Phụ lục Bài QUAN SÁT CẤU TẠO TAI NẤM Bài PHÂN LẬP GIỐNG NẤM Bài QUAN SÁT HÌNH THÁI SỢI NẤM VÀ BÀO TỬ Bài CẤY CHUYỀN TỪ MÔI TRƯỜNG THẠCH SANG MÔI TRƯỜNG THẠCH Bài KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE VÀ AMYLASE 11 Bài CẤY CHUYỀN TỪ MÔI TRƯỜNG THẠCH SANG MÔI TRƯỜNG HẠT 14 Bài CẤY CHUYỀN TỪ MÔI TRƯỜNG HẠT, DỊCH THỂ SANG MÔI TRƯỜNG GIÁ MÔI 16 Bài ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG MEO GIỐNG .19 Bài QUAN SÁT CẤU TẠO TAI NẤM Mục đích: - Quan sát cấu tạo tai nấm để nhận dạng phân biệt số loại nấm ăn thơng thường, từ có biện pháp bảo quản hay lựa chọn tai nấm đạt chất lượng - Quan sát nấm dược liệu ( nấm vân chi) Tiến hành - Đối tượng: Nấm sò tím 2.1 Nấm sò 2.1.1 Đặc điểm hình thái nấm sò - Nấm sò tên dùng chung cho lồi nấm ăn thuộc giống Pleurotus Ở Việt Nam, nấm sò có tên gọi khác như: nấm tai lệch, nấm xoè, nấm bào ngư, nấm bèo, nấm dai… - Nấm sò có đặc điểm chung tai nấm dạng phễu lệch, mọc thành cụm tập trung, cánh nấm bao gồm phần: mũ, phiến cuống Hình 1: Cấu tạo nấm sò Mũ nấm Phiến nấm Cuống nấm Hệ sợi nấm 2.1.2 Chu trình sống nấm sò - Khi trưởng thành, nấm sò phát tán bào tử, gặp điều kiện mơi trường thích hợp bào tử nảy mầm hình thành hệ sợi sơ cấp - Hệ sợi sơ cấp phát triển đầy đủ tạo nên hệ sợi thứ cấp, sau xảy kết hợp hệ sợi nấm thứ cấp hình thành thể nấm hồn chỉnh Hình 2: Chu trình phát triển nấm sò Bào tử vơ tính - Sợi đơn bào - Sợi đơn bào giao phối - Sợi đa bào Bào tử hữu tính - Quả thể nấm Quả thể nấm sò phát triển qua giai đoạn sau: - Dạng san hô: thể tạo thành, dạng sợi mảnh hình chùm - Dạng dùi trống: mũ xuất dạng khối tròn, cuống phát triển chiều ngang chiều dài nên đường kính cuống mũ khơng sai khác nhiều - Dạng phễu: mũ mở rộng, cuống nằm - Dạng bán cầu lệch: cuống lớn nhanh bên bắt đầu lệch so với vị trí trung tâm mũ - Dạng lục bình: cuống ngừng tăng trưởng, mũ tiếp tục phát triển, bìa mép thẳng đến dợn sóng Hình 3: Các giai đoạn phát triển thể nấm sò a Dạng san hơ, b Dạng dùi trống, c Dạng phễu, d Dạng bán cầu lệch, e Dạng lục bình Hình ảnh quan sát tai nấm sò tím: Hình 4: Nấm sò tím Kết luận: Nấm sò tím chứa nhiều nước Nấm sò tím để túi bóng buộc kín, để ngăn mát tủ lạnh sử dụng vòng tuần, đảm bảo chất lượng Khi thấy mũ nấm nát nát, sờ nhẹ thấy vỡ tức nấm bị hỏng, ko nên ăn; ngửi thấy có mùi lạ lạ, ko thơm định khơng ăn Nếu muốn giữ nấm sò lâu (dùng tuần) mà đảm bảo độ ngon, thơm, dinh dưỡng, nên sơ chế sau: Tách, xé nấm thành miếng vừa phải không nhỏ.Rửa nhẹ tay chậu nước.Trần nấm nước sôi khoảng 1-2 phút vớt ngâm với nước lạnh, để ráo; cất nấm vào hộp an toàn, bảo quản ngăn đá tủ lạnh Bài PHÂN LẬP GIỐNG NẤM Mục đích - Tạo giống nấm dựa khả sinh sản sinh dưỡng nấm, phương pháp nuôi cấy mô tế bào Giống thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, chủ yếu từ bào tử từ mô thịt nấm Phương pháp phân lập Nguyên tắc phương pháp chọn tai nấm điển hình giai đoạn trưởng thành, để dễ đánh giá chất lượng giống Mô thịt nấm tách vị trí kín đáo, tiếp xúc với nguồn bệnh Phương pháp: - Đối tượng: Nấm sò tím nấm linh chi - Quy trình nhân giống Hình 5: Quy trình nhân phân lập giống Kết đánh giá a Các tiêu đánh giá chất lượng giống • Giống khiết, có hay khơng lẫn tạp loại vi sinh vật khác • Trạng thái hệ sợi nấm: độ đồng màu sắc hình thái • Hệ men thủy giải (tiêu hóa) b Kết - Giống nấm sau ngày kiểm tra bị nhiễm hoàn toàn + Xuất nấm xanh, vi khuẩn lại + Hệ sợi nấm phát triển + Hệ enzyme không kiểm tra giống nhiễm Nguyên nhân: Do thao tác cấy khử trùng mẫu chưa tốt, môi trường phân lập bị ướt Bài QUAN SÁT HÌNH THÁI SỢI NẤM VÀ BÀO TỬ Mục đích - Quan sát hình thái sợi nấm để biết kiểu ngăn vách chia nhánh loại nấm - Quan sát bào tử nấm để biết hình thái, màu sắc bào tử loại nấm khác Nguyên tắc Dựa vào đặc điểm sinh thái loại nấm biết bào tử loại nấm sinh từ đâu loại nấm Cách tiến hành - Đối tượng: nấm sò tím nấm vân chi Quan sát hình thái sợi nấm: cách đặt trực tiếp ống nghiệm có tơ nấm bò thành lên kính hiển vi để quan sát, quan sát với vật kính X10 Quan sát bào tử nấm Đối với nấm sò: quan sinh bào tử nằm phiến nấm dùng dao tách nhẹ lấy phiến nấm đặt lên lame quan sát kính hiển vi với vật kính X40 Đối với nấm vân chi: bào tử bung có nhiều phiến nấm cào nhẹ bào tử phiến nấm cho vào lame nhỏ giọt nước vào quan sát kính hiển vi với vật kính X40 Kết biện luận 4.1 Hình ảnh quan sát nấm sò tím Hình 6: Nấm sò hái nhà lưới Quan sát phiến nấm sò Kết luận: Phiến nấm sò tím dày có sọc ngang Kết quan sát nấm vân chi: 4.2 Quan sát giống nấm dịch thể nuôi môi trường glucose nấm ni mơi trường thạch Hình 7: Quan sát nấm giống nấm vân chi cấp 1 Giống nấm cấp Hình ảnh quan sát sợi nấm kính hiển vi Hình 8: Quan sát giống nấm dịch thể môi trường glucose Giống nấm dịch thể Sợi nấm quan sát Kết luận: Tơ nấm vân chi mỏng Bài CẤY CHUYỀN TỪ MÔI TRƯỜNG THẠCH SANG MÔI TRƯỜNG THẠCH Mục đích Cấy chuyền nhằm khiết giống nấm, tránh bị nhiễm loại vi khuẩn có hại, chọn ống giống tốt Nguyên tắc Meo giống nấm sản xuất cung cấp cho người trồng phải dạng chủng nuôi môi trường tự nhiên khử trùng, thỏa yêu cầu: - Không bị nhiễm tạp - Được sản xuất từ giống tốt qua tuyểnchọn - Có sức sống mạnh, phát triển nhanh, suất cao, chống chịu sâu bệnh tốt, giá trị thương phẩm cao - Có thể bảo quản lâu mà trì đặc tính sinh lý, đặcbiệt, không giảm suất - Không cấy chuyền môi trường thạch q lần để tránh gây thối hóa giống Phương pháp tiến hành: 3.1 Chuẩn bị môi trường Môi trường thạch PDA chuẩn bị tương tự phân lập giống nấm - Khoai Tây: 200 gr - Đường: 20 gr - Agar: 20 gr - Nước: lit 3.2 Quy trình thực hiện: - Đối tượng: Nấm vân chi Môi trường PDA Đổ ống nghiệm, hấp 121oC 20p, để nghiêng Giống nấm vân chi Môi trường khử trùng Để nhiệt độ mát Giống Hình 9: Quy trình nhân giống nấm vân chi Kết quả: - Nhóm cấy 20 ống nghiệm giống khơng bị nhiễm, tơ lên đẹp Hình 10: Nấm vân chi ống nghiệm Kết luận: Nấm vân chi phát triển mạnh môi trường PDA, để tránh nhiễm khâu khử trùng nguyên liệu cần cẩn thận, môi trường nấu cần ý tránh đọng nước để hạn chế xâm hại vi sinh vật 10 Bài KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE VÀ AMYLASE Mục đích Mỗi loại nấm q trình phát triển tiết số loại enzyme cần thiết để thủy phân chất có mơi trường ni cấy (môi trường thạch, môi trường lúa, môi trường cọng, môi trường giá môi) enzyme cellulase thủy phân cellulose, enzyme amylase thủy phân tinh bột,… Xác định hoạt tính enzyme để biết khả thủy phân chất để lấy chất dinh dưỡng nấm, từ biết nấm có khỏe hay khơng Ngun tắc Cho enzyme thủy phân mơi trường chứa chất, đo đường kính vòng thủy phân, từ xác định hoạt tính enzyme Vòng thủy phân nhận nhờ nhuộm màu lugol tinh bột hay CMC có mơi trường Nếu có enzyme cellulsae hay amylase xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải rộng (tương phản với màu lam tím iod tác dụng với tinh bột CMC) Chuẩn bị môi trường Môi trường khảo sát hoạt tính enzyme amylase Czapek Dox, thay đường tinh bột (15g/ lít) Mơi trường khảo sát hoạt tính enzyme cellulase Czapek Dox, thay đường CMC (15g/ lít) Thành phần mơi trường Czapek - Dox: Thành phần Lượng Thành phần Lượng NaNO3 3,5 gam Glucose 20 gam K2HPO4 1,5 gam Agar 20 gam MgSO4H2O 0,5 gam Nước vừa đủ 1000 ml KCl 0,5 gam pH 6,5 FeSO4 Vết 11 Môi trường sau chuẩn bị hấp khử trùng 121oC vòng 30-40 phút phân phối vào đĩa petri để môi trường đông cứng lại Tiến hành Nấm dùng cho thí nghiệm nấm vân chi ống nghiệm Hình 10 : Giống nấm vân chi - Môi trường chuẩn bị để thử hoạt tính enzyme amylase cellulase khử trùng 121 độ C 20 phút đổ đĩa thạch, bật UV khử trùng - Giống nấm được cắt nhỏ đặt lên môi trường thạch, cất nhiệt độ 25oC, sau ngày xem kết - Cắt miếng thạch có tơ nấm giống (khoảng 1cm2), đặt trung tâm đĩa petri chứa môi trường thạch Czapek Dox có tinh bột (để khảo sát hoạt tính amylase) đĩa mơi trường có CMC (để khảo sát hoạt tính enzyme cellulase) - Ni ủ nhiệt độ phòng khuẩn lạc (tơ nấm) đạt đường kính khoảng 4cm Kết Sau ngày nuôi ủ nhiệt độ thường, mang đĩa nuôi cấy nhỏ lugol lên toàn bề mặt thạc 12 Kết thí nghiệm: Hình11: Vòng phân giải enzyme amylase Vòng phân giải enzyme cellulase sau ngày Nhận xét: Nấm có khả sinh enzyme mơi trường thạch chứa tinh bột CMC chúng tiết enzyme phân giải chất tạo vòng phân giải, cho lugol nhuộn màu lam tím tác dụng với tinh bột CMC, vùng khơng có tinh bột CMC khơng bắt màu 13 Bài CẤY CHUYỀN TỪ MÔI TRƯỜNG THẠCH SANG MÔI TRƯỜNG HẠT Mục đích Để cho nấm làm quen thích nghi dần với môi trường với khối lượng lớn Đồng thời tăng sinh số lượng mấu ni cấy từ ống nghiệm cấy chuyền sang nhiều bịch môi trường hạt Nguyên tắc - Cấy chuyền không gian vô trùng lửa đèn cồn Tất dụng cụ cấy chuyền tay người cấy phải vô trùng cồn trước sau cấy để tránh nhiễm tạp vào mẫu cấy - Môi trường hạt phải chứa chất dinh dưỡng cần thiết cho nấm sử dụng phải hấp khử trùng Phương pháp tiến hành Đối tượng: Nấm vân chi - Dùng môi trường hạt lúa để làm môi trường cho nấm phát triển - Lúa mua về, loại bỏ hạt lép, ngâm lúa ngày ( nhằm loại bỏ tạp chất) sau đem luộc lúa ( quy trình thay ủ) nhằm thủy phân số chất sau - Sau trộn với hạt lúa với bột nhẹ nhằm hút ẩm - Cấy giống Quy trình sau Lúa Rửa, loại bỏ hạt lép, nấu ( ủ) Chai hạt, ống hạt Ẩm độ 65-75% Khử trùng 121o C/30 phút Cấy giống Hình 12: Quy trình cấy nấm mơi trường hạt 14 Kết quả: Hình 13: Nấm vân chi cấy môi trường hạt sau 24 ngày Kết luận: Tơ nấm phát triển đồng môi trường hạt 15 Bài CẤY CHUYỀN TỪ MÔI TRƯỜNG HẠT, DỊCH THỂ SANG MƠI TRƯỜNG GIÁ MƠI Mục đích: - Lựa chọn giá thể thích hợp loại nấm - Biết quy trình cấy chuyền từ mơi trường hạt,dịch thể sang môi trường giá thể - Đánh giá mức độ giống hạt hay giống dịch thể Nguyên tắc - Các giá thể xử lý trước đem trồng - Khử trùng dụng cụ, bịch nấm , kiểm tra giống trước cấy vào môi trường giá thể Phương pháp tiến hành - Đối tượng: Nấm vân chi - Giống nấm: Giống hạt giống dịch thể - Giá thể sử dụng: Mùn cưa, Xơ dừa, Bông phế liệu - Xử lý giá thể: giá thể ủ trước đóng bịch ( bổ sung 3% CaCO3) - Phối chế: 10kg chất + 250g bột cám + 250 bột ngô + 100g bột nhẹ - Đóng bịch nấm đem hấp khử trùng tiếng, sau để nguội cấy giống vào Kết nghiên cứu - Nhóm chúng tơi tiến hành loại giống: nấm cấy hạt nấm dịch thể - Giống cấp lan tơ thành ống nghiệm dùng để nhân giống cấp Chúng tiến hành nghiệm thức: Môi trường dịch thể nuôi cấy môi trường PDA môi trường Glucose; nuôi môi trường xốp Kết thu lại sau: Nuôi dịch thể Môi dịch thể glucose Môi trường xốp 10 ngày 15 ngày 24 ngày 16 Hình 14: Giống nấm vân chi cấp hai 1.Nuôi môi trường PDA lỏng- lắc Nuôi môi trường xốp Nuôi môi trường Glucose lỏng- lắc Nuôi môi trường PDA lỏng-tĩnh Nhận xét: Thời gian nhân giống dịch thể nhanh so với nuôi môi trường xốp, tốc độ lan tơ nhanh mạnh Mơi trường thích hợp để nuối dịch thể PDA tốt nhiều so với sử dụng môi trường chưa glucose Kết nghiên cứu tốc độ sinh trưởng loại giống chất Thí nghiệm bố trí sau: Mỗi chất chuẩn bị bịch Giống dịch thể cấy bịch giống nuôi môi trường xốp cấy bịch 17 Kết thí nghiệm sau: Bịch chứa giống dịch thể Mùn cưa Bịch giống xốp ngày đầu phát triển nhanh, Tỉ lệ bám chất tốt sau sợi tơ mỏng yếu ngày Sơ dừa Không lên Sợi tơ lên chậm Bông ngày sau cấy giống Giống lên đẹp, khơng lên Hình ảnh: Hình 15: Bịch nấm ni chất bơng thải Bịch giống nấm chứa giống dịch thể Bịch giống nấm chứa sơ dừa Nhận xét: giống cấy giống lúa có tốc độ lan tơ nhanh nhiều so với nấm cấy môi trường dịch thể Theo kết nhóm nấm hắc chi nuôi cấy môi trường phế liệu phát triển mạnh so với chất lại 18 Bài ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG MEO GIỐNG Đánh giá chất lượng meo giống khâu quan trọng nghề trồng nấm Meo giống sau nuôi cấy qua giai đoạn tốt hay xấu định suất việc trồng nấm, cần biết chất lượng meo giống để có biện pháp xử lí kịp thời meo khơng đạt u cầu Các tiêu đánh giá chất lượng meo giống 1.1 Yêu cầu giống gốc Giống dùng làm giống gốc phải đạt yêu cầu sau: · Là giống thuần, không lẫn tạp · Tơ mọc khỏe chia nhánh · Tơ nấm bò sát mặt thạch ăn vòng thành ống nghiệm, tơ khí sinh, tơ rối Giống gốc khâu định sản xuất ni trồng nấm nhân với số lượng lớn biết kết sau vài tháng, nghĩa sau thu nấm Do sơ suất chọn giống gốc dẫn đến thiệt hại lớn Các tiêu đánh giá chất lượng giống · Giống khiết, có hay khơng lẫn tạp loại vi sinh vật khác · Trạng thái hệ sợi nấm: độ đồng màu sắc hình thái · Hệ men thủy giải (tiêu hóa) · Kết ni cấy: suất, chất lượng nấm rơm thành phẩm, hình thái màu sắc thể Các biện pháp để giống không bị tạp Kỹ thuật vô trùng: · Vô trùng môi trường dinh dưỡng: phương pháp phổ biến dùng nước nóng có áp suất (121°C, áp suất 1at, 30 phút) · Vô trùng mẫu cấy: cắt gọt chân nấm, dùng cồn 70º lau nhẹ bề để sát trùng · Vô trùng dụng cụ: vô trùng lửa đèn cồn, sấy nhiệt độ 160℃ thời gian 120 phút dụng cụ nuôi cấy Có thể sử dụng tia tử ngoại vơ trùng buồng cấy dùng hóa chất dung dịch formaldehyde Vơ trùng nơi làm việc: phòng cấy phải kín gió, khơng có nguồn bệnh, vệ sinh · Vơ trùng thao tác: làm gọn, khéo, tránh thở mạnh, nói chuyện làm việc 19 20 21 ...Bài QUAN SÁT CẤU TẠO TAI NẤM Mục đích: - Quan sát cấu tạo tai nấm để nhận dạng phân biệt số loại nấm ăn thơng thường, từ có biện pháp bảo quản hay lựa chọn tai nấm đạt chất lượng - Quan sát nấm. .. Hình 7: Quan sát nấm giống nấm vân chi cấp 1 Giống nấm cấp Hình ảnh quan sát sợi nấm kính hiển vi Hình 8: Quan sát giống nấm dịch thể môi trường glucose Giống nấm dịch thể Sợi nấm quan sát Kết... lên kính hiển vi để quan sát, quan sát với vật kính X10 Quan sát bào tử nấm Đối với nấm sò: quan sinh bào tử nằm phiến nấm dùng dao tách nhẹ lấy phiến nấm đặt lên lame quan sát kính hiển vi với