Đang tải... (xem toàn văn)
CÁC BƯỚC CƠ BẢN1. Chuẩn bị gen mục tiêu2. Tạo vector tái tổ hợp3. Thực hiện kỹ thuật chuyển gen4. Sàng lọc tế bào chuyển gen5. Kiểm tra hoạt tính gen mới6. Thử nghiệm đánh giá an toàn7. Sản xuất, dán nhãn, lưu thông
Thực phẩm biến đổi gen Đề tài 4: Các bước tạo GMO, GMF Sinh viên thực (Nhóm 4) Hà Thị Ngọc Anh Nguyễn Thị Vân Cúc Hồ Thị Lan Lê Thị Uyên Phương Hoàng Thị Huyền Trinh Lê Thị Vân GV hướng dẫn PGS.TS Khuất Hữu Thanh CÁC BƯỚC CƠ BẢN Chuẩn bị gen mục tiêu Gen mục tiêu là: – DNA lấy từ vi sinh vật (gen kháng sâu từ vi khuẩn BT); – RNAm lấy từ thực vật, động vật (gen chịu hạn từ cỏ ba lá)… Các bước tiến hành: Chuẩn bị gen mục tiêu Các Tách chiết bước Mục đích Lấy đoạn gen mục tiêu khỏi tế bào sinh vật (tách lấy DNA, RNA) Nguyên tắc - Phương pháp vật lý (đồng hóa, đun nóng, ly tâm, siêu âm…) - Phương pháp hóa học (phá vỡ màng tế bào) Cách tiến Sử dụng phương pháp hành tách chiết khác nhau, phụ thuộc vào: - Loại gen (DNA tổng? DNA plasmid? RNA…) - Sinh vật (vi khuẩn? Sinh vật bậc cao?) Tinh Loại bỏ thành phần khác để có DNA RNAm tinh khiết Tách dòng Cắt lấy đoạn gen mục tiêu, tạo dòng tế bào mang gen đích lưu trữ - Dùng hỗn hợp hóa chất, Sử dụng enzym cắt đặc tách lớp, gạn lấy phần có hiệugắn vào vector tách gen mục tiêu dòng phù hợp Có khác - Rửa ly tâm lấy kết tủa eukaryote prokaryote (DNA, RNA) - cắt đoạn gen - Rửa cồn tuyệt đối lạnh dung dịch - gắn vào vector tách dòng muối phù hợp - Ly tâm tốc độ cao để - Chuyển vào tế bào khả DNA RNA lắng biến xuống đáy, gạn nước - Tạo dòng mang gen đích thu kết tủa lưu trữ Chuẩn bị gen mục tiêu Cấu trúc vector tách dòng: - Phân tử DNA mạch kép, dạng vòng - Kích thước nhỏ dễ vào tế bào - Có điểm cắt đặc hiệu RE - Cho phép cài đoạn DNA lạ - Có trình tự tái ori - Có gen thị (kháng sinh, màu) Tiến hành tách dòng gen mục tiêu: prokaryote eukaryote Vi khuẩn Thực vật, động vật Chỉ cần tách đoạn gen mục tiêu từ DNA Có thể phải lấy RNA Chỉ cần chép đoạn gen mục tiêu, cắt Cần phải cắt bỏ intron sau thực nhờ enzyme phiên mã ngược Tạo vector tái tổ hợp - Vector là đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài (gắn) đoạn DNA cần thiết, có khả tái không phụ thuộc vào phân chia tế bào, tồn độc lập tế bào chủ qua nhiều hệ mà không gây biến đổi hệ gen tế bào chủ - Vetor tái tổ hợp vector tạo thành gắn gene cần chuyển vào vector biểu sẵn có loại enzyme cắt, nối - Vector chuyển gene: Là phân tử ADN có khả mang gen cần thiết, thường có dạng vòng có số đặc tính: • Có điểm khởi đầu chép (origin of replication) để tự chép mà tồn độc lập tế bào • Có đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn để tạo nơi lắp ráp cho đoạn gen lạ • Có trình tự khởi điểm (promoter) • Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát nhận biết chúng tế bào chủ nhận Một số plasmid Enzyme cắt giới hạn: Dựa vào khả nhận biết cắt, chia làm nhóm: + Nhóm 1: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA cách vị trí nhận biết khoảng 1000 bp + Nhóm 2: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA vị trí nhận biết + Nhóm 3: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA cách vị trí nhận biết khoảng 20 bp Chỉ có RE nhóm thương mại hóa, sử dụng kỹ thuật gen Enzyme ghép nối – Sử dụng enzyme có tên ligase: tạo liên kết este đầu 5’P đầu 3’OH – Có thể ghép nối đầu đầu đầu lệch – Uphổ biến enzyme T4 DNA ligase: từ thực khuẩn thể T4 – Thường có sản phẩm thương mạ i – Điều kiện cho phản ứng ghép nối: nhiệt độ phòng (25oC), thời gian ngắn (5 -10 phút), nhiệt độ thấp 4oC, thời gian dài (qua đêm) Sự hình thành vector tái tổ hợp Gen gắn vào promotor terminator nhờ đoạn tương đồng Thực chuyển gen Chuyển gen tập hợp nhiều kỹ thuật khác nhằm gắn gen (một đoạn DNA) vào gen tế bào cá thể sinh vật GIỐNG NGÔ BIẾN ĐỔI GEN GA21 KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ Mô tả sơ quy trình Thơng tin gen chuyển • Trình tự chuỗi axit amin protein mEPSPS giống đến 99,3% so với protein EPSPS enzyme quan trọng đường axit shikimic enzyme tìm thấy tự nhiên tất thực vật, nấm, vi khuẩn • So sánh trình tự chuỗi axit amin protein mEPSPS với trình tự protein độc tố ngân hàng liệu thông tin cho thấy mEPSPS không tương đồng với độc tố biết Cấu trúc gen chuyển Primer and probe Vector sử dụng Các thành phần vùng backbone vecto Kích thước chức vùng đoạn T-DNA Chuyển gen sung bắn gen Kết sau chuyển gen Biểu protein biến đổi (mEPSPS) ngô GA21 Bảng 1: nồng độ mEPSPS ngô từ ba hệ lai hồi giao Protein mEPSPS có ổn định qua nhiều hệ Các đặc điểm tính trạng tương tự ngơ chuyển gen GA21 ngơ khơng chuyển gen Tính trạng khác biệt ngô chuyển gen GA21 ngô không chuyển gen TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Nghị định Số: 69/2010/NĐ-CP “Về an toàn sinh học sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền sản phẩm sinh vật biến đổi gen” 2) Thông tư liên tịch Số: 45/2015/TTLT-BNNPTNTBKHCN “ Hướng dẫn ghi nhãn thực phẩm biến đổi gen bao gói sẵn” 3) Bài giảng “thực phẩm biến đổi gen”, PGS.TS Khuất Hữu Thanh, Viện CNSH-CNTP, ĐHBKHN ...CÁC BƯỚC CƠ BẢN Chuẩn bị gen mục tiêu Gen mục tiêu là: – DNA lấy từ vi sinh vật (gen kháng sâu từ vi khuẩn BT); – RNAm lấy từ thực vật, động vật (gen chịu hạn từ cỏ ba lá)… Các bước tiến... thực vật, động vật (gen chịu hạn từ cỏ ba lá)… Các bước tiến hành: Chuẩn bị gen mục tiêu Các Tách chiết bước Mục đích Lấy đoạn gen mục tiêu khỏi tế bào sinh vật (tách lấy DNA, RNA) Nguyên tắc... phân tử DNA cách vị trí nhận biết khoảng 1000 bp + Nhóm 2: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA vị trí nhận biết + Nhóm 3: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA cách vị trí