BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM ****** NGÔ ĐỨC XÁC ĐỊNH ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN VÔ HOẠT XUẤT HUYẾT THỎ SẢN XUẤT TẠI CÔNG TY NAVETCO LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11/2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM ****** NGÔ ĐỨC XÁC ĐỊNH ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN VÔ HOẠT XUẤT HUYẾT THỎ SẢN XUẤT TẠI CÔNG TY NAVETCO Chuyên ngành: THÚ Y Mã số : 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: TS Trần Xuân Hạnh TS Lê Anh Phụng Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11/2009 XÁC ĐỊNH ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH VÀ THỜI GIAN BẢO QUẢN CỦA VẮC XIN VÔ HOẠT XUẤT HUYẾT THỎ SẢN XUẤT TẠI CÔNG TY NAVETCO ^ ] NGÔ ĐỨC HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN Chủ tịch: Thư ký: Phản biện 1: Phản biện 2: Ủy viên: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN ^ ] Họ tên : Ngô Đức Ngày sinh : 03 - 01 - 1972 Nơi sinh : Quảng Ngãi Họ tên cha : Ngô Phận Họ tên mẹ : Trần Thị Kiều Quá trình học tập: - Năm 1990: Tốt nghiệp phổ thông trung học trường PTTH Mộ Đức II, Quãng Ngãi - Năm 1997: Tốt nghiệp đại học ngành Thú y Trường Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh - Làm việc Công ty thuốc thú y TW, 29 Nguyễn Đình Chiểu, Q1, TP.HCM, nhân viên kiểm nghiệm - Năm 2005: Học khóa Cao học ngành thú y Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: Vợ : Lê Hồng Nga, kết hôn 1999 Con: Ngô Đức Thắng, sinh 2001 : Ngô Đức Thanh Tùng, sinh 2009 Địa liên lạc : 156A đường 42, phường Bình Trưng Đơng, Quận 2, TP.HCM Điện thoại : 0979730910 Email : ducnavetco@yahoo.com ii LỜI CAM ĐOAN ^ ]-Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Ngô Đức iii LỜI CẢM ƠN ^ ]-Chân thành cám ơn TIẾN SỸ : TRẦN XUÂN HẠNH TIẾN SỸ : LÊ ANH PHỤNG giảng dạy, hướng dẫn giúp đỡ việc thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Cảm ơn tất thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Phòng Đào Tạo Sau Đại Học, Ban Giám Hiệu giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành đề tài nghiên cứu Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công Ty thuốc thú y Trung Ương (Navetco), anh chị bạn đồng nghiệp, anh chị em phòng Kiểm Nghiệm nhiệt tình hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cảm ơn chia sẻ thành đạt với cha, mẹ, vợ, bạn tạo nguồn động viên to lớn cho tơi iv TĨM TẮT ^ ]-Đề tài “Xác định độ dài miễn dịch thời gian bảo quản vắc xin vô hoạt xuất huyết thỏ sản xuất công ty NAVETCO” tiến hành 16 tháng (06/2007-10/2008) Phòng kiểm nghiệm Công ty Thuốc thú y Trung Ương TP.HCM Phương pháp ELISA sử dụng để phát kháng nguyên phương pháp làm tiêu vi thể để xác định vi rút RHD Hiệu lực bảo hộ vắc xin phòng bệnh xuất huyết thỏ đánh giá qua phương pháp HI phương pháp công cường độc Kết ghi nhận sau: (1) Chất lượng vắc xin RHD Vắc xin phòng bệnh xuất huyết thỏ công ty NAVETCO sản xuất đạt tiêu chuẩn vô trùng, an toàn Hiệu giá kháng thể (HI) lúc 21 ngày tiêm vắc xin đạt 1/20-1/80 (tương ứng số GMT = 33,7), tỷ lệ bảo hộ thỏ sau công cường độc 100% Kết xác định nguyên nhân gây chết thỏ lô đối chứng phương pháp ELISA cho kết dương tính với vi rút RHD (2) Qui trình tiêm phòng - Tỷ lệ bảo hộ thỏ qua cơng cường độc hai qui trình tiêm vắc xin đến tháng thứ đạt 100% - Qui trình lần tiêm vắc xin có hiệu giá kháng thể (HI) ln cao qui trình lần tiêm thời điểm khảo sát (1 tháng, tháng, tháng, tháng) (3) Thời gian bảo quản vắc xin Vắc xin xuất huyết thỏ công ty NAVETCO sản xuất bảo quản đến 12 tháng nhiệt độ 2-80C hiệu lực bảo hộ thỏ 100% qua công cường độc, tương ứng với hiệu giá kháng thể dao động 1/20-1/80 v SUMMARY ^ ]-The study - “Determine long-term immunology and storage time of rabbit heamorrhagic disease inactived vaccin produced by NAVETCO” has performed during 16 months (06/2007 – 10/2008) in Quality Control Section of National Veterinary Company Using ELISA method to detect antigen and histopathology to specify RHDV The potency was evaluated by HI test and challenged test The results are below: (1) The quality of vaccin RHD: The vaccin made in NAVETCO has obtained the standards about serility, safety In the vaccinated rabbits, the titre of antibody, examined on the 21st day after vaccinated by HI test, obtains 1/20 to 1/80 (GMT= 33.7) and the vaccine potency is 100% by challenged test In the control group, the death rate is 100% and the cause is RHDV (by ELISA test) (1) The immunosation schedule - The percentage of vaccinated rabbits with both of schedule, that also survive the challenge is 100% - The titre of antibody by the two – dosage schedule is always over by the one – dosage schedule at times of examination (2) The storage time - The RHD vaccin produced by NAVETCO which has stored during months (2 – 80C), can protect to 100% vaccinated rabbit The antibody titre – examined by HI test – varies from 1/20 to 1/80 Keys words: vaccin, rabbit haemorrhagic disease, long – term immunology vi MỤC LỤC TRANG Trang tựa Trang chuẩn y .i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Lời cảm ơn iv Tóm tắt v Mục Lục vii Danh sách chữ viết tắt x Danh sách hình xi Danh sách bảng xiii Danh sách biểu đồ xiv CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Lịch sử bệnh xuất huyết thỏ 2.2 Căn bệnh học 2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc 2.2.2 Đặc tính sinh học RHD vi rút 2.2.3 Sức đề kháng vi rút 2.3 Dịch tễ học 2.3.1 Phân bố bệnh xuất huyết thỏ Thế giới Việt Nam vii 2.3.2 Động vật cảm thụ 2.3.3 Đường xâm nhập phương thức truyền lây 2.3.4 Cơ chế gây bệnh 2.4 Triệu chứng bệnh tích 2.4.1 Triệu chứng 2.4.2 Bệnh tích 2.5 Chẩn đoán bệnh 13 2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 13 2.5.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 14 2.6 Miễn dịch bệnh xuất huyết thỏ 14 2.6.1 Miễn dịch không đặc hiệu 14 2.6.2 Miễn dịch đặc hiệu 14 2.7 Biện pháp kiểm soát dịch bệnh 15 2.7.1 Phòng bệnh 15 2.7.2 Chủ trương chống bệnh RHD 16 2.8 Các cơng trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 17 2.8.1 Trên giới 17 2.8.2 Việt Nam 17 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Vật liệu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Thí nghiệm 1: Kiểm tra vơ trùng, an tồn, hiệu lực vắc xin RHD 20 3.4.2 Thí nghiệm 2:Xác định độ dài miễn dịch vắc xin RHD theo qui trình tiêm lần tiêm lần cách 15 ngày 23 3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định độ dài bảo quản vắc xin thời điểm 3, 6, 12 tháng 25 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 26 viii PHỤ LỤC CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN TRONG ĐỀ TÀI Phương pháp chuẩn bị giống virút công cường độc Giống gốc vi rút cường độc nhận từ Trung tâm nghiên cứu thuộc công ty thuốc thú TW (gan, lách có chứa vi rút) - Lấy lượng gan, lách cho vào cối nghiền có sẵn khoảng 0,5-1g cát vơ trùng, dùng chày nghiền nhuyễn - Thêm từ từ phần dung dịch PBS 6,4 (lượng gan, lách: phần) vào cối tiếp tục nghiền nhuyễn thành huyễn dịch đồng (pha loãng 1/10) - Chuyển huyễn dịch vào ống ly tâm nhựa 20ml - Để lắng -700C tối thiểu qua đêm - Để đơng tan, sau vortex trộn huyễn dịch - Ly tâm lạnh 10000 vòng 20 phút 40C Dùng pipette hút nhẹ nhàng phần dịch qua ống chứa Kiểm tra hiệu giá vi rút phản ứng HA Hiệu giá HA phải cao 1/2560 làm giống công cường độc Sau đó, chia lượng mẫu vào ống (eppendorf) bảo quản tủ âm -700C, ống giống dùng để công cường độc, công cường độc lấy ống giống độc thực kiểm tra lại HA để xác định hiệu giá virus, tiến hành pha loãng ống giống thành nồng độ dung dịch 1/2560 tương đương 100LD50 Kháng nguyên dùng để thực phản ứng HA trước thực phản ứng HI thí nghiệm đề tài Phương pháp thực phản ứng ngưng kết hồng cầu người nhóm máu O (Haemagglutination- HA) Vi rút RHD có khả kết hợp với thụ thể bề mặt hồng cầu người, đặc biệt hồng cầu nhóm máu O người 66 Các bước tiến hành thực phản ứng HA Bước 1: Dùng micropipette cho vào tất giếng vĩ 96 giếng đáy hình chữ U, giếng 50μl PBS từ giếng thứ đến giếng 12 hàng Bước 2: Cho vào giếng 100μl huyễn dịch mẫu kháng nguyên pha loãng 1/10 Bước 3: Trộn micropipette ( 8-10 lần), chuyển 50 μl sang giếng thứ làm tương tự giếng thứ 11 bỏ 50μl Bước 4: Cho 50μl hồng cầu người nhóm máu O nồng độ 1% vào tất giếng, để nhiệt độ phòng khoảng 45 phút đến Bước 5: Đọc kết ngưng kết: Điều kiện để đọc phản ứng ngưng kết - Đối chứng dương phải ngưng kết rõ với hiệu giá ngưng kết biết - Đối chứng hồng cầu lắng rõ Đánh giá phản ứng dương tính mức độ ngưng kết, qui ước từ 1-3 dấu cộng (+,++,+++) - Phản ứng dương tính (+++) biểu thị ngưng kết nhanh, hồng cầu ngưng kết tạo thành hạt lấm hình “dù” ngược giếng - Phản ứng dương tính (++) biểu thị ngưng kết rõ rệt, thấy hồng cầu ngưng kết đáy giếng - Phản ứng dương tính (+) ngưng kết không đáng kể thấy đáy giếng - Phản ứng âm tính (-) hồng cầu lắng xuống giếng (hay gọi đóng nút) Hiệu giá ngưng kết virus độ pha loãng lớn mẫu mà người ta quan sát thấy ngưng kết hồng cầu mức độ ++ Nồng độ vi rút giếng coi đơn vị HA (Nguyễn Như Thanh ctv, 2006) Mẫu có hiệu giá ngưng kết cao 1/160 gọi dương tính với RHD (OIE, 2004) 67 10 11 12 A M1 HC B M2 HC C M3 HC D M4 HC E M5 HC F M6 HC G M7 HC H Ñ.C (+) HC 50 μ l 50 μ l 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 … Hình Sơ đồ thực phản ứng HA M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7: số thứ tự mẫu kiểm tra HC : đối chứng hồng cầu Đ.C (+) : đối chứng dương biết Phương pháp thực phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu người có nhóm máu O (Haemagglutination Inhibition- HI) Phản ứng thực dựa vào khả trung hòa kháng thể virus tương ứng, làm hoạt tính ngưng kết hồng cầu vi rút RHD, dùng xác định hiệu giá kháng thể huyết thỏ thí nghiệm 68 Các bước tiến hành phản ứng HI Bước : Dùng micropipette cho vào tất giếng đĩa 96 giếng đáy chữ U giếng 50 μl PBS có 0,05% BSA (bovine serum albumin), trừ giếng (1 hàng) Bước : Cho vào giếng 100μl mẫu huyết thỏ pha loãng 1/10 xử lý (M1, M2,…Mi) Mỗi mẫu làm giếng Bước 3: Dùng micropipette hút 50μl từ giếng chuyển sang giếng thứ trộn khoảng 10 lần chuyển sang giếng thứ 3, tiếp tục đến giếng 11 bỏ 50μl Bước 4: Cho 50μl kháng nguyên chứa đơn vị HA vào giếng tất giếng (mỗi lần thực phản ứng HI phải xác định lại hiệu giá kháng nguyên để pha đơn vị HA) Bước 5: Gõ nhẹ thành đĩa để nhiệt độ phòng khoảngng 45 phút Bước 6: Cho vào tất giếng, giếng 50μl hồng cầu người nhóm O nồng độ 1% để nhiệt độ phòng 30-60 phút - Đối chứng dương hàng H - Đối chứng hồng cầu giếng 12 (1 cột) Bước 7: Đọc kết phản ứng HI: Phản ứng HI xem có hoạt động - Đối chứng dương có hiệu giá kháng thể biết (của NAVETCO) - Đối chứng hồng cầu lắng rõ - Độ pha loãng kháng nguyên xác HA 69 10 11 12 A M1 HC B M2 HC C M3 HC D M4 HC E M5 HC F M6 HC G H HC M7 Ñ.C (+) HC 50 μ l 50 μ l 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240 Hình Sơ đồ thực phản ứng HI M1, M2, M3, M4, …Mi : Mẫu huyết số 1, 2, 3, 4, 5, i HC : đối chứng hồng cầu ĐC (+) : đối chứng dương - Nếu phản ứng dương tính (+) tức vi rút (kháng nguyên) bệnh phẩm tương ứng với kháng thể huyết miễn dịch kháng thể trung hòa virus, khơng vi rút để làm gây ngưng kết hồng cầu (hay kháng thể làm hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu vi rút) nên hồng cầu lắng xuống đáy giếng (giống giếng đối chứng hồng cầu) - Nếu phản ứng âm tính (-) lượng kháng thể khơng (do pha lỗng), vi rút gây ngưng kết hồng cầu tạo thành hạt ngưng kết lấm 70 Hiệu giá HI tính từ độ pha lỗng cao huyết không xảy tượng ngưng kết Mẫu huyết xem dương tính hiệu giá kháng thể HI đạt từ 1/20 trở lên (OIE, 2004) Phương pháp ELISA (Emzyme-linked immunosorbent assay) Phương pháp ELISA dùng để phát vi rút công cường độc thỏ thí nghiệm dùng để sản xuất giống cơng cường độc thực thí nghiệm Được thực dựa theo qui trình phòng thí nghiệm AAHL (Australian Animal Health Laboratory) Các vật liệu sử dụng ELISA sau: - Mẫu cần chẩn đoán (mẫu gan, lách thỏ chết sau công độc) - Kháng thể chuẩn (kháng thể kháng RHD sản xuất từ cừu) - Kháng nguyên chuẩn (+) - Kháng nguyên chuẩn (-) - Kháng thể đơn dòng kháng RHDV (Anti-RHDV monoclon antibody Mab) - Horseradish peroxidase (HRPO) conjugate - Cơ chất tetramethyl benzidine (TMB) Nguyên tắc phương pháp ELISA Nguyên tắc phương pháp phản ứng màu conjugate với chất TMB thơng qua phản ứng oxi hóa, nhờ hoạt tính xúc tác enzyme peroxidase làm giải phóng oxi nguyên tử từ H2O2, oxi nguyên tử oxi hóa chất màu tetramethyl benzidine (TMB) làm chuyển sang màu xanh dương Khi cho dừng phản ứng H2SO4 làm chuyển sang màu vàng Nồng độ kết hợp KN-KT thể qua màu cách đo OD bước sóng 450nm 71 Enzyme Conjugate KT đơn dòng kháng RHD KN Huyết cừu kháng RHD Hình Cơ chế phản ứng ELISA tìm kháng nguyên Các bước tiến hành Mẫu gan bệnh phẩm lấy vô trùng từ thỏ chết sau cơng cường độc nghiền nát pha lỗng 1:5 PBS (phosphat buffer saline), ly tâm 2000 vòng 15-20 phút, hút dung dịch nỗi phía pha lỗng 1/10 2% sữa bột không kem /PBST (phosphat buffer saline tween 80) Bước Pha loãng 1/800 kháng thể chuẩn 0,05M bicarbonate /bicarbonate coating buffer pH 9,6, sau cho 50µl vào tất giếng vĩ 96 giếng Bước Ủ 370C giờ, lắc nhẹ tủ ấm Bước Rửa vỉ ELISA lần PBST (Phosphate buffer saline tween 80) Bước Cho vào vỉ 96 giếng 50µl tất loại - Mẫu kháng nguyên xử lý để kiểm tra - Đối chứng dương: mẫu pha loãng 1/10 2% sữa bột không kem /PBST - Đối chứng âm: mẫu pha lỗng 1/10 2% sữa bột khơng kem /PBST - Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody control): 2% sữa bột không kem /PBST 72 - Đối chứng conjugate: 2% sữa bột không kem /PBST Bước Ủ 370C giờ, để máy lắc nhẹ tủ ấm Bước Rửa vỉ 96 giếng lần PBST Bước Pha lỗng Mab 1/100 PBST, cho 50µl vào tất giếng ngoại trừ giếng đối chứng conjugate (các giếng có PBST) Bước Ủ 370C giờ, lắc nhẹ tủ ấm Bước Rửa vỉ 96 giếng lần PBST Bước 10 Pha loãng HRPO cộng hợp 1/1000 2% sữa bột khơng kem /PBST, cho 50µl cho vào tất giếng ELISA Bước 11 Ủ 370C giờ, lắc nhẹ tủ ấm Bước 12 Rửa vỉ 96 giếng lần PBST Bước 13 Chuẩn bị chất TMB (pha lỗng trước dùng), cho 50µl vào tất giếng Bắt đầu tính từ giếng Bước 14 Sau giây cho 50µl 1M H2SO4 vào tất giếng để ngừng phản ứng Bước 15 Đo phản ứng máy đo mật độ quang học bước sóng 450nm Bước 16 Đọc đánh giá kết theo nhà cung cấp thuốc thử hướng dẫn qui trình (AAHL), phản ứng hợp cách khi: - Mẫu đối chứng dương (+):có giá trị OD>0,80 (Optical Density) - Mẫu đối chứng (-): có giá trị OD