-1 T R Ầ N T R U N G N G À N H : SI N H BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI - - - - - - TRẦN TRUNG KIÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH, TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA TỪ HAI LOÀI Ipomoea batatas L VÀ Ipomoea cairica L LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC K H Ó A 20 06 20 HÀ NỘI, 2009 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Béo phì đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn chuyển hóa – nội tiết Béo phì, theo tổ chức y tế giới WHO tình trạng tích lũy mỡ q mức khơng bình thường vùng thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe như: bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tiểu đường, đột quỵ, giảm khả sinh sản, giảm chức hô hấp, tăng viêm xương khớp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa Đái tháo đường với biểu chung tăng glucose huyết hay tăng đường huyết tế bào β đảo tụy Langerhan bị phá hủy khả sản xuất insulin (ĐTĐ typ 1) rối loạn trao đổi chất lipid – glucid dẫn đến đối kháng insulin (ĐTĐ typ 2) Đái tháo đường béo phì hai biểu bệnh thường có mối quan hệ bệnh lý chặt chẽ với Cùng với bệnh tim mạch ung thư, đái tháo đường thực trở thành mối lo ngại đáng báo động toàn giới Ở Việt Nam, số liệu thống kê gần cho thấy đái tháo đường bệnh thường gặp có tỉ lệ tử vong cao bệnh nội tiết Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa có hệ thực vật phong phú, đa dạng, có nhiều loại cỏ cho vị thuốc quý Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học ứng dụng y dược số loại cần thiết Việc sử dụng loại thuốc tân dược thường có tác dụng phụ khơng mong muốn thường đắt tiền Các loại thuốc dược liệu từ cỏ thường gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng thuốc kéo dài Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học tác dụng dược lý lồi thuốc có giá trị Việt Nam nhằm đặt sở khoa học cho việc sử dụng chúng cách hợp lý, hiệu có tầm quan trọng đặc biệt Trên sở kết nghiên cứu M.Yoshimoto cộng (2004) tác động hạ glucose huyết khoai lang (Ipomoea batatas L.) mô hình chuột nhắt gây bệnh STZ [42] Chính tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh, tác dụng hạ đường huyết số hợp chất tự nhiên từ hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L.” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu số thành phần hóa sinh hai lồi Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L Tác dụng hạ đường huyết số hợp chất tự nhiên mơ hình chuột béo phì đái tháo đường typ Nhiệm vụ nghiên cứu Để thực mục tiêu trên, tiến hành nội dung sau: Tách chiết hợp chất tự nhiên cách sử dụng loại dung môi hữu chiết qua phân đoạn Định tính hợp chất tự nhiên phản ứng đặc trưng Định lượng theo phương pháp Folin – Ciocalteau Phân lập số hợp chất từ hai loàI Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L kĩ thuật sắc kí lớp mỏng Thiết kế mơ hình chuột bị bệnh béo phì đái tháo đường typ Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết, tiêu mỡ máu chuột bị bệnh béo phì đái tháo đường thực nghiệm Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 4.1 Mẫu thực vật Mẫu thực vật hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L., mọc phổ biến vùng trung du Bắc Bộ Được TS Trần Văn Ơn, trường ĐH Dược Hà Nội giám định tên khoa học 4.2 Mẫu động vật Chuột nhắt chủng Swiss nặng từ 14 – 16g, mua Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương 4.3 Phạm vi nghiên cứu Chỉ tiến hành đối tượng rau Khoai lang, Bìm bìm mơ hình thực nghiệm chuột béo phì, đái tháo đường typ Phương pháp nghiên cứu 5.1 Định tính thành phần hóa học hợp chất tự nhiên từ hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L 5.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp quang phổ Folin – Ciocalteau (Phương pháp Orthofer etal, 1999) 5.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết chống béo phì dịch chiết hai loài rau Khoai lang (Ipomoea batatas L.) Bìm bìm (Ipomoea cairica L.) 5.4 Phương pháp phân lập hợp chất sắc kí lớp mỏng Giả thuyết khoa học Sau thực nghiệm, chúng tơi dự kiến đưa đóng góp sau: Đưa qui trình tách, chiết số hợp chất tự nhiên cách sử dụng dung môi hữu tách qua phân đoạn Phân lập số hợp chất từ hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết, tiêu mỡ máu chuột bị bệnh béo phì đái tháo đường thực nghiệm NỘI DUNG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY KHOAI LANG ĐỎ (Ipomoea batatas L.) VÀ CÂY BÌM BÌM (Ipomoea cairica L.) 1.1.1 Cây Khoai lang (Ipomoea batatas (L.)) [9] 1.1.1.1 Thực vật học Khoai lang gọi cam chư, phan chư, cam thự, hồng thự, có tên khoa học Ipomoea batatas L Lam., thuộc họ Khoai lang Convolvulaceae, thảo sống lâu năm, có thân mọc bò, dài 2-3m Rễ phình thành củ tròn dài, màu đỏ, trắng hay vàng Lá có nhiều hình dạng, hình tim xẻ ba năm thùy, sâu hay cạn, có cuống dài Hoa màu tím nhạt hay trắng, mọc thành xim hoa đầu cành hay nách 1.1.1.2 Phân bố, sinh thái Nhờ tính thích nghi tương đối rộng, khoai lang trồng khắp nơi giới, từ vĩ độ - 45 Bắc Nam Các xứ trồng nhiều khoai lang gồm có: Trung Quốc, Indonesia, Nhật, Ấn Độ, Philippines, Brazil, Argentina, Mỹ, Nhật Bản nước trồng Khoai lang có suất ổn định cao Tại Khoai lang xem lương thực quan trọng hàng thứ hai sau lúa gạo Tại Hoa Kỳ, Khoai lang trồng nhiều tiểu bang phía nam, từ Bắc Carolina đến Texas xem thức ăn dân vùng [4] Ở Việt Nam, tỉnh phía Bắc, Khoai lang trồng tập trung nhiều Nghệ An, Hà Tĩnh, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Tại tỉnh phía Nam, Khoai lang trồng tập trung tỉnh Quảng Nam Đà Nẵng, rải rác Quảng Ngãi, Phan Rang, Phan Thiết Đồng Nai Tuy loại hoa màu có nguồn gốc nhiệt đới (Nam Mỹ, Ấn Độ), Khoai lang mọc nhiều loại đất khí hậu khác Đất đai: Khoai lang mọc nhiều loại đất khác từ sa cấu cát đến sét nặng Tuy nhiên loại đất thích hợp đất xốp dễ nước, có sa cấu từ cát đến thịt pha cát phải màu mỡ Khoai lang tương đối chịu mặn, pH thích hợp từ 4,2 - 8,3 Khí hậu: Khoai lang chịu lạnh kém, mọc tốt nhiệt độ tương đối ấm áp 0 từ 15 - 35 C, chịu nhiệt độ lên đến 45 C Vì thích hợp vùng khí hậu nhiệt đới, cho củ phẩm chất tốt, sơ 1.1.1.3 Thành phần hóa học Củ Khoai lang chứa 24,6% tinh bột, 4,17% glucose Khi tươi, củ chứa 1,3% protein, 0,1% chất béo, diastase, tro có Mn, Ca, Cu, vitamin A, B, C, 4,24% tanin, 1,375% pentosan Khi phơi khô chỗ mát, củ có inosit, gơm, dextrin, acid chlorogenic, phytosterol, carotin, adenin, betain, cholin Dây Khoai lang chứa adenin, betain, cholin Ngọn dây Khoai lang có chất gần giống insulin, già khơng có chất Lá chứa chất nhựa tẩy (1,95-1,97%) [4, 9] 1.1.1.4 Một số tác dụng Sinh - Dược công dụng Khoai lang [42] Lá Khoai lang loại rau dân dã vừa ngon, vừa mát bổ Củ rau Khoai lang vị thuốc phòng chữa bệnh dùng từ lâu dân gian, có nơi gọi "sâm nam" Củ Khoai lang có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bồi bổ thể, ích khí, cường thận, kiện vị, tiêu viêm, can, lợi mật, sáng mắt Nó dùng chữa vàng da, ung nhọt, viêm tuyến vú, phụ nữ kinh nguyệt không đều, nam giới di tinh, trẻ em cam tích, lỵ Khoai lang loại thức ăn tốt cho bệnh nhân tiểu đường Ngọn dây khoai lang đỏ có chất gần giống insulin Các nghiên cứu cho thấy, củ khoai lang chứa caiapo - hợp chất giúp kiểm soát tốt lượng đường cholesterol máu người mắc tiểu đường type Theo tiến sĩ Bemhard Luđvik thuộc đại học Vienna (Áo), caiapo chất kiểm soát bệnh tiểu đường type hiệu Không phản ứng phụ ghi nhận bệnh nhân điều trị chất Lượng cholesterol máu nhóm dùng caiapo thấp hẳn so với nhóm đối chứng [42] Ngồi khoai lang dược dùng để chữa nhiều bệnh khác như: táo bón, thiếu sữa, tùy vị hư yếu, không muốn ăn uống, viêm dày, tá tràng, 1.1.2 Cây Bìm bìm (Ipomoea cairica L.) [4, 9] 1.1.2.1 Thực vật học Cây Bìm bìm có tên khoa học Ipomoea cairica L Sweet Thuộc họ Khoai lang Convolvulaceae Là loại leo, thân quấn Thân cảnh mảnh, nhẵn, mọc so le, có thùy xẻ sâu tới tận cuống lá, hình chân vịt, phiến mỏng, hình mác, đầu nhọn, hai mặt nhẵn, gân rõ Cuống dài 2-5cm, có năm nhỏ kèm theo chồi nách sinh Cụm hoa mọc kẽ lá, lưỡng phân Hoa to, hình phễu, có màu trắng lam tím Quả nang hình cầu Cây hoa từ tháng tới tháng 12 1.1.2.2 Nơi sống thu hái Bìm bìm lồi cổ nhiệt đới, thường mọc hoang nhiều nơi, mọc quấn vào hàng rào bụi khác Nhân dân địa phương trồng làm cảnh, trồng bờ rào, làm dàn che nắng Thu hái toàn quanh năm Rửa sạch, cắt ngắn đoạn, dùng tươi hay phơi khơ 1.1.2.3 Thành phần hóa học Hạt chứa chất glucosid màu vàng nhạt muricatin A có tính xổ, dầu béo 11,5%, chất khơng xà phòng hóa chứa β-sitosterol 1.1.2.4 Tính vị, tác dụng, cơng dụng Vị ngọt, tính hàn, có độc, có tác dụng nhiệt, lợi tiểu Rễ củ thân có vị đắng Dân gian thường dùng đâm rịt trị bệnh đầu voi Hawai, người ta dùng rễ củ thân để ăn Ở Ấn độ, người ta dùng giã xoa đắp thể người bị ban; hạt dùng làm thuốc xổ Ở Trung quốc, người ta dùng trị: Ho bệnh phổi; Giảm niệu; đái máu; Phù thũng Dùng liều – 12g dạng thuốc sắc Không dùng cho người bị ốm, yếu Dùng trị đinh nhọt, viêm mủ da, đòn ngã tổn thương, giã tươi đắp vào chỗ đau [4, 9] Hiện chưa có tài liệu nghiên cứu khả điều hòa lượng đường máu hợp chất từ Bìm bìm 1.2 GIỚI THIỆU VỀ MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN Ở THỰC VẬT 1.2.1 Hợp chất phenolic [18, 31] 1.2.1.1 Đặc điểm chung phân loại Thuật ngữ “hợp chất phenolic” dùng để nhóm hợp chất có cấu trúc vòng benzen, mang hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen Vì gọi hợp chất phenol Trong tự nhiên, hợp chất phenolic phân bố phổ biến thực vật, chúng thường tồn dạng glycoside dễ tan nước tập trung không bào Các hợp chất phenolic chiếm vị trí quan trọng đời sống thực vật, chúng tham gia vào nhiều trình sinh lí, sinh hóa quan trọng như: điều hòa trình trao đổi chất hình thức khác nhau, tham + gia vào q trình hơ hấp vận chuyển H q trình phosphoryl hóa oxy hóa… Dựa vào thành phần cấu trúc, người ta phân hợp chất phenolic thành ba nhóm: hợp chất phenolic đơn giản, hợp chất phenolic phức tạp nhóm hợp chất phenolic đa vòng (polyphenol) - Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: phân tử có vòng benzen hay nhiều nhóm hydroxyl Tùy thuộc vào số lượng nhóm hydroxyl mà chúng gọi monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquinon,…), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquinol,…) - Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: thành phần cấu trúc phân tử chúng ngồi vòng thơm benzen (C6) có dị vòng, mạch nhánh Nhóm phân thành: Nhóm C6 – C1 (acid phenol carbonic): cấu trúc phân tử có thêm nhóm carbonyl, thường gặp hạt nảy mầm Nhóm C6 – C3 (acid coumaric, acid cafeic): có gốc carbonyl nối với nhân benzen qua hai nguyên tử carbon, thường gặp thực vật bậc cao Nhóm đa vòng C6 – C1 – C6 (flavonoid): nhóm đa dạng, cấu trúc phân tử gồm hai vòng benzen, vòng pyran phân thành nhóm phụ như: flavon, flavonol (sắc tố vàng), antoxyanidin (sắc tố xanh, đỏ, tím), catechin (khơng màu)… - Nhóm hợp chất phenolic polymer: chia thành nhóm phụ như: tanin, ligin, melanin, acid humic 1.2.1.2 Vai trò hợp chất phenolic thực vật [6, 29] Hợp chất phenolic có hầu hết phận đặc biệt tế bào thực vật quang hợp Chúng hình thành từ sản phẩm trình đường phân đường pentose qua acid cynamic hay theo đường acetate malonate qua Acetyl – CoA Nhóm hợp chất có số chức đời sống thực vật: - Các hợp chất phenolic tham gia vào trình hô hấp chất vận chuyển hydro - Các polyphenol hình thành liên kết hydro với protein enzyme làm thay đổi hoạt động enzyme tương tự hiệu ứng dị lập thể Nó làm tăng giảm hoạt động enzyme - Hợp chất phenol tác dụng mạnh lên trình sinh trưởng, đóng vai trò chất hoạt hóa AIA – oxydase tham gia vào trình sinh tổng hợp enzyme 40 Wadood N, Wadood A, Shah SA ( 1992), “Effect of Tinospora cordifolia on blood glucose and total lipid levels of normal and alloxan-diabetic rabbits”, Planta Med, 58(2), pp 131-136 41 WHO (1994), Prevention ofdiabetes mellitus, Geneva 42 Yoshimoto M., Kurata R., Okuno S., Yamakawa O., Tsubata M.Mori S And Takagaki K (2004), “Nutrient value of and product development from sweetpotato leaves”, Proceedings, consise paper of second International symposium on sweetpotato and cassava, pp 183 - 84 Tóm tắt LV: MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Đái tháo đường béo phì hai biểu bệnh thường có mối quan hệ bệnh lý chặt chẽ với Cùng với bệnh tim mạch ung thư, đái tháo đường thực trở thành mối lo ngại đáng báo động toàn giới Ở Việt Nam, số liệu thống kê gần cho thấy đái tháo đường bệnh thường gặp có tỉ lệ tử vong cao bệnh nội tiết Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa có hệ thực vật phong phú, đa dạng, có nhiều loại cỏ cho vị thuốc quý Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học ứng dụng y dược số loại cần thiết Trên sở kết nghiên cứu M.Yoshimoto cộng (2004) tác động hạ glucose huyết rau Khoai lang (Ipomoea batatas (L.) Lam) mơ hình chuột nhắt gây bệnh STZ Chính tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh, tác dụng hạ đường huyết số hợp chất tự nhiên từ hai loài Ipomoea batatas (L.) Ipomoea cairica (L.)” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu số thành phần hóa sinh hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L Tác dụng hạ đường huyết số hợp chất tự nhiên mơ hình chuột béo phì đái tháo đường typ Nhiệm vụ nghiên cứu Để thực mục tiêu trên, tiến hành nội dung sau: Tách chiết hợp chất tự nhiên cách sử dụng loại dung môi hữu chiết qua phân đoạn Định tính hợp chất tự nhiên phản ứng đặc trưng Định lượng theo phương pháp Folin – Ciocalteau Phân lập số hợp chất từ hai loàI Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L kĩ thuật sắc kí lớp mỏng Thiết kế mơ hình chuột bị bệnh béo phì đái tháo đường typ Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết, tiêu mỡ máu chuột bị bệnh béo phì đái tháo đường thực nghiệm Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 4.1 Mẫu thực vật Mẫu thực vật hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L., mọc phổ biến vùng trung du Bắc Bộ Được TS Trần Văn Ơn, trường ĐH Dược Hà Nội giám định tên khoa học 4.2 Mẫu động vật Chuột nhắt chủng Swiss nặng từ 14 – 16g, mua Viện vệ sinh dịch tễ 4.3 Phạm vi nghiên cứu Chỉ tiến hành đối tượng rau khoai lang, bìm bìm mơ hình thực nghiệm chuột béo phì, đái tháo đường typ Phương pháp nghiên cứu 5.1 Định tính thành phần hóa học hợp chất tự nhiên từ hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L 5.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp quang phổ Folin – Ciocalteau (Phương pháp Singleton and Orthofer, 1999) 5.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết chống béo phì dịch chiết hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L 5.4 Phương pháp phân lập hợp chất sắc kí lớp mỏng Giả thuyết khoa học Sau thực nghiệm, dự kiến đưa đóng góp sau: Đưa qui trình tách, chiết số hợp chất tự nhiên cách sử dụng dung môi hữu tách qua phân đoạn Phân lập số hợp chất từ hai loài Ipomoea batatas L Ipomoea cairica L Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết, tiêu mỡ máu phân đoạn dịch chiết khoai lang chuột bị bệnh béo phì đái tháo đường thực nghiệm NỘI DUNG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY KHOAI LANG ĐỎ (Ipomoea batatas L.) VÀ CÂY BÌM BÌM (Ipomoea cairica L.) 1.1.1 Cây Khoai lang (Ipomoea batatas L.) 1.1.1.1 Thực vật học 1.1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.1.4 Một số tác dụng Sinh - Dược cơng dụng Khoai lang 1.1.2 Cây Bìm bìm (Ipomoea cairica L.) 1.1.2.1 Thực vật học 1.1.2.2 Nơi sống thu hái 1.1.2.3 Thành phần hóa học 1.2 GIỚI THIỆU VỀ MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN Ở THỰC VẬT 1.2.1 Hợp chất phenolic 1.2.2 Flavonoid thực vật 1.2.2.1 Cấu tạo hóa học phân loại 1.2.2.2 Tính chất vật lí 1.2.2.3 Tính chất hóa học - Phản ứng nhóm hydroxyl (-OH) - Phản ứng với dung dịch kiềm (tính acid) - Phản ứng vòng thơm (phản ứng diazo hóa) - Phản ứng nhóm carbonyl (phản ứng Shinoda) 1.2.2.4 Tác dụng sinh, dược học flavonoid * Tác dụng chống oxy hóa * Flavonoid có khả điều hòa hoạt độ enzyme * Tác dụng làm bền thành mạch (hoạt tính vitamin P), * Flavonoid có tác dụng chống ung thư * Flavonoid có tính kháng khẩn, kháng virus, 1.2.3 Tannin 1.2.3.1 Cấu trúc hóa học phân loại 1.2.3.2 Tính chất vật lý 1.2.3.3 Tính chất hóa học 1.2.3.4 Tác dụng sinh học 1.2.4 Alkaloid 1.2.4.1 Khái niệm phân loại 1.2.4.2 Tính chất vật lý 1.2.4.3 Tính chất hóa học 1.2.4 Tác dụng sinh học 1.2.5 Glycoside 1.3 BỆNH BÉO PHÌ 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Phương pháp đánh giá 1.3.3 Thực trạng béo phì giới Việt Nam 1.3.4 Các tác hại nguy béo phì 1.3.4.1 Béo phì yếu tố nguy cho bệnh tim mạch 1.3.4.2 Béo phì đái tháo đường typ 1.3.4.3 Giảm khả sinh sản phụ nữ 1.3.4.4 Giảm chức hô hấp 1.3.4.5 Tăng nguy viêm xương khớp 1.3.4.6 Ung thư 1.3.4.7 Bệnh đường tiêu hóa 1.4 RỐI LOẠN TRAO ĐỔI LIPID MÁU VÀ BỆNH LÝ PHÁT SINH DO BÉO PHÌ 1.4.1 Rối loạn trao đổi lipid máu 1.4.2 Bệnh lý phát sinh béo phì 1.5 BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG (ĐTĐ) 1.5.1 Đái tháo đường 1.5.2 Chẩn đốn phân loại đái tháo đường 1.5.2.1 Chẩn đoán bệnh đái tháo đường 1.5.2.2 Phân loại đái tháo đường 1.5.3 Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ 1.5.4 Các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ 1.6 PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐÁI THÁO ĐƯỜNG THỰC NGHIỆM BẰNG STZ Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Mẫu thực vật Khoai lang (Ipomoea batatas L.) Bìm bìm (Ipomoea cairica L.) thu hái vào tháng năm 2008 2.1.2 Mẫu động vật Chuột nhắt trắng chủng Swiss tuần tuổi, nặng 14 – 16g Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp 2.1.3 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Quy trình chiết xuất Bột khơ rau Khoai lang Bìm bìm ngâm chiết với ethanol 80% nhiệt độ phòng vòng 10 ngày (quá trình lặp lại lần) Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc cất loại dung môi áp suất giảm máy cất quay chân khơng thu cặn ethanol Cặn ethanol hòa tan nước nóng chiết với dung mơi hexan, chlorofom, ethylacetat, cất loại dung môi áp suất giảm thu cặn chiết tương ứng 2.2.2 Phương pháp xác định chất khơ tuyệt đối 2.2.3 Định tính số nhóm hợp chất tự nhiên rau khoai lang bìm bìm 2.2.3.1 Định tính flavonoid - Phản ứng Shinoda - Phản ứng diazo hóa - Phản ứng định tính catechin - Phản ứng với acid sunfuric 2.2.3.2 Định tính tannin - Phản ứng với vanilin - Phản ứng với gelatin/NaCl - Phản ứng với acetate chì 2.2.3.3 Định tính polyphenol khác - Phản ứng với dung dịch kiềm - Phản ứng với FeCl3 2.2.3.4 Định tính glycoside - Phản ứng Keller-Killian 2.2.3.5 Định tính alkaloid - Phản ứng với thuốc thử Dragendroff 2.2.3.6 Định tính saponin - Phản ứng tạo bọt 2.2.4 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau 2.2.5 Sắc ký lớp mỏng 2.2.6 Tạo mơ hình chuột béo phì thực nghiệm phân lô chuột Chuột chia thành 09 lô (mỗi lô gồm con, riêng lô có12 con), tuần chuột ăn thức ăn với hàm lượng lipid cholesterol cao Riêng lô ăn thức ăn tiêu chuẩn viện vệ sinh dịch tễ cung cấp Các lô chuột thiết kế sau: Lơ 1: khơng gây béo phì, khơng tiểu đường, uống nước muối sinh lí (NaCl 0,9%) Lơ 2: béo phì, khơng điều trị Lơ 3: béo phì, gây ĐTĐ typ 2, khơng điều trị Lơ 4: béo phì, gây ĐTĐ typ 2, điều trị Metformin (liều 500mg/kg thể trọng) Lơ 5: béo phì, điều trị Metformin (liều 500mg/kg thể trọng) Lơ 6: béo phì, điều trị phân đoạn ethanol tổng số (liều 800mg/kg thể trọng) Lơ 7: béo phì, ĐTĐ typ 2, điều trị phân đoạn ethanol tổng số (liều 800mg/kg thể trọng) Lô 8: béo phì, điều trị phân đoạn ethylacetat (liều 800mg/kg thể trọng) Lơ 9: béo phì, ĐTĐ typ 2, điều trị phân đoạn ethylacetat (liều 800mg/kg thể trọng) 2.2.7 Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô theo typ Chuột nhắt cho nhịn ăn 12h trước tiến hành gây ĐTĐ STZ STZ pha đệm citrate (0,01M, pH 4,5) giữ lạnh sử dụng Chuột gây bệnh tiêm màng bụng dung dịch STZ với liều 90mg/kg thể trọng Lô đối chứng tiêm đệm citrate Sau tiêm chuột cho ăn bình thường Xác định nồng độ glucose huyết chuột trước sau 72h tiêm STZ Chuột coi mắc bệnh ĐTĐ nồng độ glucose huyết lúc đói ≥ 18mmol/l Sau tiếp tục theo dõi nồng độ glucose huyết tuần điều trị phân đoạn 2.2.8 Cách xác định số số hóa sinh trước sau điều trị dịch chiết 2.2.8.1 Phương pháp định lượng glucose huyết 2.2.8.2 Xác định nồng độ triglycerid máu 2.2.8.3 Xác định nồng độ cholesterol máu Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT CÁC PHÂN ĐOẠN Để khảo sát thành phần hóa học dây khoai lang bìm bìm, chúng tơi tiến hành chiết rút mơ tả phần phương pháp thu cao ethanol Phân bố cao ethanol nước cất, sau chiết phân lớp với dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethylacetate Các dịch chiết tương ứng cất loại áp suất giảm thu phân đoạn dịch chiết n – hexan, chlorofrom, ethylacetat phân đoạn nước Khối lượng mẫu thu chiết qua phân đoạn rau khoai lang bìm bìm sau: Bảng 3.1 Khối lượng mẫu thu chiết qua phân đoạn hiệu suất (% nguyên liệu khô) Mẫu Các phân đoạn Cao cồn Mẫu ban đầu (g) Khoai lang Mẫu % khô nguyên tuyệt liệu đối khô (g) Mẫu ban đầu (g) Bìm bìm Mẫu % khơ ngun tuyệt liệu đối khô (g) 168 25,2 15 172 22,36 13 34,9 1,745 35,7 1,428 6,4 0,064 6,5 0,065 13,9 0,417 14,2 0,426 77,2 - - 79,2 - - tổng số Phân đoạn n – hexan Phân đoạn Chloroform Phân đoạn Ethylacetat Phân đoạn nước 3.2 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN Kết trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết định tính thành phần hợp chất tự nhiên từ rau khoai lang bìm bìm Nhómchất Pol yph eno l Flavon oid Catec -hin Tanin Polyp henol khác Phản ứng đặc trưng Rau khoai lang 1* 2* 3* 4* Shinoda +++ - - Diazo +++ - + H2SO4 đặc ++ + - Vanilin/ HCl Acetat chì Gelatin/ NaCl NaOH 10% FeCl3 5% + - - ++ + ++ + ++ + - ++ ++ + + + ++ - + + + + Lá bìm bìm 2* 4* * ++ + ++ + ++ - +++ 1* + - + ++ + - - - ++ ++ ++ ++ + + ++ + ++ + ++ + - + + + + + ++ +++ - - + - ++ - - - Alkaloid Kellerkillian Dragendroff ++ ++ - + ++ + + +++ ++ + - - + + - - ++ + + - Saponin Vans Mayer Tạo bọt ++ + ++ + - - - Glycoside + Với 1* Cao ethanol, 2* Phân đoạn n-hexan, 3* Phân đoạn chloroform, 4* Phân đoạn ethylacetate (-): không phản ứng ; (+): phản ứng; (++): phản ứng mạnh; (+++): phản ứng mạnh 3.3 ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG SỐ TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT Hàm lượng polyphenol phân đoạn ethylacetat nhiều (Khoai lang 8,39%, Bìm bìm 7,83%), tiếp đến cao cồn tổng số (Khoai lang 6,59%, Bìm bìm 5,41%), phân đoạn chloroform nhiên phân đoạn lại thấy bìm bìm có hàm lượng polyphenol cao (3,88%) Khoai lang (3,63%), phân đoạn n- hexan có hàm lượng polyphenol (khoai lang 2,92%, bìm bìm 2,69%) Xem bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết định lượng polyphenol tổng số phân đoạn rau khoai lang Các giá trị bìm bìm Rau khoai lang Lá bìm bìm OD765nm Nồng độ (mg/l) Tỷ lệ % OD765nm Nồng độ (mg/l) Tỷ lệ % đoạn Cao ethanol 0,672 659,2 6,59 0,554 541,2 5,41 Phân đoạn 0,305 292,2 2,92 0,282 269,2 2,69 0,376 363,2 3,63 0,401 388,2 3,88 0,852 839,2 8,39 0,796 783,2 7,83 Các phân n – hexan Phân đoạn chloroform Phân đoạn ethylacetate 3.4 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG Quan sát sắc kí đồ chúng tơi thấy có nhiều băng với nhiều màu sắc khác màu vàng (đặc trưng flavonoid), màu tím (đặc trưng tecpen), màu xanh (đặc trưng diệp lục) chứng tỏ dịch chiết rau khoai lang có chứa đầy đủ loại polyphenol Phân đoạn ethylacetat cao cồn tổng số chiết nhiều hợp chất polyphenol Phù hợp với kết định tính định lượng 3.5 TẠO MƠ HÌNH CHUỘT BÉO PHÌ THỰC NGHIỆM Sau tuần tiến hành cân trọng lượng lần, kết tăng trọng lượng chuột thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Trọng lượng lơ chuột sau tuần gây mơ hình chuột béo phì thực nghiệm Lơ Loại thức ăn m0(g) m1(g) m2(g) m3(g) m4(g) Lơ Ăn bình thường 14,93 17,95 22,13 25,86 29,26 Lô 14,91 22,20 30,06 41,45 46,70 Lô 15,35 22,65 32,05 40,53 47,10 Lô 15,21 22,25 31,05 41,53 46,71 Lô Ăn hàm lượng 15,12 22,15 30,95 43,28 46,26 Lô lipid 15,0 22,85 30,85 42,33 46,25 Lô cholesterol cao 15,16 24,91 33,93 39,75 45,81 Lô 15,32 24,61 33,85 41,23 45,86 Lô 15,45 23,36 33,05 41,41 45,68 Để khẳng định chắn số chuột béo phì, chúng tơi tiến hành xét nghiệm số số hóa sinh, kết trình bày bảng 3.6 hình 3.5 Bảng 3.6 Một số số hóa sinh lơ chuột bình thường chuột béo phì Chỉ số Lơ (Chuột (Chuột đổi béo Glucose (mmol/l) 5,3 7,9 ↑49,05 Cholesterol (mmol/l) 4,34 6,47 ↑49,07 Triglycerid (mmol/l) 0,96 2,45 ↑155,2 HDL – c (mmol/l) 1,25 0,83 ↓50,6 3,01 4,2 ↑39,53 Hình 3.5 Biểu đồ LDL – c (mmol/l) % thay Các số hóa sinh bình Lơ Glucose Cholesterol Triglycerid HDLc số hóa sinh lơ số LDL - c chuột bình thường chuột béo phì 3.6 TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ PHÂN ĐOẠN Lô Lô DỊCH CHIẾT RAU KHOAI LANG (Ipomoea batatas) LÊN CHUỘT GÂY BÉO PHÌ THỰC NGHIỆM 3.6.1 Tác dụng dịch chiết làm giảm trọng lượng thể chuột béo phì Kết cụ thể thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Trọng lượng chuột béo phì sau tuần điều trị Lô Điều trị m4 (g) m5 (g) m6 (g) m7 (g) % thay đổi 2’ Nước muối 46,70 47,34 49,62 51,11 ↑9,44% sinh lí Metformin 46,26 44,25 43,86 41,25 ↓12,14% Cao 46,25 45,40 44,23 43,40 ↓6,6%, 45,86 44,15 43, 13 42,30 ↓8,41% ethanol Cao ethylacetate m4: trọng lượng trung bình chuột trước điều trị; m5: trọng lượng trung bình chuột sau tuần điều trị; m6: trọng lượng trung bình chuột sau tuần điều trị; m7: trọng lượng trung bình chuột sau tuần điều trị Từ kết chúng tơi nhận thấy với lơ chuột béo phì, khơng điều trị (lơ 2’) trọng lượng chuột sau tuần tăng, nhiên tăng chậm 9,44% (3 tuần tăng 3,77g) Với lơ chuột béo phì có điều trị metformin với liều 500mg/kg thể trọng (lô 5) điều trị hai phân đoạn cao cồn tổng số (lô 6) ethylacetat (lô 8) liều 800mg/kg thể trọng lần/ngày Trọng lượng lô chuột thay đổi sau: lô uống Metformin trọng lượng giảm 12,14%, lô uống cao cồn trọng lượng giảm 6,6%, lô uống cao phân đoạn etheylacetate trọng lượng giảm 8,41% 3.6.2 Tác dụng dịch chiết lên số số lipid máu chuột béo phì Kết phân tích số thể qua bảng 3.8 Bảng 3.8 Chỉ số hóa sinh lơ chuột béo phì điều trị khơng điều trị Chỉ số Lô 2’ Lô (mmol/l) (béo, uống (Béo, (Béo, (Béo, muối sinh l uống Met) uống uống 8,1 5,80 6,80 6,70 (↓40,61%) (↓19,11%) (↓20,89%) 5,05 5,11 5,08 (↓24,35%) (↓22,9%) (↓23,62%) 1,88 1,98 1,91 (↓21,27%) (↓15,15%) (↓19,37%) Glucoza Cholesterol Triglycerid 6,28 2,28 Lô Lô HDL – c 0,84 LDL – c 4,0 0,85 0,95 1,02 (↑ 1,19%) (↑ 13%) (↑21,42%) 3,55 3,86 3,75 (↓11,25%) (↓3,5%) Theo kết nhận thấy: (↓6,25%) Về số glucose: so với lơ béo phì khơng điều trị (lơ đối chứng) lơ có % giảm sau: lô (béo, uống Metformin) giảm tới 40,61%, lô (béo, uống cao cồn tổng số) giảm 19,11%, lô (béo, uống phân đoạn ethylacetat) giảm 20,89% Về số cholesterol: so với lơ béo phì khơng điều trị (lơ đối chứng) lơ có % giảm sau: lơ (béo, uống Metformin) giảm tới 24,35%, lô (béo, uống cao cồn tổng số) giảm 22,9%, lô (béo, uống phân đoạn ethylacetat) giảm 23,62% Về số triglycerid: so với lơ béo phì khơng điều trị (lơ đối chứng) lơ có % giảm sau: lơ (béo, uống Metformin) giảm tới 21,27%, lô (béo, uống cao cồn tổng số) giảm 15,15%, lô (béo, uống phân đoạn ethylacetat) giảm 19,37% Về số HDL – c: so với lô đối chứng (lô 2, béo, uống nước muối sinh lí) lơ lại tăng sau: lô (béo, uống cao phân đoạn ethylacetate) tăng lớn đạt 21,42% (1,02mmol/l), lô (béo, uống cao cồn tổng số) tăng thấp đạt 13% (0,95mmol/l) Về số LDL – c: so với lô đối chứng (lơ 2, béo, uống nước muối sinh lí) lơ lơ (béo, uống Metformin) giảm lớn nhất, giảm 11,25% Lô uống cao phân đoạn ethylacetat giảm 6,25%, lô uống cao cồn tổng số giảm thấp đạt 3,5% 3.7 TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT NGỌN DÂY KHOAI LANG (Ipomoea batatas L.) LÊN CHUỘT ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYP 3.7.1 Tác dụng hạ glucose huyết chuột béo phì gây ĐTĐ STZ sau 72h Chuột nhắt trắng chủng Swiss tuần tuổi (14- 16g) sau nuôi thêm tuần với chế độ dinh dưỡng giàu lipid cholesterol trở thành chuột béo phì với trọng lượng trung bình khoảng 46g Chuột gây ĐTĐ STZ (90mg/kg) Sau – ngày, chuột béo phì bị ĐTĐ có nồng độ glucose huyết lúc đói ≥ 18mmol/l coi bị bệnh ĐTĐ Chúng chọn liều dịch chiết 800mg/kg thể trọng để điều trị cho chuột bị ĐTĐ qua đường uống Lô điều trị Metformin với liều 500mg/kg thể trọng Tại thời điểm 0h, 2h, 4h, 6h, 8h, kết tác dụng làm hạ đường huyết phân đoạn dịch chiết mô hình chuột gây ĐTĐ STZ trình bày bảng 3.9 hình 3.8 Bảng 3.9 Ảnh hưởng số phân đoạn dịch chiết rau khoai lang Metformin tới nồng độ glucose huyết chuột gây ĐTĐ STZ Giờ h h Nồng độ glucose huyết (mmol/l) h 10 h h h Giảm % Lô Lô 20,8 20,9 20,7 Lô 20,9 21,1 5,2 6,0 20,5 17,1 Lô 20,9 19,6 16,2 Lô 20,6 20,8 21 14,5 5,9 8,2 6,0 9,7 13,8 7,6 9,1 5,8 lớn 0,2 giảm 15,7 75,11 0,0042 12,9 61,13 0,0045 13,3 63,63 0,0372 0,96 Lô 3: ĐTĐ, không điều trị, uống đệm citrat (lô đối chứng); Lô 4: ĐTĐ, uống metformin; Lô 7: ĐTĐ, uống cao cồn tổng số; Lô 9: ĐTĐ, uống cao phân đoạn ethylacetat Từ bảng số liệu cho thấy, chuột bị bệnh lô chứng (lô 3), không điều trị tiêm đệm citrat nồng độ glucose huyết giảm khơng đáng kể chí tăng Lơ lô điều trị Metformin nồng độ glucose huyết giảm mạnh sau 2h tiêm (xuống 5,2mmol/l), giảm 75,11% so với thời điểm ban đầu So sánh với nhóm điều trị cao cồn tổng số phân đoạn dịch chiết ethylacetat (liều 800mg/kg thể trọng) với nhóm chứng thời điểm sau cho uống từ 2h, 4h, 6h, 8h, 10h nồng độ glucose huyết giảm mạnh tất nhóm điều trị (p = 0,0042 lơ điều trị Metformin, p= 0,0045 lô điều trị cao cồn tổng số, p= 0,0372 lô điều trị ethylacetate) Trị số cho thấy sai khác nồng độ glucose huyết nhóm thí nghiệm nhóm đối chứng có ý nghĩa thống kê (vì p