TẠP CHi KHOA HỌC ĐHQGHN, KHTN & CN, T.XVIII, số 4, 2002 TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH KHOI LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA LECTIN TỪ HẠT ĐẬU VÁN ĐEN (LABLAB PURPUREƯS) T rư n g V ăn C hâu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội I M đ ầ u Đậu ván đen hai giơng trồng lồi đậu ván (Lablab purpureus) trồng r ấ t phổ biến ỏ miền Bắc nước ta [2] H ạt thực phẩm giàu protein vitam in cho người, th â n sử dụng làm thức ăn cho gia súc Trong h ạt đậu ván đen phát thấy có chứa lectin với hoạt độ cao, tương đương với đậu cove (.Phaseolus vulgaris) [1] Hiện chưa có cơng trìn h nghiên cứu trình tinh chê lectin từ đậu ván đen xác định khôi lượng p h ân tử Bởi chúng tơi tiến hành cơng trình n hằm cung cấp dẫn liệu khoa học lectin đậu ván, bổ xung thêm dạng lectin từ loài thuộc họ đậu (Fabaceae) II N g u y ê n liệ u v p h n g p h p n g h iê n u N g u y ê n liệu : H ạt đậu ván đen già th u n h ận từ sô' vùng thuộc huyện Mê Linh - Vĩnh Phúc H ạt bóc vỏ ngồi, th mỏng, sấy khơ ỏ 30°c nghiền th n h bột mịn Lấy gam bột khô để chiết rú t tinh chế lectin P h n g p h p n g h iê n cứu a) Chiết rú t lectin đệm PBS pH 7,4 Quá trìn h chiết rú t thực khuấy từ vỏi gam bột khô b) Xác định hàm lượng lectin protein mẫu th í nghiệm phương pháp Lowry c) Quá trìn h tinh chế lectiri thực qua giai đoạn sắc ký: sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-75 sắc ký trao đổi ion qua cột DEAE-Xenluloz Độ tinh lectin kiểm tra điện di gel polyacrylamit theo Laemmli [5] d) Khôi kượng phân tử, lectin xác định điện di gel polyacrylamit có sử dụng protein chuẩn biết trước khối lượng phân tử Các hoá chất dùng để tin h chế xác định khối lượng phân tử lectin hãng SIGMA (Mỹ) T rư n g V ăn C háu Quá trình tinh chế lectin biểu diễn theo sơ đồ sau: Bột nguyên liệu I Chiết rú t lectin PBS pH 7,4 Li tâm 20 c, 3000 v/phút ▼ Cặn tủ a (bỏ) Dịch ị Dịch + (NH4)2S tâi 60% bão hoà i Li tâm 20°c, 5000v/phút Dịch ( bỏ ) Cặn tủa Sắc ký qua cột Sephadex G-75 L Sắc ký qua cột DEAE-Xenluloz ị Điện di gel polyacrylamit i Lectin Tinh chê xác đinh khôi lương ph ản tử III K ết q u ả v đ n h g iá T in h ch ê le c tin từ h t đ â u vá n đen Lectin từ hạt đậu ván đen tinh chế qua giai đoạn sắc ký : sắc ký lọc gel Sephadex G-75 sắc ký trao đổi ion DEAE - Xenluloz a Sắc ký lọc gel Sephadex G-75 Trưốc hết, kết tủ a dịch chiết lectin thô (NH4)2S 60% bão hồ, sau cân cột G-75 đệm PBS pH 7,4, đưa dung dịch kết tủ a lên cột Quá trình sắc ký theo phân đoạn phân đoạn th u ml vói tốc độ dòng chảy 30 ml/giờ Trong q trìn h th u đỉnh lectin Sơ đồ sắc ký biểu diễn hình 1: H ình 1: sắc ký đồ dịch chiết thô qua cột Sephadex G-75 Thu 50 phân đoạn, phân đoạn 3ml Tốc độ dòng chảy 30 mm/giờ Đường liền Đường gián đoạn - : Hoạt độ lectin - HAA : Mật độ quang OD-hàm lượng protein phân đoạn 10 Trương Văn Chãu b Sắc ký trao đơi ion DEAE - Xenluloz: Tồn dịch sơ chế qua cột Sephadex G-75 có chứa lectin dồn lại, tủ a ( NH4 )2S 60% bão hồ, thẩm tích 24 giò, sau dưa lên cột trao đổi ion DEAE - Xenluloz Quá trìn h sắc ký thực theo građien nồng độ NaCl - M đệm phốt p h át 0,2 M ỏ pH 8,0 Tốc độ sắc ký 20 ml/giò, th u 50 phân đoạn, phân đoạn 2ml Trong trình sắc ký th u đỉnh lectin Ở nồng độ 0,5 M NaCl lectin bị đẩy khỏi cột nhiều HAA H ình 2: sắc ký đồ tinh chế lectin qua cột DEAE-Xenluloz Đệm phôt ph át 0,2 M pH 8,0 Tốc độ dòng chảy 20ml/giờ Thu 50 phân đoạn, phân đoạn 2ml Quá trìn h sắc ký theo gradien nồng độ NaCl - M Đường liền: : Hoạt độ lectin-HAA Đưòng gián đoạn : Mật độ quang OD-hàm lượng protein phân đoạn Như sau giai đoạn sắc ký độ tinh lectin tản g 8,3 lần so vối dịch chiết thô ban đầu, th u hồi lectin đạt 33,2% Tồn q trình tin h chế lectin từ h ạt đậu ván đen tóm tắ t bảng dưối Tinh chê vả xác đinh khôi lương phản tử củ a 11 Bảng tóm tắ t q trình tinh chê lectin từ hạt đậu ván đen HĐTS : Hoạt độ tổng số Pr : Protein HĐR : Hoạt độ riêng đv HAA : Dơn vị hoạt độ ngưng kết hòng cầu lectin Protein tổng SC) HĐTS đvHAA.103 Độ tăng(lần) Thu hồi HAA (%) Dich chiết thô (mg) 750 HĐR đvHAA.103 /mgpr 512 0,682 100 Dich tủ a ( NH4) ;S 620 512 0,825 100 Sắc ký Sephadex G-75 150 350,8 2,33 1,2 3,2 68,5 Sắc ký DEAEXenluloz 30 170,0 5,66 8,3 33,2 Các bưóc tinh chê K iểm tr a độ tin h s c h xá c đ ịn h k h ố i lư ợ n g p h â n tử le c tin đ ậ u ván đen H ình : Phổ điện di chế phẩm lectin tinh chế gel polyacrylamit có SDS 1.Chế phẩm lectin thơ Chế phẩm lectin tinh chế có SDS mecrcaptoetanol 3.Chế phẩm lectin tinh chế có SDS khơng mecrcaptoetanol 4.Protein chuẩn: a) Albumin huyết bò 66 kDa b) Inhibitortripxin c) Lizozim 20 kDa 14 kDa 12 Trương Văn Chău Bằng phướng pháp điện di gel polyacrylamit ph át thấy dịch chiết thô từ h ạt đậu ván đen có nhiều băng protein, chế phẩm lectin qua giai đoạn sắc ký băng protein gel Khi sử dụng số dạng protein chuẩn biết trước khối lượng phân tử, phương pháp xác định khối lượng ph ân tử lectin đậu ván đen khoảng 28 kDa IV K ết lu ậ n Lectin từ h ạt đậu ván đen (Lablab purpureus) tin h chế qua giai đoạn sắc ký nối tiếp: sắc ký qua cột Sephadex G-75 sắc ký qua cột trao đổi ion DEAE Xenluloz có độ tinh cao táng 8,3 lần so vối dịch chiết ban đầu Chế phẩm lectin tinh chế gồm băng protein gel polyacrylamit 2.Bằng phương pháp điện di gel polyacrylamit xác định khôi lương phân tử đậu ván đen 28 kDa TÀI L IỆ U TH AM KHẢO Trương Vãn Châu, Đỗ Ngọc Liên, Nghiên cứu protein lectin từ h ạt đậu cove xanh cove chạch thuộc loài đậu cove (Phaseolus vulgaris), Thông báo khoa học s ố 4, Trường ĐHSP Hà Nội I, 1994, tra n g 59 - 65 Nguyễn Đảng Khôi, N ghiên cứu thức ăn gia súc Việt N a m , tập 1, Nhà xuất Khoa học & Kỹ th u ậ t - Hà Nội, 1979 Đỗ Ngọc Liên, T rần T uấn Quỳnh, Tách, tin h chế nghiên cứu sỗ* tín h chất lectin từ h ạt chay (Artocarpus tonkỉnensis L), Tạp ch í S in h học tháng 6/1991, tra n g 20 - 27 Ahidjo Ayouba, C hristian Chatelain and Pierre Rouge, Leguine lectins interact with muramic acid and N-Axetylmuramic acid, Federation o f Europe and Biochemical Soclatedy Volum 289, No 1(1991), 102-104 Laemmli U.K, Resagent and gel for SDS-PAGE, N ature, No.227(1970), pp.579580 Tinh c h ế xác đinh khối lương p h â n tử củ a 13 VNU JOURNAL OF SCIENCE, Nat., Sci., & Tech., T.XVII1, Nọ4, 2002 PURIFICATION AND DETERMINATION OF MOLECULAR WEIGHT OF LECTIN FROM LABLAB PURPUREUS Truong V an C hau H a Noi Pedagogical University No.2 Lectin from Lablab p u rp ureu s was extracted in phosphate buffered saline (PBS with pH 7,4) and was purified by the method of choromatography gel filtration on Sephadex G-75 and io-exchange on DEAE-cellulose The purity of lectin was checked by SDS-polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) The lectin activity was determ ined by method of Alecxande A Kott The molecular weight of lectin from Lablab purpureus was 28 kDa when was determined by SDS-polyacrylamide electrophoresis  ... di gel polyacrylamit i Lectin Tinh chê xác đinh khôi lương ph ản tử III K ết q u ả v đ n h g iá T in h ch ê le c tin từ h t đ â u vá n đen Lectin từ hạt đậu ván đen tinh chế qua giai đoạn sắc... thơ từ h ạt đậu ván đen có nhiều băng protein, chế phẩm lectin qua giai đoạn sắc ký băng protein gel Khi sử dụng số dạng protein chuẩn biết trước khối lượng phân tử, phương pháp xác định khối lượng. .. phân tử, phương pháp xác định khối lượng ph ân tử lectin đậu ván đen khoảng 28 kDa IV K ết lu ậ n Lectin từ h ạt đậu ván đen (Lablab purpureus) tin h chế qua giai đoạn sắc ký nối tiếp: sắc ký qua