 ... suất thu hồi hoạt tính enzyme Vì đề tài Nghiên cứu điều kiện thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ B .subtilis natto 5 quan tâm sâu nghiên cứu Mục tiêu chung Xác định điều kiện thích hợp để thu hồi. .. huyết khối chế phẩm nattokinase tạo từ cặn enzyme đơng khơ sau trộn với chất mang 35 Hình 3.7 Quy trình cơng nghệ thu hồi tạo chế phẩm nattokinase từ Bacillus subtilis natto ... định điều kiện thu hồi nattokinase từ B .subtilis natto 5; - Xác định chất mang chế độ sấy để tạo chế phẩm nattokinase có khả làm tan huyết khối tốt PHẦN - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nattokinase