VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài:NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ THU HỒI MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps militaris FNA5 Giáo viên hƣớng dẫn: TS Phí Quyết Tiến TS Phạm Thanh Huyền Sinh viên: Nguyễn Thị Thu Hiền Lớp: 1302 Hà Nội - 2017 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học, em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ quý báu từ phía Thầy cơ, bạn bè ngƣời thân Với lòng chân thành biết ơn sâu sắc nhất, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS Phí Quyết Tiến, Phòng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; TS Phạm Thanh Huyền, Phòng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, hai Thầy cô tạo điều kiện, tận tâm hƣớng dẫn em từ bƣớc chập chững đầu tiên, bƣớc tiếp cận nghiên cứu khoa học Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới Thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học, giáo viên phụ trách, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm tạo điều kiện hƣớng dẫn, giúp đỡ góp ý kiến giúp em suốt trình thực đề tài Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị làm việc Phòng Cơng nghệ lên men bạn sinh viên dành thời gian quý giá để giúp đỡ em suốt trình thực tập để đạt đƣợc kết tốt Và cuối em xin đƣợc cảm ơn gia đình, ngƣời thân bạn bè động viên em suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp, giúp em vƣợt qua nhiều khó khăn cơng việc, sống hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách thuận lợi Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hiền Nguyễn Thị Thu Hiền i Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chủng nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1 Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.2 Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo tự nhiên 1.2 Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đơng trùng hạ thảo 1.2.1 Cordycepin 1.2.2 Adenosine 1.2.3 Polysaccharide 1.2.4 Các hợp chất khác 10 1.3 Giá trị dƣợc liệu hoạt chất sinh học tới sức khỏe ngƣời 12 1.4 Ứng dụng cơng nghệ lên men chìm nấm Cordyceps spp để sản xuất sinh khối exopolysaccharide (EPS) 14 1.5 Thu hồi sinh khối hoạt chất từ Cordyceps spp 17 1.6 Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo ngồi nƣớc 18 1.6.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo giới 18 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo Việt Nam 19 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Chủng giống 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 20 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 Nguyễn Thị Thu Hiền ii Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 2.2.1 Phƣơng pháp bảo quản giống 21 2.2.2 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy 21 2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh trƣởng phát triển nấm 22 2.2.3.1 Nhiệt độ lên men 22 2.2.3.2 pH môi trƣờng lên men 22 2.2.3.3 Tỷ lệ tiếp giống 23 2.2.4 Phƣơng pháp xác định chất có hoạt tính dƣợc học nấm Đơng trùng hạ thảo 23 2.2.4.1 Xác định Cordycepin 23 2.2.4.2 Xác định Polysaccharide 24 2.2.5 Nghiên cứu tách chiết chất có hoạt tính sinh học từ chủng nấm 25 2.2.5.1 Phƣơng pháp tách chiết Cordycepin 25 2.2.5.2 Phƣơng pháp tách chiết Polysaccharide 26 3.1 Đặc điểm sinh học chủng nấm ký sinh côn trùng 27 3.2 Lựa chọn mơi trƣờng nhân giống thích hợp 28 3.3 Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 31 3.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh trƣởng phát triển chủng nấm 32 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 33 3.4.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng ban đầu 34 3.4.3 Ảnh hƣởng nồng độ 36 3.4.4 Ảnh hƣởng thể tích 38 3.5 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học chủng nấm (trong hệ thống bình lên men lít) 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Nguyễn Thị Thu Hiền iii Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng phân loại khoa học Bảng 1.2 Mô tả hình thái số lồi nấm thuộc chi Cordyceps Bảng 3.1 Đặc điểm sinh học chủng nấm ký sinh côn trùng 27 Bảng Hình thái khuẩn lạc chủng nấm C militaris FNA5 môi trƣờng khác theo thời gian nuôi cấy 28 Bảng 3 Khả phát triển chủng C militaris FNA5 nhiệt độ khác theo thời gian (đƣờng kính khuẩn lạc, cm) 33 Bảng Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị pH khác theo thời gian 35 Bảng Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị nồng độ khác theo thời gian 37 Bảng Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị thể tích khác theo thời gian 39 Nguyễn Thị Thu Hiền iv Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm Đơng trùng hạ thảo lồi Cordyceps militaris Hình 1.2 Một số hình thái chủng nấm thuộc chi Cordyceps Hình 1.3 Hình thái tự nhiên số loài nấm :A- C sinensnis; B-C gunnii; C-C barnesii; D- C gracilis; E- C liangshanensis; F-C militaris Hình Cấu trúc hóa học Cordycepin Adenosine Hình 3.1 Hình ảnh bề mặt khuẩn lạc chủng FNA5 đĩa thạch sau 15 ngày nuôi cấy 28 Hình 3.2 Hình thái túi bào tử lúc nẩy mầm bào tử trƣởng thành chủng FNA5 sau 10 ngày nuôi cấy (SEM, x 3.500 7.500 lần) 29 Hình 3 Hình thái khuẩn lạc chủng C militaris FNA5 môi trƣờng rắn theo thời gian nuôi cấy 29 Hình Biểu đồ đƣờng kính khuẩn lạc chủng C militaris FNA5 môi trƣờng khác theo thời gian (đƣờng kính khuẩn lạc, cm) 31 Hình 3.5 Biểu đồ ảnh hƣởng môi trƣờng khác tới khả phát triển chủng C militaris FNA5 theo thời gian nuôi cấy 31 Hình 3.6 Biểu đồ ảnh hƣởng môi trƣờng khác tới khả sinh EPS chủng C militaris FNA5 theo thời gian nuôi cấy 31 Hình 3.7 Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa CNLM dịch sau lên men chủng C militaris FNA5 môi trƣờng MPA theo thời gian nuôi cấy 32 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới phát triển chủng nấm FNA5 đĩa petri sau ngày 33 Hình Khả sinh trƣởng phát triển nấm C militaris FNA5 giá trị pH khác 35 Hình 10 Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị pH khác theo thời gian 36 Nguyễn Thị Thu Hiền v Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Hình 11 Khả sinh trƣởng phát triển nấm C militaris FNA5 tỷ lệ giống 37 Hình 12 Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị nồng độ khác theo thời gian 38 Hình 13 Khả sinh trƣởng phát triển nấm C militaris FNA5 thể tích khác 38 Hình 14 Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị thể tích khác theo thời gian 39 Hình 15 Chu kỳ sinh trƣởng chủng C militaris FNA5 thời gian 18.5 ngày 40 Hình 16 Kết đo phổ xác định hàm lƣợng cordycepin dịch lên men chủng nấm C militaris FNA5 41 Nguyễn Thị Thu Hiền vi Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung EPS Exopolysaccharide (Extracellular polysaccharide) Polysaccharide ngoại bào rpm Tốc độ lắc vòng/phút w/v Khối lƣợng/thể tích w/w Khối lƣợng/ khối lƣợng HPLC High Performance Liquid Chromatography Nguyễn Thị Thu Hiền vii Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nấm Đông trùng hạ thảo loại nấm ký sinh côn trùng, không đƣợc nhà khoa học nghiên cứu, mà đƣợc xã hội quan tâm đến, nấm loại dƣợc liệu quý, tốt cho sức khỏe ngƣời, phù hợp với lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thiếu niên, ngƣời già Theo tài liệu ghi chép đông dƣợc cổ, Đông trùng hạ thảo vị thuốc bồi bổ quý giá, có tác dụng tích cực bệnh nhƣ rối loạn tình dục, thận hƣ, liệt dƣơng, đau lƣng, mỏi gối, ho hen, có tác dụng tốt trẻ em còi xƣơng chậm lớn Một số nghiên cứu gần nấm Đơng trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cƣờng công tuyến thƣợng thận, cải thiện đƣợc chức thận, nâng cao lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thƣ chất phóng xạ Trên giới, nấm Đông trùng hạ thảo đƣợc nhà khoa học nghiên cứu thu đƣợc nhiều thành tựu có giá trị Với cơng nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nƣớc thành công việc nuôi cấy nhân tạo chủng nấm thuộc chi Cordyceps thƣơng mại hóa sản phẩm chúng.Hiện nay, với phƣơng pháp lên men đƣợc sử dụng chủ đạo, sản phẩm thƣơng mại sinh khối nấm ký sinh đƣợc sản xuất thành công Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ Các chất chiết xuất sau trình lên men chứa đầy đủ hợp chất có hoạt tính sinh học tƣơng tự nhƣ nấm ký sinh nguồn gốc tự nhiên Ở Việt Nam việc nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo gặp nhiều khó khăn sở vật chất nhƣ kiến thức Chúng ta sử dụng chủ yếu dựa khai thác tự nhiên hay nhập từ Trung Quốc, nguồn gốc chất lƣợng không rõ ràng, giá đắt đỏ không đáp ứng đƣợc nhu cầu cho xã hội Nguyễn Thị Thu Hiền Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Để góp phần vào nghiên cứu phát triển nâng cao thị trƣờng sản xuất nấm dƣợc liệu Đông trùng hạ thảo Việt Nam, thực đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men thu hồi số hoạt chất sinh học chủng nấm Cordyceps militaris FNA5” Với mục đích tìm đƣợc điều kiện ni cấy phù hợp nhằm tạo hợp chất có hoạt tính sinh học chủng nấm Cordyceps militarisFNA5 Đồng thời đóng góp phần nhỏ bé việc xây dựng công nghiệp dƣợc nƣớc Mục tiêu nghiên cứu đề tài Xác định đƣợc số điều kiện lên men nấm Cordyceps militaris FNA5 điều kiện thu hồi số dƣợc chất polysaccaride, cordycepin từ sinh khối dịch lên men nấm nhằm ứng dụng sản xuất thực phẩm chức Đối tƣợng nội dung nghiên cứu đề tài a Đối tƣợng nghiên cứu - Chủng nấm Cordyceps militaris FNA5phân lập Việt Nam, nhận từ sƣu tập giống phòng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam b Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu số điều kiện lên men (mơi trƣờng, tỷ lệ tiếp giống, sục khí, pH…) chủng nấm Cordyceps militaris FNA5 quy mơ lít/mẻ để sinh tổng hợp cordycepin, polysaccharide - Nghiên cứu điều kiện tách chiết thu hồi chất có hoạt tính sinh học cordycepin, polysaccharide Nguyễn Thị Thu Hiền Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Kết cho thấy, 25oC nhiệt độ tối ƣu cho phát triển sợi nấm Ở nhiệt độ cao 30oC, 37oC ức chế phát triển chủng nấm FNA5, nhiệt độ thấp 15oC 20oC chủng sinh trƣởng phát triển chậm (Hình 3.8 Bảng 3.3) Theo Sung cộng (1999, 2002), Gao cộng (2000) trình s giảm mạnh tăng nhiệt độ 25˚C, kết thu đƣợc gần tƣơng đƣơng với kết đƣợc nghiên cứu trƣớc 3.4.2 Ảnh hƣởng pH mơi trƣờng ban đầu Trong nhiều nghiên cứu, giá trị pH đầu ảnh hƣởng không nhỏ đến sinh trƣởng sinh tổng hợp chủng giống Trong đó, pH mơi trƣờng đầu tác dụng đến sinh trƣởng chủng giống phát triển sinh hoạt chất quý giá nhƣ polysaccharide, cordycepin, adenosine… Do đó, chúng tơi sử dụng mơi trƣờng thích hợp thay đổi giá trị pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu, kết đƣợc trình bày nhƣ Bảng 3.4 Hình 3.9- 3.10 Hình Khả sinh trƣởng phát triển nấm C militaris FNA5 giá trị pH khác Nguyễn Thị Thu Hiền 34 Giá trị EPS thu đƣợc thay đổi pH Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 800 700 600 500 400 5.5 300 200 6.5 100 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Hàm lƣợng EPS thu đƣợc (mg/l) Hình 10 Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị pH khác theo thời gian Bảng Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị pH khác theo thời gian Thời gian Sinh khối khô dịch lên men thay đổi giá trị pH ban đầu (g/l) 5,5 6,5 ngày 25 30 35 10 20 ngày 15 25 25 20 25 10 ngày 20 40 45 45 30 25 ngày 25 30 40 45 35 25 ngày 20 25 35 35 25 20 ngày 20 15 20 25 15 15 Các nghiên cứu trƣớc pH môi trƣờng có ý nghĩa định, có tác động sâu sắc tới trình trao đổi chất vi sinh vật Giới hạn hoạt động chủng nấm C militaris FNA5 khoảng pH 5,5-6,5, với khoảng pH phù hợp với hoạt động củ nhiều loại enzyme có thể nấm Việc xác định pH thích hợp ban đầu cho q trình ni cấy việc trì pH cần thiết suốt thời gian sinh trƣởng tế bào, giúp cho trình sinh trƣởng sinh sinh hợp chất sinh học tốt nhất, Nguyễn Thị Thu Hiền 35 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 nghiên cứu cho thấy pH thích hợp khoảng 5,5- 6,5 cho lƣợng sinh khối hàm lƣợng EPS thu đƣợc cao Khảo sát sát với nghiên cứu Sung cộng (2006) kết thu đƣợc pH khoảng 6,0-6,5 3.4.3 Ảnh hƣởng nồng độ Tỷ lệ giống gốc cấy vào môi trƣờng dịch thể yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến tốc độ sinh trƣởng giống, tới mật độ kích thƣớc khuẩn lạc cầu Trong nghiên cứu giống trung gian nấm C militaris FNA5 tỷ lệ giống cấy đƣợc tính theo tỷ lệ với môi trƣờng nuôi cấy Các mức độ giống cấy cho môi trƣờng bao gồm: 1%; 2%, 3%, 4%, 5% giống so với môi trƣờng nuôi cấy Hình 11 Khả sinh trƣởng phát triển nấm C militaris FNA5 tỷ lệ giống khác Nguyễn Thị Thu Hiền 36 Giá trị EPS thu đƣợc thay đổi nồng độ Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 1800 1600 1400 1200 1% 1000 2% 800 3% 600 4% 400 5% 200 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Hàm lƣợng EPS thu đƣợc (mg/l) Hình 12 Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị nồng độ khác theo thời gian Bảng Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị nồng độ khác theo thời gian Thời gian Sinh khối khô thu đƣợc có thay đổi tỷ lệ tiếp giống (g/l) 1% 2% 3% 4% 5% ngày 10 10 15 10 10 ngày 10 20 15 20 15 ngày 20 20 15 15 15 ngày 25 25 20 20 10 ngày 30 20 20 25 20 ngày 20 15 10 25 Sự lƣu thông dòng chảy mơi trƣờng lỏng bị ảnh hƣởng mạnh sinh khối sợi nấm (Hwang et al., 2004), cấy mật độ lớn dẫn đến gia tăng lớn độ nhớt mơi trƣờng q trình lên men, gây khó khăn cho việc hấp thụ dinh dƣỡng trao đổi oxy Đối với trạng thái hình dạng sợi nấm tồn mơi trƣờng ni cấy, nấm phát triển nhƣ dạng viên có xu hƣớng nhớt so với dạng phát triển dạng sợi phân tán (Gibbs et al., 2000) Các nghiên cứu tác giả trƣớc phù hợp với kết Nguyễn Thị Thu Hiền 37 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 nghiên cứu này, cấy lƣợng giống lớn so với môi trƣờng, dịch thƣờng có dạng huyền phù cao, khó khăn cho lƣu thông dịch Kết cho thấy, cấy mật độ 1% giống cho sinh khối sợi cao (30 g 1.000 ml) thu đƣợc hàm lƣợng EPS cao 1.598 mg/l, khuẩn lạc cầu đồng đều, dịch không bị kết vón Cấy mật độ 4% 5% dịch ni cấy có xu hƣớng chuyển dạng huyền phù, khí lƣu thơng khó khăn, khuẩn lạc cầu thƣờng kết vón với nhau, sinh khối sợi khơng tăng mà có xu hƣớng giảm, chủng sinh trƣởng phát triển chậm Cấy mật độ 2% 3% lƣợng sinh khối sinh (Hình 3.11- 3.12 Bảng 3.5) 3.4.4 Ảnh hƣởng thể tích Tốc độ thơng khí thời hạn định s ảnh hƣởng tới phát triển chủng nấm, làm tăng khả phát triển đƣợc thể nhƣ rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao sinh khối Cung cấp khí tạo chất chuyển hóa thứ cấp đồng nghĩa với thúc đẩy chuyển hóa chất, tạo sản phẩm hòa tan oxy Chúng tơi nghiên cứu ảnh hƣởng thơng khí tới sinh trƣởng phát triển chủng C militaris FNA5 Kết khối lƣợng sinh khối tính đƣợc thể Hình 3.13 - 3.14 Bảng 3.6 Hình 13 Khả sinh trƣởng phát triển nấm C militaris FNA5 thể tích khác Nguyễn Thị Thu Hiền 38 Giá trị EPS thu đƣợc thay đổi thể tích Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 1800 1600 1400 1200 1000 100 800 150 600 200 400 250 200 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Hàm lƣợng EPS thu đƣợc (mg/l) Hình 14 Hàm lƣợng EPS thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị thể tích khác theo thời gian Bảng Lƣợng sinh khối thu đƣợc chủng C militaris FNA5 giá trị thể tích khác theo thời gian Thời gian Sinh khối khô thu đƣợc có thay đổi thể tích bình (g/l) 100ml 150ml 200ml 250ml ngày 10 10 15 10 ngày 15 15 15 20 ngày 25 15 30 30 ngày 20 25 20 25 ngày 20 35 10 20 ngày 10 50 10 10 Độ thơng khí mơi trƣờng tạo điều kiện sinh trƣởng phát triển chủng đồng nghĩa với việc thúc đẩy chuyển hóa chất Tùy thuộc vào chủng mà u cầu độ thơng khí khác Ở thí nghiệm cho thấy chủng C.militaris FNA5 cho hàm lƣợng EPS đạt giá trị cao 1565 mg/l lƣợng sinh khối đạt 50g/l độ thơng khí tƣơng đƣơng 150ml dịch/bình 500ml Nguyễn Thị Thu Hiền 39 Khóa luận tốt nghiệp 3.5 Khoa CNSH- 1302 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học chủng nấm (trong hệ thống bình lên men lít) Chu kỳ sinh trƣởng giống nấm trải qua giai đoạn: Giai đoạn tiềm tàng, giai đoạn tăng trƣởng (pha tăng tốc: mật độ tế bào bắt đầu tăng; pha tăng trƣởng cực đại; pha tăng trƣởng chậm), giai đoạn ổn định giai đoạn suy tàn Giống dịch thể có tốc độ sinh trƣởng nhanh, việc xác định thời gian sợi nấm đạt đến giai đoạn hoạt lực khỏe nhất, sinh khối cao quan trọng Trong thí nghiệm này,chúng định kỳ lấy giống nấm giai đoạn tuổi giống khác (12 lần) để quan sát Kết thu đƣợc Hình 3.15 Sinh khối pH 1800 1600 EPS 35 30 25 1200 1000 20 800 15 600 10 pH, Sinh khối (g/L) Hàm lượng EPS (mg/L) 1400 400 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 200 Thời gian (ngày) Hình 15 Chu kỳ sinh trƣởng chủng C militaris FNA5 thời gian 18,5 ngày Kết (Hình 3.15) nhận thấy hệ sợi nấm thời gian 8-9 ngày có sức sống khỏe nhất, khuẩn lạc cầu có thời gian mọc sợi nhanh Càng sau sợi hình cầu có biểu giảm liên kết bám hết vào thành bình Từ kết ta thấy hàm lƣợng EPS thu đƣợc nhiều 1593 mg/l với lƣợng sinh khối khô thu đƣợc 30g/l pH Nguyễn Thị Thu Hiền 40 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Chúng dùng phƣơng pháp HPLC để xác định hàm lƣợng Cordycepins có dịch lên men kết (Hình 3.16) cho thấy hàm lƣợng Cordycepin tăng dần theo thời gian tới ngày thứ 20 đạt giá trị cao với hàm lƣợng đạt đƣợc 0,82 µg/ml Hình 16 Kết đo phổ xác định hàm lƣợng cordycepin dịch lên men chủng nấm C militaris FNA5 So sánh với nghiên cứu Biochim cộng năm 1960 cho thấy, kết nghiên cứu nhóm chủng thuộc lồi C militaris có hàm lƣợng cordycepin từ 25- 100 mg lít mơi trƣờng Sản lƣợng cordycepin để tổng hợp đƣợc tốt đòi hỏi khoảng 20 ngày sau thu hoạch Trong mẫu chủng nấm C militaris FNA5 đạt hàm lƣợng cordycepin dịch lên men 0,82µg/ml Nhƣ vậy, thấy hàm lƣợng cordycepin có dịch lên men sinh khối tƣơi chủng C militaris FNA5 sau 20 ngày lên men chƣa cao nghiên cứu công bố Tuy nhiên, kết khả quan nghiên cứu lên men chìm chủng nấm Đơng trùng hạ thảo phân lập Việt Nam cho định hƣớng thu hồi chất có hoạt tính dƣợc học nhƣ cordycepin Nguyễn Thị Thu Hiền 41 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã chọn đƣợc mơi trƣờng thích hợp cho nhân giống mơi trƣờng MT3 mơi trƣờng lên men thích hợp (g/l): glucose 10; peptone 6; KH2PO4 1; K2HPO4 1; MgSO4 0,5 Đã lựa chọn đƣợc điều kiện cho lên men nấm C militaris FNA5: nhiệt độ 25˚C; pH ban đầu 5,5- 6,5; tỷ lệ giống 1%; tỷ lệ dịch lên men/thể tích bình 150/500 (v/v) Đã khảo sát động thái lên men chủng C militaris FNA5 bình lên men lít Thời gian thích hợp để thu nhận polysaccharide dịch lên men cao 1593 mg/l sinh khối khô 30 g/l sau ngày lên men KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu hồi hoạt chất sinh học khác có chủng nấm C militaris FNA5 Kết nghiên cứu đạt đƣợc s tiền đề, sở cho việc nghiên cứu chủng nấm khác thuộc chi Cordyceps Nguyễn Thị Thu Hiền 42 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đái Duy an Lƣu Tham Mƣu Nhà xuất y học (2009) Đông trùng hạ thảo, dƣợc liệu hỗ trợ điều trị bệnh virus, ung thƣ, HIV AIDS, đái tháo đƣờng, suy giảm tình dục nghiên cứu phát lồi đơng trùng hạ thảo Việt Nam Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Văn Bắc (2006) Chương trình vi sinh vật học- Nấm sợi Trịnh Tam Kiệt tác giả (2001) Danh mục loài thực vật Việt Nam (phần Nấm) Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyễn Mạnh Hà (2012) Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết chủng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link Pham Quang Thu (2009) Điều tra phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans Pat Phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn Động, ắc Giang Tạp chí NN&PTNT4: 91-94 Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm ký sinh côn trùng vƣờn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí NN&PTNT 6: 96-99 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân (2009) Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh trƣởng hệ sợi ni cấy khiết số lồi nấm ký sinh trùng Tạp chí NN&PTNT 11: 97-102 Tiếng Anh Ahn YJ, Park SJ, Lee SG, Shin SC, Choi DH (2000) Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp J Agric Food Chem 48:2744-2748 erkeley, M.J 1843 On some entomogenous Sphaeriae.Hooker’s London Journal of Botany 2:205-211 Cha SH, Lim JS, Yoon CS, Koh JH, Chang HI, Kim SW (2007) Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Nguyễn Thị Thu Hiền 43 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 Cordyceps sinensis 16 in submerged culture Bioresour Technol 98: 165–168 Chen L.T., Cao H.F & Huang W.F, 2005 Components, pharmacological activities and application of Cordyceps militaris, Modern Food Science 21(3) 192-195 Kim H, Yun JW (2005) A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures Journal of Applied Microbiology 99: 728-738 Kim SW, Hwang HJ, Park JP, Cho YJ, Song CH, Yun JW (2002) Mycelial growth and exo-polymer production by submerged culture of various edible mushroom under different media Lett Appl Microbiol 34: 56–61 Klaunig JE, Kamendulis LM (2004) The role of oxidative stress in carcinogenesis Annu Rev Pharmacol 44: 239-267 Cui JD, Zhang BZ (2010) Comparison of culture methods on exopolysaccharide production in the submerged culture of Cordyceps militaris and process optimization Letters in Applied Microbiology 52: 123-128 Shashihara MG, Giridhare P, Udaya SK, Manohar BI (2013) Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement – A review Journal of functional foods 910-8507 10.Shin KH, Lim SS, Lee S, Lee YS, Jung SH, Cho SY (2003) Antitumour and immuno-stimulating activities of the fruiting bodies of Paecilomyces japonica, a new type of Cordyceps spp Phytother Res17:830– 11.Shrestha B, Zhang W, Zhang Y, Liu X (2010) What is the Chinese caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis (Ophiocordycipitaceae) Mycology 1:228-36 12.Song JF, Liu CQ, Li DJ, Jin BQ (2007) Chem Technol Biotechnol 82 Nguyễn Thị Thu Hiền 44 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 13.Sun Y, Zhang X, Lei P (2003) Study on character for separation and extraction of polysaccharide from hyphae of Cordyceps sinersis Acta Chinese Medicine and Pharmacology, 2,3 14.Wang YJ, Li DW, Kwang YC, Zheng TT (2005) Acta Bot Borea.Occident Sin 25 15.Won SY, Park EH (2005) Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris J Ethnopharmacol 96: 555- 561 16.Xiao JH, Chen DX, liu JW, Liu LZ, Wan WH, Fang N, Xiao Y, Qi Y, Liang ZQ (2004) Optimization of submerged culture requirements for the production of mycelial growth and exopolysaccharide by Cordyceps jiangxiensis JXPJ 0109 Journal of Applied Microbiology 96: 1106-1116 17.Xuanwei Z, Gonga Zhenghua, Sua Ying, Linb Juan, Tang K (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and development products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 279-291 18.Yang FC, Ke YF, Kuo SS (2000) Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask cultures Enzyme Microb Technol 27: 295–301 19.Yang JK, Wang WQ, Ma HL, Wu JY (2013) Sulfation and enhanced antioxidant capacity of an exopolysaccharide produced by the medicinal fungus Cordyceps sinensis Molecules 18: 167-177 20.Zhoua X, Gonga Z, Sua Y, linb J, Tang K (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 279-291 21.Kamble V.R and Agre D.G., 2012 Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra Bionano Frontier 5(2):224-225 22.Park JP, Kim SW, Hwang HJ, Choi YJ, Yun JW (2002) Stimulatory effect of plant oils and fatty acids on the exo-biopolymer production in Cordyceps militaris Enzyme Microb Technol 31: 250–255 Nguyễn Thị Thu Hiền 45 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 23.Liu YS, Wu JY (2012) Effects of Tween 80 and pH on mycelial pellets and exopolysaccharide production in liquid culture of a medicinal fungus Journal of industrial microbiology & biotechnology 39 (4): 623-628 24.Che ZM (2003) Assessment on edible safety of artificially cultivated Cordyceps militaris fruiting bodies Edible Fungi 25(3): 45–46 25.Das SK, Masuda M, Mikio S (2010) Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects Fitoterapia 81:961– 968 26.Hardeep ST, Sardul S, Sharma AK (2014) Pharmacological and therapeutic potential of Cordyceps with special reference to cordycepin Biotech 4(1): 1-12 27.Huang NL, Lin ZB, Chen G.L (2010) Medicinal and edible fungi Shanghai Scientific and Technological Literature, Shanghai 28.Hui LJ, Hao BH, Chu C, Qin L, Ping L (2011) Morphological and microscopic identification studies of Cordyceps and its counterfeits Acta Pharmaceutica Sinica B 3: 189-195 29.Kobayasi Y (1982) Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella 30.Kim H, Yun JW (2005) A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures Journal of Applied Microbiology 99: 728-738 31.Klaunig JE, Kamendulis LM (2004) The role of oxidative stress in carcinogenesis Annu Rev Pharmacol 44, 239-267 32.Mao XL (2000) The macrofungi in China Henam Technical and Science Publication House 33.Mina M, Eriko U, Akihiko Si, Mikio S (2005) Production of cordyceps by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris Chemistry and Biotechnology Japan 910-8507 34.Lo HC, Chienyan H, Fang YL and Hsu TH (2013) A systermatic review of the mysterious caterpiller fungus OphioCordyceps sinensis in DongChongXiaXao and Related Bioactive incredients Journal of Traditional and Complementary medicine 3(1): 16-32 Nguyễn Thị Thu Hiền 46 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 35.Gao X.H., Wu W., Qian G.C., 2000 Study on influences of abiotic factors on fruitbody differentiation of Cordyceps militaris Acta Agriculture Shanghai 16: 93–98 36.Lu LX, Xu Q, Liu ZH, Sun Y, Djing Z, Li YQ (2012) Optimization for Production of Intracellular Polysaccharide from Cordyceps ophioglossoides L2 in Submerged Culture and Its Antioxidant Activities invitro Chinese Journal of Chemical Engineering 20(2): 294-301 37.John H, Matt C, Aloha M Inc, Santa Cruz, California,U.S.A 2005 Cordyceps Wasser SP Institute of Evolution, University of Haifa, Mt.Carmel, Haifa, Israel 38.John H, Malt C (2008) Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) International Journal Medicinal Mushroom 10(3): 219-234 39.Park JP, Kim SW, Hwang HJ, Yun JW (2001) Optimization of submerged culture conditions for the mycelialgrowth and exobiopolymer production by Cordyceps militaris Letters in Applied Microbiology 33: 76-81 40.Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York 41.Shashidhara MG., Giridhare P., Udaya SK., Manohar B., India (2013) Bioactive principles from Cordyceps sinensis: Apotent food supplement-A review Journal of functional foods 1013-1030 42.Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C.Y., 2007 Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochemical Engineering Journal 33, 193–201 43.Seok KJ., Lee JS., Shin CW., Lee KE., and Hong EK Korea (2009) Optimization of Culture Condition and Medium Components for the Production of Mycelial Biomass and Exo-polysaccharide with Cordyceps militaris in Liquid Culture Biotechnolgy and Bioprocess Engineering 14: 756-762 44.Shrestha B, Zhang W, Zhang Y, Liu X (2010) What is the Chinese caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis (Ophiocordycipitaceae) Mycology 1:228-36 Nguyễn Thị Thu Hiền 47 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH- 1302 45 Sung J.M., Choi Y.S., Lee H.K., 1999 Production of fruiting body using cultures of entomopathogenic fungal species Korean Journal of Mycology 27:15–19 46 Sung J.M., Choi Y.S., Shrestha B., Park Y.J., 2002 Investigation on artificial fruiting of Cordyceps militaris Korean Journal of Mycology 30: 6–10 47 Sung J.M., Park Y.J., Han S.K., 2006 Selection of superior strains of Cordyceps militaris with enhanced fruiting body productivity Mycobiology 34: 131–137 48 Wang G.D., 1995 Ecology, cultivation and application of Cordyceps and Cordyceps sinensis Scientific and Technical Documents, Beijing 49 Wang J.F., Yang C.Q., 2006 Research survey on artificial cultivation and product development of Cordyceps militaris Lishizhen Medicine And Material Medical Research 17:268–269 50 Zheng P., Xia Y.L., Xiao Ch.H., 2011 Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine Genome Biology 23; 12 51 Zhoua X, Gonga Z, Sua Y, linb J, Tang K (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 279-291 52 Zhu, J.S., G.M Halpern, and K Jones 1998a The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordycepssinensis Part I J Altern Complement Med 4(3): 289-303 53 Zhu, J.S., G.M Halpern, and K Jones 1998b The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordycepssinensis Part II J Altern Complement Med 4(4): 429-457 54 Xiao JH, Chen DX, liu JW, Liu LZ, Wan WH, Fang N, Xiao Y, Qi Y, Liang ZQ (2004) Optimization of submerged culture requirements for the production of mycelial growth and exopolysaccharide by Cordyceps jiangxiensis JXPJ 0109 Journal of Applied Microbiology 96: 1106-1116 55 Xuanwei Zhoua, Zhenghua Gonga, Ying Sua, Juan Linb, and Kexuan Tang (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): 2791 56 Yang JK, Wang WQ, Ma HL, Wu JY (2013) Sulfation and enhanced antioxidant capacity of an exopolysaccharide produced by the medicinal fungus Cordyceps sinensis Molecules 18: 167-177 Nguyễn Thị Thu Hiền 48 ... vào nghiên cứu phát triển nâng cao thị trƣờng sản xuất nấm dƣợc liệu Đông trùng hạ thảo Việt Nam, thực đề tài Nghiên cứu điều kiện lên men thu hồi số hoạt chất sinh học chủng nấm Cordyceps militaris. .. nƣớc Mục tiêu nghiên cứu đề tài Xác định đƣợc số điều kiện lên men nấm Cordyceps militaris FNA5 điều kiện thu hồi số dƣợc chất polysaccaride, cordycepin từ sinh khối dịch lên men nấm nhằm ứng... dung nghiên cứu - Nghiên cứu số điều kiện lên men (môi trƣờng, tỷ lệ tiếp giống, sục khí, pH…) chủng nấm Cordyceps militaris FNA5 quy mơ lít/mẻ để sinh tổng hợp cordycepin, polysaccharide - Nghiên