BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN HOÀI NAM NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2 (Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN HOÀI NAM NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2 (Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã ngành : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS LÂM ĐẠI NHÂN HÀ NỘI, 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu tơi Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực, khách quan, nghiêm túc khơng chép cơng trình khác Nếu có sai sót, tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Tác giả Nguyễn Hoài Nam ii LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, em Ÿã nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn tận tình thầy, cơ, anh chị công tác Viện Công nghệ Sinh học bạn đồng nghiệp Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Lâm Đại Nhân TS Phạm Bích Ngọc dành nhiều thời gian, tận tình bảo, giúp đỡ em suốt q trình thực tập thí nghiệm Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà, NCS La Việt Hồng, Th.s Nguyễn Thu Giang, cán bộ, anh, chị công tác Viện Công nghệ Sinh học thầy giáo, cô giáo cán bộ mơn Sinh học, phòng Sau đại học - Trường đại học Sư Phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hồn thành khố luận Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn tới người thân gia đình ln bên em, động viên em toàn thể bạn bè giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2014 Học viên Nguyễn Hoài Nam iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii PHẦN I MỞ ĐẦU PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Thần kỳ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái Thần kỳ 1.2 Miraculin 1.2.1 Tính chất miraculin 1.2.2 Cấu tạo miraculin 1.2.3 Cơ chế tác dụng miraculin 1.2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất miraculin chuyển gen giới 10 1.2.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất miraculin chuyển gen Việt Nam 12 1.2.6 Tính an toàn ứng dụng sản xuất protein miraculin 12 1.3 Những ưu điểm dòng tế bào thuốc siêu sinh trưởng BY-2 14 1.4 Cơ chế chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens 15 1.4.1 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 16 1.4.2 Cấu trúc Ti-plasmid T-DNA 17 1.4.3 Cơ chế q trình chuyển gen ngồi tự nhiên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 19 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 22 2.1.1 Chủng vi khuẩn sử dụng thí nghiệm 22 iv 2.1.2 Vật liệu thực vật 22 2.1.3 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121/35S/Mir cấu trúc vector…………… pBI121/HSP/Mir mang gen miraculin…………………………………… 22 2.1.4 Hóa chất 23 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.6 Máy móc thiết bị nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26 2.2.2 Chuyển gen vào dòng tế bào thuốc BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Cv58 mang vector chuyển gen pBI121/35S/Mir pBI121/HSP/Mir 26 2.2.3 Đánh giá dòng tế bào BY-2 chuyển gen miraculin kỹ thuật PCR 29 2.2.4 Phương pháp đánh giá sinh trưởng dòng tế bào BY-2 chuyển gen 33 2.2.5 Đánh giá biểu protein dòng tế bào BY-2 kỹ thuật Dot Blot 34 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết chuyển gen mã hóa miraculin vào tế bào BY-2 thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 39 3.1.1 Kiểm tra có mặt cấu trúc mang gen mã hoá protein miraculin vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 39 3.1.2 Sự hình thành phát triển mô sẹo 40 3.1.3 Tỷ lệ dòng tế bào sống sót hình thành mơ sẹo sau lần chọn lọc 42 3.2 Đánh giá dòng tế bào BY-2 chuyển gen kỹ thuật PCR 44 3.3 Đánh giá sinh trưởng số dòng tế bào BY-2 chuyển gen 48 3.4 Đánh giá biểu protein miraculin tái tổ hợp kỹ thuật Dot Blot 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 v Kết luận 57 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid BY-2 Bright Yellow No CTAB Cetyl trimetyl amoni bromua LB Môi trường theo Luria Bertani PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) bp Base pair kb Kilo base kDa Kilo Dalton OD Optical density Ti-plasmid Tumor inducing plasmid EDTA Ethylene diamine tetra- acetate acid GB Glycine betaine Mir Miraculin vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các tiêu sinh trưởng Bảng 1.2 Đặc điểm sinh học Thần kỳ Bảng 1.3 Chuỗi phân tử đường miraculin Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 23 Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 24 Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy tế bào BY-2 24 Bảng 2.4 Thiết bị thí nghiệm 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 2.6 Chu kì nhiệt 31 Bảng 2.7 Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE 36 Bảng 3.1 Thống kê dòng tế bào mơ sẹo thuốc BY-2 chuyển gen 44 Bảng 3.2 Kết đo ADN tổng số máy đo quang phổ 45 Bảng 3.3 Tổng hợp đánh giá sinh trưởng dòng tế bào huyền phù BY-2 50 Bảng 3.4 Kết đo protein tổng số 54 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các amino acid miraculin Hình 1.2 Trình tự nucleotide miraculin trình tự amino acid suy luận Hình 1.3 Dược phẩm miraculin Nhật Bản 14 Hình 1.4 Sản phẩm chứa miraculin sản xuất Hoa Kỳ 14 Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid 18 Hình 1.6 Quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium tumefaciens 21 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector biểu gen nhân tạo miraculin…………22 Hình 3.1 Kết colony-PCR khuẩn lạc 39 Hình 3.2 Kết chuyển gen vào tế bào BY-2 41 Hình 3.3 Chọn lọc mô sẹo chuyển gen qua lần nuôi cấy chuyển 42 Hình 3.4 Chọn lọc dòng tế bào mô sẹo chuyển gen ổn định 43 Hình 3.5 Kết tách chiết ADN tổng số 46 Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp mồi mir đặc hiệu gen mir 47 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp mồi đặc hiệu gen vir 48 Hình 3.8 Các dòng tế bào huyền phù sau 14 ngày nuôi cấy 49 Hình 3.9 Sinh trưởng số dòng tế bào huyền phù thuốc BY-2 chuyển gen (khối lượng tươi thu được) 51 Hình 3.10 Sinh trưởng số dòng tế bào huyền phù thuốc BY-2 chuyển gen (khối lượng khô thu được) 51 Hình 3.11 Kết điện di protein tổng số 55 47 A B Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp mồi đặc hiệu gen mir M: Thang chuẩn ADN 1kb (+): Đối chứng dương sử dụng cấu trúc mang gen miraculin A: Các dòng tế bào mơ sẹo BY-2 chuyển gen cấu trúc pBI121/35S/Mir B: Các dòng tế bào mơ sẹo BY-2 chuyển gen cấu trúc pBI121/HSP/Mir Theo lý thuyết, đoạn gen miraculin có kích thước 730 bp Hình 3.6A cho thấy dòng tế bào mơ sẹo BY-2 mang cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S/Mir (S 2, 3, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 68, 75) hình 3.6 B cho thấy dòng tế bào BY-2 mang cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP/Mir (H 3, 10, 11, 12, 13, 14, 19) tiến hành kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, cho băng có kích thước tương tự kích thước lý thuyết đoạn gen mang miraculin Chứng tỏ tất dòng tế bào BY-2 chọn để kiểm tra mang gen miraculin cần chuyển Để tránh tượng kết dương tính giả tồn vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tồn mô tế bào chuyển gen, tiếp tục tiến hành kỹ thuật PCR kiểm tra có mặt gen vir với cặp mồi đặc hiệu gen vir 48 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp mồi đặc hiệu gen vir M: Thang chuẩn ADN 1kb (+): Đối chứng dương với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens S: Các dòng tế bào mơ sẹo BY-2 chuyển gen cấu trúc pBI121/35S/Mir H: Các dòng tế bào mơ sẹo BY-2 chuyển gen cấu trúc pBI121/HSP/Mir Sau kiểm tra có mặt gen vir dòng tế bào mơ sẹo chuyển gen thấy rằng, điện di cho thấy mẫu kiểm tra cho kết âm tính, khơng có băng xuất tiến hành kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, điều chứng tỏ dòng tế bào mơ sẹo chuyển gen cần kiểm tra khuẩn mang gen mir mong muốn (Hình 3.7) Từ kết Hình 3.6 Hình 3.7 chứng tỏ chúng tơi biến nạp thành cơng gen mã hố protein miraculin vào dòng tế bào thuốc BY-2 3.3 Đánh giá sinh trưởng dòng tế bào BY-2 chuyển gen Sau chọn lọc dòng tế bào mơ sẹo thuốc chuyển gen BY-2 ổn định, tiến hành nuôi dòng tế bào mơ sẹo chuyển gen sang mơi trường lỏng (MT2) để thu dịch tế bào huyền phù chuyển gen, sau lần nuôi chuyển môi trường chọn lọc thu dòng tế bào huyền phù đồng nhất, tiến hành đánh giá sinh trưởng dòng tế bào mơ sẹo thuốc 49 BY-2 chuyển gen mang cấu trúc pBI121/HSP/Mir cấu trúc pBI121/35S/Mir A - Đối chứng B - Cấu trúc pBI121/35S/Mir C - Cấu trúc pBI121/HSP/Mir Hình 3.8 Các dòng tế bào huyền phù sau 14 ngày nuôi cấy Sau 14 ngày ni cấy chúng tơi thấy rằng, dòng tế bào chuyển gen cấu trúc pBI121/HSP/Mir cấu trúc pBI121/35S/Mir phát triển tốt, số lượng tế bào thu cao, tế bào có màu sắc vàng, sáng, so với dòng tế bào BY-2 khơng chuyển gen dòng tế bào chuyển gen sinh trưởng khơng có khác biệt nhiều hình thái (Hình 3.8) Sau tiến hành đánh giá sinh trưởng dòng tế bào mơ sẹo chuyển gen mang cấu trúc vector pBI121/HSP/Mir cấu trúc pBI121/35S/Mir, so sánh với sinh trưởng dòng tế bào BY-2 không chuyển gen (đối chứng) thống kê bảng số liệu sau: 50 Bảng 3.3 Bảng ánh giá mức độ sinh trưởng dòng tế bào huyền phù BY-2 Thời gian Đối chứng BY-2 Đối chứng BY-2 (Wt)-MT2 (Wt)-MT0 Cấu trúc pBI/121/35S/Mir Cấu trúcpBI/121/HSP/Mir Dòng Dòng 13 Dòng 39 Dòng 14 Trọng Trọng Trọng Trọng Trọng Trọng Trọng Trọng Trọng Trọng Trọng Trọng lượng lượng lượng lượng lượng lượng lượng lượng lượng lượng lượng lượng tươi* khô* tươi* khô* tươi* khô* tươi* khô* tươi* khô* tươi* khô* (g/ml (g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) (g/ml) 0.033 0.009 0.041 0.012 0.039 0.011 0.038 0.010 0.036 0.016 0.037 0.015 0.01 0.012 0.09 0.036 0.05 0.028 0.062 0.031 0.065 0.034 0.056 0.032 0.05 0.025 0.26 0.104 0.186 0.081 0.198 0.086 0.202 0.094 0.211 0.098 0.05 0.025 0.489 0.232 0.412 0.198 0.405 0.201 0.385 0.198 0.426 0.215 10 0.05 0.025 0.789 0.501 0.686 0.392 0.612 0.341 0.596 0.329 0.675 0.398 12 0.03 0.016 0.865 0.531 0.792 0.478 0.764 0.437 0.711 0.416 0.774 0.440 14 0.03 0.016 0.812 0.506 0.784 0.465 0.701 0.406 0.693 0.402 0.752 0.426 0.765 0.492 0.729 0.442 0.686 0.392 0.975 0.387 0.735 0.402 nuôi cấy (ngày) 16 * giá trị trung bình thí nghiệm độc lập 51 Qua bảng số liệu thống kê thu (Bảng 3.3), tiến hành dựng biểu đồ sinh trưởng dòng tế bào huyền phù chuyển gen để so sánh khả sinh trưởng dòng tế bào với dòng tế bào huyền phù BY-2 đối chứng không chuyển gen Khối lượng tươi (g/ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 BY-2 (wt)-MT2 0.5 BY-2 (wt)-MT0 0.4 Dòng 0.3 Dòng 39 0.2 Dòng 13 0.1 Dòng 14 10 12 14 16 Thời gian ni cấy (ngà Hình 3.9 Sinh trưởng số dòng tế bào huyền phù thuốc BY-2 Khối lượng khô (g/ml) chuyển gen theo khối lượng tươi 0.6 0.5 0.4 Đối chứng BY-2 (Wt) 0.3 Đối chứng BY-2 (Wt) Dòng 0.2 Dòng 39 Dòng 13 0.1 Dòng 14 10 12 14 16 Thời gian ni cấy (ngày) Hình 3.10 Sinh trưởng số dòng tế bào huyền phù thuốc BY-2 chuyển gen theo khối lượng khơ 52 Chú thích biểu đồ: Đối chứng BY-2 (Wt)-MT2: Dòng tế bào BY-2 khơng chuyển gen nuôi môi trường chọn lọc kháng sinh Đối chứng BY-2 (Wt)-MT0: Dòng tế bào BY-2 khơng chuyển gen nuôi môi trường không chọn lọc kháng sinh Qua biểu đồ Hình 3.9 3.10 chúng tơi thấy rằng, dòng tế bào đối chứng khơng chuyển gen mã hóa miraculin ni mơi trường MS (MT2) có kháng sinh chọn lọc tế bào gần khơng phát triển, tế bào hóa màu nâu đen chết sau ngày chọn lọc Quan sát thấy dòng tế bào huyền phù chuyển gen cấu trúc pBI121/35S/Mir (dòng 3, 39) cấu trúc cấu trúc pBI121/HSP/Mir (dòng 13, 14) có khả sinh trưởng đồng Sau ngày cấy chuyển tế bào bắt đầu phân chia, song số lượng tế bào thu ít, giai đoạn tương ứng với pha tiềm phát (lag phase) Tại pha này, tế bào huyền phù gần phát triển, tế bào chủ yếu phản ứng thích nghi với điều kiện mơi trường ni cấy Khối lượng tế bào tăng nhanh từ ngày thứ ngày 12, giai đoạn tương ứng với pha phát triển (logarit phase) Ở pha này, tế bào sau trải qua thời gian thích nghi bắt đầu phát triển với tốc độ lũy thừa, thấy pha này, tế bào phát triển nhanh tạo lượng lớn tế bào, màu sắc tế bào huyền phù vàng, sáng, tế bào rời không tạo cụm Từ ngày 12 đến ngày 14 thấy khối lượng tế bào thu không tăng, giai đoạn tương ứng với pha ổn định Trong pha này, tế bào gần khơng phát triển khơng có phân chia Từ 14 đến 16 ngày thấy khối lượng tế bào khơng tăng mà giảm, giai đoạn tương ứng với pha suy tàn, tế bào già chết, phân hủy môi trường, màu sắc tế bào chuyển sang màu nâu, đen 53 So sánh sinh trưởng dòng tế bào chuyển gen với dòng tế bào đối chứng BY-2 khơng chuyển gen chúng tơi thấy rằng, dòng tế bào đối chứng sinh trưởng tốt hơn, khối lượng tươi thu lớn ngày 12 0,865 g/ml trọng lượng khơ lớn thu lớn 0,531g/ml dòng tế bào chuyển gen khối lượng tươi thu lớn ngày 12 0,792 g/ml khối lượng khô lớn thu lớn 0,478g/ml Các dòng tế bào chuyển gen sinh trưởng so với dòng khơng chuyển gen mơi trường ni cấy có bổ sung kháng sinh chọn lọc nên ảnh hưởng tới khả sinh trưởng dòng tế bào chuyển gen So sánh sinh trưởng dòng tế bào chuyển gen cấu trúc pBI121/35S/Mir (dòng 3, 39) cấu trúc cấu trúc pBI121/HSP/Mir (dòng 13, 14) chúng tơi thấy rằng, khơng có khác biệt lớn dòng tế bào chuyển gen, khối lượng tươi thu lớn ngày 12 dòng tế bào chuyển gen cấu trúc pBI121/35S/Mir (dòng số 3) 0,792 g/ml khối lượng khơ lớn thu lớn 0,478 g/ml, dòng tế bào chuyển gen cấu trúc pBI121/HSP/Mir (dòng 14) khối lượng tươi thu lớn ngày 12 0,774 g/ml khối lượng khô lớn thu lớn 0,440 g/ml 3.4 Đánh giá biểu protein miraculin tái tổ hợp dòng BY-2 chuyển gen Để đánh giá biểu protein miraculin dòng tế bào mơ sẹo thuốc BY-2 chuyển gen, tiến hành tách chiết protein tổng số, protein tổng số kiểm tra nồng độ thực kỹ thuật điện di gel 10% SDS polyacrylamide để đánh giá chất lượng protein Sau protein biến tính chuyển lên màng nitroxellulose, màng lai với kháng thể c-myc Sau rửa lần PBS-T, màng lai tiếp tục lai 15 ml dung dịch sữa tách béo 5% có chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horseradish Peroxidase) Các băng có phản ứng 54 lai phát phản ứng màu với chất có dung dịch màu có chứa chất (TMB 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) băng màu Bảng 3.4 Kết đo protein tổng số Các dòng tế bào Nồng độ cấu trúc OD 595 protein (µg/ml) pBI121/35S/Mir Các dòng tế bào Nồng độ cấu trúc OD 595 protein (µg/ml) pBI121/HSP/Mir 0,67 3332 0,981 4887 1,389 6927 0,561 2787 1,276 6632 10 1,165 5807 32 1,124 5602 11 1,326 6612 33 1,112 5542 12 1,023 5097 36 1,342 6692 13 1,447 7217 39 1,368 6822 14 1,365 6807 68 1,113 5547 18 1,118 5572 69 1,127 5617 19 1,378 6872 75 1,012 5042 Qua kết OD đo mẫu tách chiết protein cho thấy hàm lượng protein tách chiết thu có nồng độ cao, chúng tơi tiếp tục chọn dòng tế bào chuyển gen có nồng độ protein cao cấu trúc 55 chuyển gen pBI121/HSP/Mir cấu trúc pBI121/35S/Mir để tiến hành kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein tổng số để kiểm tra tinh protein Hình 3.11 Kết điện di protein tổng số M: Thang chuẩn protein H (13, 14, 19): Các dòng tế bào chuyển gen cấu trúc pBI121/HSP/Mir S (3, 36, 39): Các dòng tế bào chuyển gen cấu trúc pBI121/35S/Mir Sau tiến hành điện di SDS-PAGE mẫu protein tống số chúng tơi thấy rằng, băng rõ, tạp chất (Hình 3.9), điều chứng tỏ mẫu tách chiết protein tổng số thu sạch, lẫn tạp chất, bị đứt gãy Chúng tơi tiếp tục tiến hành kĩ thuật Dot Blot để kiểm tra biểu protein tái tổ hợp miraculin Hình 3.12 Kết lai miễn dịch Dot Blot 56 Kết sản phẩm lai miễn dịch Dot Blot (Hình 3.12) chúng tơi thấy rằng, mẫu tế bào BY-2 chuyển gen cấu trúc pBI121/35S/Mir S(3, 36, 39) sau nhuộm màu quan sát thấy xuất vệt màu xanh, điều chứng tỏ dòng tế bào chuyển gen mã hóa miraculin cấu trúc pBI121/35S/Mir Áã biểu có mặt protein miraculin Quan sát mẫu H (13, 14), chúng tơi thấy khơng có bắt màu nhuộm mẫu, điều cho thấy khơng có biểu protein miraculin dòng tế bào chuyển gen cấu trúc pBI121/HSP/Mir, tế bào chuyển gen cấu trúc pBI121/HSP/Mir biểu protein miraculin điều kiện sốc nhiệt 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận a Đã chuyển gen thành công cấu trúc vector pBI121/HSP/Mir cấu trúc pBI121/35S/Mir mang gen miraculin vào dòng tế bào huyền phù thuốc BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens b Đã chọn lọc thành cơng dòng tế bào mơ sẹo thuốc BY-2 mang cấu trúc vector pBI121/HSP/Mir cấu trúc pBI121/35S/Mir mang gen miraculin môi trường kháng sinh chọn lọc c Thực kỹ thuât PCR đánh giá thành công có mặt gen miraculin dòng tế bào mô sẹo thuốc BY-2 mang cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP/Mir cấu trúc pBI121/35S/Mir mang gen miraculin mức độ AND d Thực kỹ thuật Dot Blot đánh giá thành công biểu protein miraculin dòng tế bào huyền phù BY-2 chuyển gen mang cấu trúc vector pBI121/HSP/Mir e Đánh giá thành cơng sinh trưởng dòng tế bào huyền phù chuyển gen mang cấu trúc vector pBI121/HSP/Mir cấu trúc pBI121/35S/Mir Số lượng tế bào thu lớn sau 12 ngày nuôi cấy dịch huyền phù Kiến nghị Tiến hành phương pháp lai Western blot ELISA để kiểm tra phản ứng kháng nguyên- kháng thể Tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ thích hợp để dòng tế bào huyền phù chuyển gen mang cấu trúc vector pBI121/HSP/Mir biểu protein miraculin 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Mai, T P H., & Đỗ, T V (2012) Thực hành nuôi cấy mơ thực vật [2] Tạ Văn Bình (2006), Dịch tễ học bệnh đái tháo đường Việt Nam - Các phương pháp điều trị biện pháp phòng chống, Nxb Y học, Hà Nội [3] Tạ Văn Bình (2007), Những nguyên lý tảng đái tháo đường - tăng glucose máu, Nxb Y học, Hà Nội [4] Thế, T D., Độ, V V., & Sương, N K (2010) Bước đầu trồng thử nghiệm tách chiết hoạt chất miraculin Thần kỳ (Synsepalum dulcificum) Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 13(1T), 54-61 Tài liệu nước [5] Al Bachchu, M A., Jin, S B., Park, J W., Boo, K H., Sun, H J., Kim, Y W., & Kim, J H (2011) Functional expression of miraculin, a taste-modifying protein, in transgenic Miyagawa Wase Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc) Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 54(1), 24-29 [6] Brouwer, J N., Glaser, D., af Segerstad, C H., Hellekant, G., Ninomiya, Y., & Van der Wel, H (1983) The sweetness-inducing effect of miraculin; behavioural and neurophysiological experiments in the rhesus monkey Macaca mulatta The Journal of physiology, 337(1), 221-240 [7] Diamant, H., Hellekant, G., & Zotterman, Y (1972) The effect of miraculin on the taste buds of man, monkey and rat Olfaction and Taste IV, 241-244 [8] Doyle, J J (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem bull, 19, 11-15 59 [9] Duhita, N., Hiwasa-Tanase, K., Yoshida, S., & Ezura, H (2011) A simple method for purifying undenatured miraculin from transgenic tomato fruit Plant Biotechnol, 28(3), 281 [10] Gomord, V., Fitchette-Lainé, A C., Denmat, L A., Michaud, D., & Faye, L (1998) Production of foreign proteins in tobacco cell suspension culture InRecombinant Proteins from Plants (pp 155-164) Humana Press [11] Hirai, T., Fukukawa, G., Kakuta, H., Fukuda, N., & Ezura, H (2010) Production of recombinant miraculin using transgenic tomatoes in a closed cultivation system Journal of agricultural and food chemistry, 58(10), 6096-6101 [12] Hirai, T., Sato, M., Toyooka, K., Sun, H J., Yano, M., & Ezura, H (2010) Miraculin, a taste-modifying protein is secreted into intercellular spaces in plant cells Journal of plant physiology, 167(3), 209-215 [13] Hiwasa-Tanase, K., Hirai, T., Kato, K., Duhita, N., & Ezura, H (2012) From miracle fruit to transgenic tomato: mass production of the tastemodifying protein miraculin in transgenic plants Plant cell reports, 31(3), 513-525 [14] Ito, K., Asakura, T., Morita, Y., Nakajima, K I., Koizumi, A., ShimizuIbuka, A., & Abe, K (2007) Microbial production of sensory-active miraculin Biochemical and biophysical research communications, 360(2), 407-411 [15] Kim, Y W., Hirai, T., Kato, K., Hiwasa-Tanase, K., & Ezura, H (2010) Gene dosage and genetic background affect miraculin accumulation in transgenic tomato fruits Plant Biotechnol, 27, 333-338 [16] Koizumi, A., Tsuchiya, A., Nakajima, K I., Ito, K., Terada, T., ShimizuIbuka, A., & Abe, K (2011) Human sweet taste receptor mediates acidinduced sweetness of miraculin Proceedings of the National Academy of Sciences,108(40), 16819-16824 60 [17] Kurihara, K., & Beidler, L M (1968) Taste-modifying protein from miracle fruit Science, 161(3847), 1241-1243 [18] Laemmli, U K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature, 227(5259), 680-685 [19] Masuda, Y., Nirasawa, S., Nakaya, K., & Kurihara, Y (1995) Cloning and sequencing of a cDNA encoding a taste-modifying protein, miraculin Gene, 161(2), 175-177 [20] Matsuyama, T., Satoh, M., Nakata, R., Aoyama, T., & Inoue, H (2009) Functional expression of miraculin, a taste-modifying protein in Escherichia coli Journal of biochemistry, 145(4), 445-450 [21] Paladino, A., Costantini, S., Colonna, G., & Facchiano, A M (2008) Molecular modelling of miraculin: structural analyses and functional hypotheses Biochemical and biophysical research communications, 367(1), 26-32 [22] Pham X H., Tran T T., 2009 Identification and sequence analysis of a DREB subfamily transcription factor involved in drought stress tolerance from rice J.Biol., 31(4): 74-81 [23] Plagemann, P G (2004) GP5 ectodomain epitope of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, strain Lelystad virus Virus research, 102(2), 225-230 [24] Sugaya, T., Yano, M., Sun, H J., Hirai, T., & Ezura, H (2008) Transgenic strawberry expressing the taste-modifying protein miraculin Plant Biotechnol, 25(4), 329-333 [25] Sun, H J., Cui, M L., Ma, B., & Ezura, H (2006) Functional expression of the taste-modifying protein miraculin, in transgenic lettuce FEBS letters, 580(2), 620-626 61 [26] Sun, H J., Kataoka, H., Yano, M., & Ezura, H (2007) Genetically stable expression of functional miraculin, a new type of alternative sweetener, in transgenic tomato plants Plant biotechnology journal, 5(6), 768-777 [27] Theerasilp, S., Hitotsuya, H., Nakajo, S., Nakaya, K., Nakamura, Y., & Kurihara, Y (1989) Complete amino acid sequence and structure characterization of the taste-modifying protein, miraculin Journal of Biological Chemistry, 264(12), 6655-6659 [28] Yamamoto, C., Nagai, H., Takahashi, K., Nakagawa, S., Yamaguchi, M., Tonoike, M., & Yamamoto, T (2006) Cortical representation of tastemodifying action of miracle fruit in humans Neuroimage, 33(4), 1145-1151 Trang Website tham khảo [29] http://calorielab.com/news/2005/12/02/african-berry-turns-sour-to- sweet-forjapanese-on-a-diet [30] http://giadinh.vnexpress.net/tin-tuc/song-khoe/bao-dong-nguy-co-beo- phi-do-thi-2277160.html [31] http://muse.mberry.us/products/ [32] http://www.tapchiyduoc.com/tu-dien-y-duoc/thuat-ngu-y-duoc/2348- beo-phi.html [33] https://sites.google.com/site/raurungvietnam/rau-rung-nuoc-ngoai/cay- than-ky ... HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN HOÀI NAM NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2 (Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm... thuốc BY-2 biểu protein tái tổ hợp miraculin Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1 Chuyển gen vào dòng tế bào thuốc siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.2 Chọn lọc dòng tế bào. .. Đánh giá dòng tế bào BY-2 chuyển gen miraculin kỹ thuật PCR 29 2.2.4 Phương pháp đánh giá sinh trưởng dòng tế bào BY-2 chuyển gen 33 2.2.5 Đánh giá biểu protein dòng tế bào BY-2