Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phước, năm 2014 2015 (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phước, năm 2014 2015 (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phước, năm 2014 2015 (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phước, năm 2014 2015 (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phước, năm 2014 2015 (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phước, năm 2014 2015 (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phước, năm 2014 2015 (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phước, năm 2014 2015 (Luận văn thạc sĩ)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ TRÀ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG ARTEMISININ TRÊN GEN K13 CỦA Plasmodium falciparum TẠI VÙNG SỐT RÉT LƢU HÀNH NẶNG TỈNH BÌNH PHƢỚC, NĂM 2014 – 2015 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ TRÀ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG ARTEMISININ TRÊN GEN K13 CỦA Plasmodium falciparum TẠI VÙNG SỐT RÉT LƢU HÀNH NẶNG TỈNH BÌNH PHƢỚC, NĂM 2014 – 2015 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Độc vật học Mã số: 60 42 01 03 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trƣơng Văn Hạnh HÀ NỘI – 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các số liệu, kết luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình tài liệu Tác giả Nguyễn Thị Trà Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trƣơng Văn Hạnh, Thầy tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Sốt rét-KST-CTTƢ tạo điều kiện thuận lợi, ủng hộ thời gian, vật chất tinh thần q trình thực Luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Thầy, Cô, cán Phòng Đào tạo Sau đại học, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Trƣờng Đại học Thái Ngun tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập Trƣờng Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Khoa Sinh học phân tử cán Khoa/Phòng Viện Sốt rét-KST-CTTƢ, giúp đỡ, ủng hộ động viên trình học tập thực đề tài Với lòng biết ơn sâu nặng, cảm ơn gia đình bạn bè bên Nguyễn Thị Trà Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sốt rét giới Việt Nam 1.2 Tình hình ký sinh trùng số t rét P falciparum kháng thuốc thế giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình kháng thuốc sốt rét P falciparum giới 1.2.2 Tình hình kháng thuốc sốt rét P falciparum Việt Nam 1.3 Đặc điểm gen K13 P falciparum liên quan đến kháng artemisinin 10 1.3.1 Cơ sở khoa học chọn gen K13 thị phân tử kháng artemisinin 10 1.3.2 Cấu trúc gen K13 P falciparum 12 1.4 Các nghiên cứu đa hình đột biến gen K13 giới Việt Nam 1.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc 14 20 1.5.1 Phƣơng pháp in vivo 20 1.5.2 Phƣơng pháp in vitro 22 1.5.3 Phƣơng pháp phân tử 22 1.6 Kỹ thuật giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 23 25 25 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 25 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 25 2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii 2.2.1 Thiết bị 25 2.2.2 Dụng cụ 25 2.2.3 Hóa chất 26 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 27 2.3.2 Phƣơng pháp chọn mẫu cỡ mẫu 27 2.4 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 2.4.1 Thu thập mẫu 27 27 2.4.2 Tách chiết ADN sinh phẩm DNA micro test hãng Qiagen 27 2.4.3 Kỹ thuật PCR xác định loài ký sinh trùng sốt rét ngƣời 28 2.4.4 Kỹ thuật PCR xác định kiểu gen P falciparum 30 2.4.5 Kỹ thuật giải trình tự ADN phát đột biến gen K13 31 2.5 Xử lý số liệu nghiên cứu 34 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết xác định đột biến gen K13 P falciparum phân lập từ bệnh nhân sốt rét Bình Phƣớc 3.1.1 Kết xác định loài ký sinh trùng sốt rét kỹ thuật PCR lồng 35 35 35 3.1.2 Kết xác định kiểu gen P falciparum kỹ thuật PCR lồng 35 3.1.3 Kết phân tích đột biến gen K13 kỹ thuật giải trình tự 37 ADN 3.2 Đánh giá mối tƣơng quan đột biến gen K13 với kết theo dõi 47 ký sinh trùng sốt rét bệnh nhân ngày D3 CHƢƠNG BÀN LUẬN 50 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACTs Artemisinine-base Combination Therapy ADN Acid deoxyribonucleic Bp Base pair DHA-PPQ Dihydroartemisinine-piperaquine dNTPs Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Thuốc sốt rét phối hợp với Artemisinin Cặp bazơ ni tơ KST Ký sinh trùng KSTSR Ký sinh trùng sốt rét L Ladder Thang đo kích thƣớc phân tử Msp2 Mezoroite Surface Protein Protein bề mặt NCBI National Center for Biotechnology Information Sốt rét SR WHO World Heath Organization Tổ chức Y tế Thế giới Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Mƣời tỉnh có tỷ lệ ký sinh trùng sốt rét lƣu hành cao năm 2014 Bảng 1.2 Thời gian KSTSR P falciparum kháng với loại thuốc sốt rét Bảng 1.3 Danh sách vị trí đột biến gen K13 xác định kháng liên quan kháng artemisinin theo WHO 2015 20 Bảng 3.1 Kết xác định tỷ lệ nhiễm đơn nhiễm phối hợp kiểu gen mẫu nhiễm P falciparum ngày D0 D3 theo locus gen msp2 36 Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ đột biến gen K13 nhóm mẫu bệnh nhân ngày D0 ngày D3 44 Bảng 3.3 Tần suất vị trí đột biến gen K13 nhóm mẫu có đột biến 46 Bảng 3.4 Kết xác định đột biến gen K13 nhóm ký sinh trùng sốt rét ngày D3 D0 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Bản đồ quốc gia vùng lãnh thổ có lan truyền sốt rét Hình 1.2 Cấu trúc protein K13 P falciparum 12 Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc 3D protein K13 P falciparum 13 Hình 1.4 Đọc trình tự nucleotit theo phƣơng pháp Sanger 24 Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu nhiễm đơn P falciparum 35 Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR số mẫu nhiễm kiểu gen FC 36 Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR số mẫu nhiễm kiểu gen IC 37 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phảm PCR nhân bội gen K13 38 Hình 3.5 Giản đồ giải trình tự nucleotit đoạn gen K13 P falciparum nhiễm mẫu bệnh nhân ngày D3 39 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự nucleotit gen K13 mẫu 3D7 phòng thí nghiệm với trình tự đơn dòng 3D7 cơng bố ngân hàng gen 40 Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotit đoạn gen K13 mẫu P falciparum ngày D0 phát hiệnđiểm đột biến 42 Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotit đoạn gen K13của mẫu P falciparum ngày D3 phát đột biến điểm 43 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự axit amin để xác định đột biến gen K13 P falciparum mẫu ngày D0 45 Hình 3.10 Kết so sánh trình tự axit amin để xác định đột biến gen K13 P falciparum mẫu ngày D3 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii Nghi ngờ kháng: đƣợc xác định tỷ lệ bệnh nhân có ký sinh trùng dƣơng tính kéo dài cao (D3 > 10%), tỷ lệ đột biến kháng gen K13 cao (>5%); - Khẳng định kháng: bệnh nhân có đột biến kháng gen K13 có ký sinh trùng dƣơng tính kéo dài Dựa kết nghiên cứu nhiều quốc gia, WHO tổng kết phân loại vị trí đột biến gen K13 liên quan đến xác định kháng artemisininđã đƣợc phát nhƣ trình bày Bảng 1.3 Kết phân tích 65 mẫu ADN ký sinh trùng sốt rét P falciparumở bệnh nhân sốt rét Bình Phƣớc xác định 58,46% số mẫu mang đột biến K13 với trongbốn vị trí đột biến quan trọng Y493H, I543T, P553L C580Y Trong có 03 đột biến khẳng định tính kháng artemisinin, đặc biệt vị trí C580Y có tần suất xuất cao mẫu đột biến với tỷ lệ 81,58% Kết gợi ý mức kháng cao P falciparum Bình Phƣớc với artemisinin Dựa vào kết xác định đột biến 65 mẫu bệnh nhân cho thấy đột biến gen K13 kháng artemisinin phát đƣợc 02 nhóm bệnh nhân ngày D0 ngày D3 nhƣng có chênh lệch tỷ lệ đột biến (Bảng 3.4) Bảng 3.4.Kết xác định đột biến gen K13 nhóm ký sinh trùng sốt rét ngày D3 D0 - Kết Nhóm D3 Nhóm D0 (n=31) (n=34) Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) Đột biến 23 74,19 15 44,12 Không đột biến 08 25,81 19 55,88 P 0,027 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 48 Vậy có hay khơng liên quan đột biến K13 với kết ký sinh trùng dƣơng tính kéo dài ngày D3? Để trả lời câu hỏi chúng tơi sử dụng phƣơng pháp phân tích hồi quy logistic với phần mềm phân tích thống kê R v3.2.3 để phân tích xác định giá trị tỷ số nguy OR Kết phân tích thống kê đƣợc trích xuất Hình 3.11 Call:glm(formula = proportion ~ db, family = "binomial", weights = ntotal) Deviance Residuals: [1] 0 Coefficients: Estimate Std Error z value Pr(>|z|) (Intercept) -0.8650 0.4215 -2.052 0.0401 * db 1.2924 0.5364 2.409 0.0160 * Signif codes: „***‟ 0.001 „**‟ 0.01 „*‟ 0.05 „.‟ 0.1 „ ‟ Hình3.11.Kết quảphân tích hồi quy logistic phần mềm R v3.2.3 Kết phân tích phần mềm R cho giá trị ƣớc sốαˆ = -0,8650; βˆ =1,2924 Từ kết này, tính tỷ số nguy OR theo công thức OR = 𝑒 βˆ = e1,2924 = 3,64, với trị số p =0,0160 Hơn nữa, ƣớc số βˆ có giá trị dƣơng cho thấy có mối tƣơng quan thuận đột biến gen K13 với nguy bệnh nhân ký sinh trùng ngày D3 đột biến gen K13 làm tăng nguy (khả năng) bệnh nhân ký sinh trùng ngày D3 so với nhóm khơng có đột biến gen khoảng 3,64 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p 95%), nhiên tỷ lệ dƣơng tính ký sinh trùng D3 có dấu hiệu tăng với tỷ lệ >10% theo thời gian; Bình Phƣớc năm 2009 15,3%, năm 2012 30,6%, 36% năm 2014; Đắc Nông Gia Lai lần lƣợt 29,2% 22,8% năm 2012 [8, 51] Việc đánh giá xác tình trạng KSTSR kháng thuốc, dự báo nguy phát triển kháng lan rộng có vai trò vơ quan trọng, cung cấp sở khoa học để điều chỉnh sách sử dụng thuốc quốc gia Hiện việc theo dõi hiệu lực thuốc chủ yếu dựa vào phƣơng pháp theo dõi in vivo28 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50 42 ngày [47] Tuy nhiên phƣơng pháp in vivo có nhiều hạn chế nhƣ đòi hỏi tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiêm ngặt, thời gian theo dõi bệnh nhân dài ngày, chi phí lớn, yếu tố miễn dịch, hấp thụ thuốc ảnh hƣởng đến kết nghiên cứu, khó triển khai diện rộng, khơng phân biệt đƣợc KST xuất lại trình theo dõi thực địa tái phát lại hay bị nhiễm KST Các kỹ thuật sinh học phân tử giải pháp khắc phục đƣợc nhiều nhƣợc điểm kỹ thuật in vivo Tuy nhiên cần phải xác định đƣợc thị phân tử liên quan đến chế biểu kháng thuốc sốt rét Gen K13 đƣợc xác định thị phân tử phát kháng artemisinin, có liên quan chặt chẽ với việc kéo dài thời gian ký sinh trùng thử nghiệm in vitrovà in vivo[19, 42] Hiện phƣơng pháp phát đột biến gen K13 đƣợc sử dụng giải trình tự gen ADN Các kết nghiên cứu giới công bố cho thấy vị trí đột biến tần xuất vị trí đột biến liên quan đến kháng artemisinin tỷ lệ ký sinh trùng dƣơng tính ngày D3 có khác vùng địa lý nhƣ Cam-pu-chiacó vị trí với tần xuất đột biến cao (>5%) C580Y, R539T Y493H Sự phân bố tần suất alen đột biến tỉnh khác phù hợp với tỷ lệ KSTSR dƣơng tính ngày D3 bệnh nhân nhiễm P falciparum sau đƣợc điều trị với thuốc phối hợp ACTs [19, 23] Nghiên cứu từ 2007 đến 2012 biên giới Trung Quốc Mi-an-ma đột biến F446I chiếm ƣu với 27,2%, tiếp đến P574L chiếm 6,7%, C580Y xuất với tần số thấp 1,6% [17, 45] Dựa kết nghiên cứu nhiều quốc gia, WHO tổng kết phân loại 13 vị trí đột biến gen K13 liên quan đến xác định kháng artemisinin, bốn vị trí đột biến xác định kháng artemisinin 493H, 539T, 543T 580Y Các vị trí đột biến đƣợc khẳng định lƣu hành phổ biến khu vực Tiểu vùng Sông Mêkông, cụ thể nƣớc nhƣ Cam-pua-chia, Lào, Việt Nam [51] Kết phân tích giải trình tự ADN gen K13 P falciparum 65 mẫu bệnh nhân ngày D0 D3 thu thập Bình Phƣớc năm 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51 nghiên cứu phát đƣợc vị trí đột biến Y493H, I543T, P553L C580Y Trong có 03 đột biến đƣợc khẳng định tính kháng với artemisinin Đột biến vị trí C580Y phổ biến nhất, chiếm tỷ lệ 81,58% Các đột biến vị trí khác xuất với tần suất thấp nhƣ P553L 10,53%, I543T 5,26% Y493H 2,63% Các vị trí đột biến đƣợc phát có tƣơng đồng với kết nghiên cứu Cam-pu-chia Mian-ma [19, 35, 45], phù hợp với kết đánh giá WHO năm 2015 [51] nhƣng có khác biệt với kết nghiên cứu đƣợc công bố Kamala Thriemer cộng (2015) nghiên cứu Quảng Nam từ 2012-2013, phân tích 83 mẫu phát đột biến gen K13, nhiên có đột biến khẳng định kháng vị trí 543 với 80,7% vị trí 493 với 1,3%, khơng tìm thấy đột biến vị trí 539 580 Mẫu phân lập mang đột biến vị trí 543 có thời gian chậm làm KSTSR cao đáng kể so với mẫu mang đột biến kiểu hoang dại Độ nhạy, độ đặc hiệu đột biến 543 với tình trạng chậm làm KSTSR lần lƣợt 91,4% 27,1% [26] Dựa số liệu thu đƣợc phân tích đột biến gen K13 65 bệnh nhân sốt rét ngày D0, D3 phân tích hồi quy logistic nhận định rằngcó mối tƣơng quan thuận chiều đột biến gen K13 với nguy bệnh nhân ký sinh trùng ngày D3 bệnh nhân đƣợc điều trị ACTs Tỷ lệ cao 3,64 lần so với nguy từ bệnh nhân mang ký sinh trùng khơng có vị trí đột biến kháng K13 (p