Đang tải... (xem toàn văn)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS) MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang Chuẩn Y ......................................................................................... i LÝ LỊCH CÁ NHÂN .............................................................................. ii LỜI CAM ĐOAN .................................................................................. iii LỜI CẢM ƠN ........................................................................................ iv TÓM TẮT ............................................................................................... v SUMMARY ........................................................................................... vi MỤC LỤC ............................................................................................ vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................... xi DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................... xii Chương 1. Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề............................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2 1.3 Mục đích nghiên cứu .............................................................................................. 2 Chương 2. Tổng quan tài liệu 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) ............................................ 3 2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh .................................................................................. 3 2.1.2 Đặc điểm bệnh ............................................................................................... 4 2.1.3 Virus PRRS ................................................................................................... 5 2.1.3.1 Phân loại ................................................................................................. 5 2.1.3.2 Kích thước và hình thái học ................................................................... 6 2.1.3.3 Cấu trúc gen ........................................................................................... 7 2.1.3.4 Sự khác biệt về trình tự giữa genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ ....... 8 2.1.3.5 Sự biến đổi của dòng virus PRRS Trung Quốc ..................................... 9 2.1.3.6 Virus PRRS vaccine ............................................................................. 11 viii 2.1.4 Vaccine phòng bệnh do virus PRRS .......................................................... 13 2.1.5 Tình hình tiêm phòng vaccine PRRS ở Việt Nam ...................................... 15 2.2 Các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS ............................................................. 16 2.2.1 Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh .................................. 16 2.2.2 Phương pháp RTPCR ................................................................................. 17 2.2.3 Phương pháp RFLP ..................................................................................... 18 2.2.4 Phương pháp phân tích trình tự................................................................... 18 2.3 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở nước ngoài ....... 19 2.4 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở trong nước ....... 21 Chương 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành ............................................................................ 23 3.1.1 Thời gian ....................................................................................................... 23 3.1.2 Địa điểm ........................................................................................................ 23 3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 23 3.3 Vật liệu và hóa chất ............................................................................................... 23 3.3.1 Nguồn mẫu .................................................................................................... 23 3.3.2 Hóa chất ......................................................................................................... 25 3.3.2.1 Hóa chất để tách chiết RNA.................................................................. 25 3.3.2.2 Hóa chất trong phản ứng RT PCR ....................................................... 25 3.3.2.3 Hóa chất điện di .................................................................................... 25 3.3.2.4 Hóa chất để tinh sạch sản phẩm RTPCR ............................................. 25 3.3.2.5 Hóa chất dùng trong RFLP ................................................................... 25 3.3.3 Thiết bị và dụng cụ........................................................................................ 26 3.4 Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................... 26 3.4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RTPCR .................... 26 3.4.1.1 Ly trích RNA từ huyết thanh ................................................................ 26 3.4.1.2 Khuếch đại gen ORF7 ........................................................................... 26 3.4.2 Phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine bằng kỹ thuật RT PCR RFLP trên đoạn ORF5. .............................................................. 27 3.4.2.1 Khuếch đại gen ORF5 .......................................................................... 28 ix 3.4.2.2 Tinh sạch sản phẩm RTPCR ................................................................ 29 3.4.2.3 Phân tích RFLP ..................................................................................... 29 3.4.3 Thiết lập cây sinh dòng dựa trên trình tự ORF5 của các chủng PRRSV ...... 30 3.4.3.1 Giải trình tự gen ORF5 ........................................................................ 30 3.4.3.2 Phân tích trình tự nucleotide, thiết lập cây sinh dòng .......................... 31 Chương 4. Kết quả và thảo luận 4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RTPCR ......................... 33 4.2 Phân biệt virus thực địa và virus vaccine bằng kỹ thuật RTPCRRFLP trên đoạn ORF5 .......................................................................................................... 34 4.2.1 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype châu Âu ............................................ 34 4.2.2 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype Bắc Mỹ............................................. 36 4.2.3 Phân tích RFLP ............................................................................................. 36 4.2.3.1 Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype châu Âu ...... 37 4.2.3.2 Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype Bắc Mỹ ....... 42 4.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa trên vùng ORF5 ............................................... 45 4.4 Giả thuyết nguồn gốc của các chủng PRRSV tại Tp.HCM, Bà Rịa – Vũng Tàu và Đồng Nai ......................................................................................................... 51 Chương 5. Kết luận và đề nghị 5.1 Kết luận .............................................................................................................. 53 5.2 Đề nghị.................................................................................................... 53 Tài liệu tham khảo ......................................................................................... 55 Phụ lục ............................................................................................................. 63
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….W U X… ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….W U X… ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS) Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS) ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: PGS.TS TRẦN ĐÌNH TỪ Hội Thú y Việt Nam Thư ký: TS NGUYỄN ĐÌNH QT Trường Đại học Nơng Lâm TP HCM Phản biện 1: TS NGUYỄN TẤT TOÀN Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Phản biện 2: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Hội Thú y Việt Nam Ủy viên: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Trường Đại học Nơng Lâm TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Đặng Ngọc Thùy Dương sinh ngày 16 tháng 11 năm 1983 Tp Long Xuyên, tỉnh An Giang Con ơng Đặng Hồng Hải Bà Lê Thị Cam Tốt nghiệp phổ thông trung học trường PTTH chuyên Thoại Ngọc Hầu, tỉnh An Giang năm 2001 Tốt nghiệp Đại học ngành Cơng nghệ sinh học hệ quy Đại học Nông Lâm Tp.HCM năm 2005 Tháng năm 2006 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: độc thân Địa liên lạc: 477/36 Kinh Dương Vương – Phường An Lạc – Quận Bình Tân – Tp.HCM Điện thoại: 0958.172.034 Email: linhduong01@yahoo.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn, Đặng Ngọc Thùy Dương iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn với lòng biết ơn sâu sắc đến: * PGS TS Nguyễn Ngọc Hải hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn hỗ trợ thiết thực cho tơi suốt q trình thực đề tài * Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Phòng Sau Đại Học * PGS TS Trần Thị Dân bước đầu hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu * Quý thầy cô, cán công chức Viện Công nghệ sinh học Môi trường – trường ĐHNL Tp.HCM tận tình giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn * Các anh chị phòng huyết thanh, chi cục Thú Y Tp.HCM * Các bạn bè người thân quan tâm động viên tơi suốt q trình thực đề tài Chân thành cảm ơn, Đặng Ngọc Thùy Dương iv TĨM TẮT Đề tài nghiên cứu “Chẩn đốn phân biệt virus chủng vaccine nhược độc thực địa gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS)” tiến hành Viện Công nghệ sinh học Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM từ tháng 7/2008 – 8/2009 Đề tài thực với nội dung nghiên cứu nhằm xây dựng phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa virus PRRS vaccine nhược độc để phục vụ cho cơng tác phòng chống dịch bệnh nghiên cứu đa dạng di truyền PRRSV Các kết thu sau: Quy trình RT-PCR phát chủng virus PRRS khác dựa vào vùng ORF7 xác định 12 mẫu dương tính với PRRSV tất 18 mẫu khảo sát Cặp primer P71/P72 tham khảo Murtaugh Elam (1996) cho phép xác định dương tính PRRSV với genotype Bắc Mỹ châu Âu điều kiện thí nghiệm Phương pháp RT-PCR-RFLP dựa đoạn ORF5 ứng dụng thành cơng để chẩn đốn phân biệt 11 chủng virus PRRS thực địa PRRS vaccine Cả loại enzyme MluI, HincII, SacII HaeIII sử dụng riêng lẻ để phân biệt virus PRRS thực địa virus PRRS vaccine thuộc genotype Bắc Mỹ Phân tích RFLP phần mềm Chromas Pro cho thấy kết hợp enzyme PstI, HaeII, HincII hay ClaI, HaeII, HincII giúp phân biệt virus PRRS vaccine với virus PRRS thực địa thuộc genotype châu Âu dựa ORF5 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào sinh dòng xây dựng kết giải trình tự vùng ORF5 12 chủng PRRSV xác định nghiên cứu phần mềm MEGA 4.1 DNAStar Dựa ORF5, 12 mẫu virus PRRS xác định thuộc genotype Bắc Mỹ, khơng có mẫu thuộc genotype châu Âu Các chủng nằm nhóm với chủng độc lực cao Trung Quốc chủng 07QN phân lập Việt Nam 2007 với độ tương đồng di truyền mức 98 – 98,7 % có khác biệt với chủng virus PRRS vaccine nhược độc Besta sử dụng Việt Nam với độ tương đồng di truyền mức 85,9 – 86,7 % v SUMMARY Research project “Differentiation of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain from field isolates by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF5” was carried out at Institute of Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from 7/2008 to 8/2009 The project was aimed to distinguish a PRRSV MLV-vaccine from PRRSV field isolates by RT-PCR-RFLP analysis of ORF5 and to study genetic variation of ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates The results were summarized as follows: 12 field isolates and MLV-vaccine could be detected by RT-PCR when primers from ORF7 were used for amplification These primers could detect both NA genotype and EU genotype RT-PCR-RFLP analysis for differentiating a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine strain from isolated strains was succeeded ORF5 was amplified for each genotype The restriction enzymes such as MluI, HincII, SacII, HaeIII were used to cut NA genotype and none of the field isolated had a similar cutting pattern when compared to modified live virus vaccine Using Chromas Pro for RFLP analysis, combining PstI, HaeII, HincII or ClaI, HaeII, HincII could help to differentiate a PRRSV vaccine strain from EU isolated strains Twelve isolates of PRRSV were studied and compared with several PRRSV isolates from other countries Phylogenetic analysis showed that all isolates of PRRSV in this study belong to the NA genotype Sequence analysis revealed that these isolates shared a close relationship with high virulent of Chinese PRRSV in 2006 and 07QN isolated in Quang Nam, VietNam (98 – 98,7 %) However, these twelve isolates shared only 85,9 – 86,7 % nucleotide sequence identities with that of the MLV-Besta vi MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang Chuẩn Y i LÝ LỊCH CÁ NHÂN ii LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT v SUMMARY vi MỤC LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH SÁCH CÁC BẢNG xi DANH SÁCH CÁC HÌNH xii Chương Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Mục đích nghiên cứu Chương Tổng quan tài liệu 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) 2.1.1 Lịch sử phát bệnh 2.1.2 Đặc điểm bệnh 2.1.3 Virus PRRS 2.1.3.1 Phân loại 2.1.3.2 Kích thước hình thái học 2.1.3.3 Cấu trúc gen 2.1.3.4 Sự khác biệt trình tự genotype châu Âu genotype Bắc Mỹ 2.1.3.5 Sự biến đổi dòng virus PRRS Trung Quốc 2.1.3.6 Virus PRRS vaccine 11 vii 2.1.4 Vaccine phòng bệnh virus PRRS 13 2.1.5 Tình hình tiêm phòng vaccine PRRS Việt Nam 15 2.2 Các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS 16 2.2.1 Phương pháp phát kháng thể huyết 16 2.2.2 Phương pháp RT-PCR 17 2.2.3 Phương pháp RFLP 18 2.2.4 Phương pháp phân tích trình tự 18 2.3 Lược duyệt cơng trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV nước ngồi 19 2.4 Lược duyệt cơng trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV nước 21 Chương Nội dung phương pháp nghiên cứu 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 23 3.1.1 Thời gian 23 3.1.2 Địa điểm 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Vật liệu hóa chất 23 3.3.1 Nguồn mẫu 23 3.3.2 Hóa chất 25 3.3.2.1 Hóa chất để tách chiết RNA 25 3.3.2.2 Hóa chất phản ứng RT- PCR 25 3.3.2.3 Hóa chất điện di 25 3.3.2.4 Hóa chất để tinh sản phẩm RT-PCR 25 3.3.2.5 Hóa chất dùng RFLP 25 3.3.3 Thiết bị dụng cụ 26 3.4 Phương pháp nghiên cứu: 26 3.4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV kỹ thuật RT-PCR 26 3.4.1.1 Ly trích RNA từ huyết 26 3.4.1.2 Khuếch đại gen ORF7 26 3.4.2 Phân biệt virus PRRS thực địa virus PRRS vaccine kỹ thuật RT - PCR - RFLP đoạn ORF5 27 3.4.2.1 Khuếch đại gen ORF5 28 viii Hình 4.9: Cây sinh dòng virus PRRS dựa vùng ORF5, dạng có gốc Tất mẫu nghiên cứu đánh dấu ▲ thuộc nhóm 2.3 genotype NA, mẫu vaccine phân lập đánh dấu ◊ thuộc nhóm: nhóm genotype EU nhóm 2.1 genotype NA Cây sinh dòng xây dựng theo thuật toán NeighborJoining, giá trị boottraps 1000 lần 49 Trong nghiên cứu đa dạng di truyền ORF5 từ nước vùng khác nhau, nhiều tác giả (Goldberg ctv, 2000; Forsberg ctv, 2002; Cha ctv, 2006) cho thấy phân bố theo địa lý ảnh hưởng đến tiến hóa phân tử PRRSV, có tác giả không đồng ý (Thanawongnuwech ctv, 2004; Pesch ctv, 2005) Trong kết nghiên cứu mối liên quan phân bố địa lý đa dạng di truyền 12 chủng phân lập tỉnh khác Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu Tp HCM trộn lẫn với nhiều nhánh nhỏ có độ tương đồng với cao 98,2 – 100 % Cụ thể chủng 1ccHCM 82DN (99,2 %) nằm nhánh hay chủng 44HCM, 3BRVT 068DN nằm chung nhánh (100 %) Điều lý giải có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến phân bố chủng virus lưu chuyển thú có mang mầm bệnh PRRS địa phương với nhau, sử dụng vaccine nhược độc, nhiễm chéo vùng lân cận (An ctv, 2007) Các chủng virus PRRS nghiên cứu có độ tương đồng thấp với virus PRRS vaccine nhược độc Besta phép lưu hành Việt Nam (85,9 – 86,7 %) có độ tương đồng thấp với virus PRRS MLV-RespPRRS (86,2 – 87,1 %), MLV-PrimePac (88,1 – 89,1 %) Trong nghiên cứu Key ctv (2001) chủng virus PRRS cấp mang độc lực cao chủng có độ tương đồng cao với virus PRRS vaccine nhược độc RespPRRS vaccine nhược độc PrimePac (90 – 96 %), tác giả giả định có biến đổi gây độc trở lại từ virus PRRS vaccine Tuy nhiên nghiên cứu này, tương đồng virus PRRS vaccine virus PRRS thực địa thấp nên dòng virus độc lực Việt Nam không liên quan đến chủng virus vaccine lưu hành Opriessnig ctv (2005) cho hiệu vaccine đánh giá qua mức độ tương đồng gen vùng ORF5 Vì vùng ORF5 vùng gen mã hóa cho protein GP5 – protein chịu nhiệm vụ cho gắn kết virus tế bào chủ protein chứa epitope trung hòa đầu tiên, thay đổi nucleotide thay đổi lặn nghĩa thay đổi nucleotide không làm thay đổi amino acid khơng có biến đổi 50 kháng nguyên, trường hợp này, vaccine sử dụng Ngược lại, thay đổi nucleotide làm thay đổi amino acid quan trọng dẫn đến thay đổi kháng ngun, lúc vaccine khơng hiệu khơng có tương đồng kháng nguyên kháng thể Các chủng virus PRRS xác định nghiên cứu có độ tương đồng thấp trình tự nucleotide với vaccine nhược độc Besta (85,9 – 86,7 %), RespPRRS (86,2 – 87,1 %) PrimePac (88,1 – 89,1 %), muốn phân tích tương đồng kháng ngun kháng thể cần phải có nghiên cứu phân tích sâu trình tự amino acid Như vậy, phân tích sinh dòng dựa vùng ORF5 cho thấy PRRSV chia thành genotype: genotype châu Âu genotype Bắc Mỹ Tuy nhiên, genotype Bắc Mỹ chia thành nhiều nhánh phát triển khác nhau, chứng tỏ vùng ORF5 virus PRRS genotype Bắc Mỹ có đa dạng di truyền Sự lan truyền mầm bệnh phụ thuộc nhiều yếu tố, xảy khu vực quốc gia Xác định nguồn gốc tác nhân gây bệnh có vai trò quan trọng kiểm soát quản lý dịch bệnh 4.4 Giả thuyết nguồn gốc chủng PRRSV Tp HCM, Bà Rịa – Vũng Tàu Đồng Nai Ngay từ lần xuất Mỹ Canada, PRRS đánh giá bệnh nghiêm trọng heo gây thiệt hại kinh tế cao Ở Việt Nam bệnh phát vào năm 1997 đàn heo nhập từ Mỹ từ nhanh chóng lây lan nước Tuy nhiên, đến năm 2007 hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp bùng phát thành dịch lớn gây chết nhiều heo khắp tỉnh thành nước Trước đó, chủng PRRSV thường gây sẩy thai heo nái hay gây chết heo Nhưng đợt bùng phát dịch 2007 Hải Dương, chủng virus PRRS độc lực cao xuất gây sẩy thai hàng loạt heo nái, gây chết heo heo trưởng thành Không lâu sau đợt bùng phát Hải Dương, 6/2007 dịch bùng phát Quảng Nam, đến 7/2007 dịch lan rộng 67 xã 11 huyện tỉnh gây thiệt hại nặng kinh tế Cùng khoảng thời 51 gian dịch bệnh bùng phát lại Trung Quốc cơng bố thức vào tháng 5/2007 Trong nghiên cứu Feng ctv (2008) quan sát heo bệnh Quảng Nam có biểu lâm sàng sốt cao, ủ rũ, run rẩy kiểm tra bệnh lý đại thể thấy có tổn thương nghiêm trọng phủ tạng tương tự với tổn thương quan sát heo ổ dịch năm 2006 Trung Quốc Theo Tian ctv (2007), với biểu bệnh chủng virus PRRS gây bệnh khơng điển hình có độc lực cao với khả gây chết heo trưởng thành heo nái Phân tích kết giải trình tự cho thấy chủng nghiên cứu thuộc genotype Bắc Mỹ Bên cạnh đó, phân tích độ tương đồng vùng ORF5 chủng với chủng virus độc lực phân lập Mỹ SDSU73 vaccine nhược độc Besta cho thấy độ tương đồng đạt khơng cao (85,9 – 91,2 %) Ngồi ra, phân tích RFLP chủng virus PRRS thực địa virus vaccine PRRS nhược độc Besta cho kiểu RFLP hoàn toàn khác loại enzyme nên loại bỏ giả thuyết chủng virus độc lực Việt Nam có liên quan đến virus vaccine Tuy nhiên, phân tích di truyền ORF5 chủng xác định so với chủng độc lực cao Trung Quốc chủng 07QN, cho thấy chúng có độ tương đồng cao (98 – 98,7 %) Xét thời gian, dịch bệnh PRRS virus chủng độc lực cao xuất trước Trung Quốc, năm 2006 sau xuất Việt Nam, năm 2007 Trong thời gian bùng nổ dịch Việt Nam Trung Quốc dịch bệnh bùng phát trở lại, mà tỉnh bùng phát dịch Việt Nam nằm phía Bắc gần với ổ dịch trước Trung Quốc Do đó, nhóm nghiên cứu Feng ctv (2008), chúng tơi nghi ngờ biến chủng virus độc lực cao năm 2006 Trung Quốc lây truyền sang Việt Nam thông qua việc vận chuyển heo sống Việt Nam Trung Quốc sau lây lan nhanh nước 52 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 - Kết luận Cặp primer P71/P72 cho phép xác định dương tính PRRSV với genotype Bắc Mỹ châu Âu - Kỹ thuật RT-PCR-RFLP sử dụng phân biệt virus PRRS vaccine virus PRRS thực địa genotype Bắc Mỹ với loại enzyme MluI, HincII, SacII HaeIII dựa đoạn ORF5 - Phân tích RFLP phần mềm Chromas Pro cho thấy kết hợp enzyme HaeII, HincII, PstI hay HaeII, HincII, ClaI giúp phân biệt virus PRRS vaccine với virus PRRS thực địa thuộc genotype châu Âu dựa ORF5 - Dựa ORF5, 12 mẫu virus PRRS xác định thuộc genotype Bắc Mỹ, khơng có mẫu thuộc genotype châu Âu Các chủng nằm nhóm với chủng độc lực cao Trung Quốc chủng 07QN phân lập Việt Nam 2007 với độ tương đồng di truyền mức 98 – 98,7 % có khác biệt với chủng virus PRRS vaccine nhược độc Besta sử dụng Việt Nam với độ tương đồng di truyền mức 85,9 – 86,7 % 5.2 - Đề nghị Tiến hành thu thập khảo sát thêm nhiều mẫu để tìm kiếm mẫu thực địa thuộc genotype châu Âu phân tích thêm với vaccine nhược độc khác genotype Bắc Mỹ (Prime Pac) nhằm hoàn thiện phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa virus PRRS vaccine kỹ thuật RT-PCR-RFLP 53 - Phân tích trình tự amino acid vùng ORF5 đánh giá khả biến đổi kháng nguyên để có ghi nhận hiệu vaccine nhược độc sử dụng 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Huỳnh Trọng Tiến, 2007 Phát virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kỹ thuật RT-PCR Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Kim Văn Phúc, Nguyễn Thị Lam Hương, Đặng Hùng, Trần Thanh Quân, Bùi Anh Thy, Morrissy Chris, 2007 Điều tra lưu hành virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) heo số tỉnh Nam Bộ Báo cáo kết NCKH 2007, Bộ Nông Nghiệp PTNT La Tấn Cường, 2005 Sự lưu hành ảnh hưởng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo số trại chăn nuôi thành phố Cần Thơ Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, Nguyễn Ngô Minh Triết ctv, 2001 Bước đầu khảo sát hội chứng sinh sản hô hấp số trại heo giống thuộc vùng thành phố Hồ Chí Minh Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn Báo cáo khoa học, Phần chăn nuôi thú y 1999 – 2000 Thái Quốc Hiếu, Lê Minh Khánh, Nguyễn Văn Hân, Hồ Huỳnh Mai, Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân, Nguyễn Phước Ninh, Trần Thị Bích Liên, 2007 Ảnh hưởng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp đến khả bảo hộ bệnh dịch tả heo Tạp chí KHKT Thú y XIV (4/2007): 84-87 Trần Thị Bích Liên Trần Thị Dân, 2003 Tỷ lệ nhiễm PRRS số biểu lâm sàng rối loạn sinh sản-hô hấp heo nuôi trại chăn ni Tạp chí KHKT Thú Y 4/2003: 89-91 Trần Thị Bích Liên, Nguyễn Thị Kiều Anh, Trần Thị Dân, Nguyễn Thị Phước Ninh, Nguyễn Ngọc Tuân, 2007 Khảo sát biến động kháng thể mẹ truyền heo nái nhiễm virut PRRS Tạp chí KHKT Thú y XIV (2): 5-10 Trần Thị Dân Nguyễn Thị Phước Ninh, 2004 Đặc điểm dịch tễ đề xuất biện pháp phòng bệnh MH PRRSV đàn heo giống Báo cáo đề tài NCKH 2003-2004, Sở KHCN TPHCM 55 TIẾNG ANH Allende R., Lewis T.L., Lu Z., Rock D.L., Kutish G.F., Ali A., Doster A.R., Osorio F.A., 1999 North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regions J Gen.Virol 80: 307-15 10 An T., Zhou Y., Liu G., Tian Z., Li L., Qiu H., Tong G., 2007 Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein of PRRSV isolates in mainland China from 1996 to 2006: Coexistence of two NA-subgenotypes with great diversity Vet Micro 123: 43–52 11 Andreyev V.G., Wesley R.D., Mengeling W.L., Vorwald A.C and Lager K.M., 1997 Genetic variation and phylogenetic relationships of 22 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) field strains based on sequence analysis of open reading frame Arch Virol 142: 993-1001 12 Botner A., Strandbygard B., Sorensen K.J., Have P., Madsen K.G., Madsen E.S., Alexandersen S., 1997 Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine Vet Rec 141 (19): 497-9 13 Bouvet J., Charreyre C., Lambert V., Aeberle C., Brocard P., Bceuf L., Chappuis G., 2001 Genetic variability of European Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) isolates by RT-PCR and Restriction Enzyme Length Polymorphism of ORF gene Revue Méd Vét 152: 8-9, 611-616 14 Cai H.Y., Alexander H., Carman S., Lloyd D.,Josephson G and Maxie M.G., 2002 Restriction fragment length polymorphism of porcine reproductive and respiratory syndrome virus recovered from Ontario farms, 1998-2000 J Vet Diag Invest 14: 343-347 15 Cha S.H., Choi E.J., Park J.H., Yoon S.R., Song J.Y., Kwon J.H., Song H.J., Yoon K.J., 2006 Molecular characterization of recent Korean porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) viruses and comparison to other Asian PRRS viruses Vet Microbiol 117: 248–257 16 Chang C.C., Yoon K.J., Zimmerman J.J., Harmon K.M., Dixon P.M., Dvorak C.M., 2002 Evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus during sequential passages in pigs J.Virol 76 (10): 4750–4763 17 Chen J., Liu T., Zhu C.G., Jin Y.F., Zhang Y.Z., 2006 Genetic Variation of Chinese PRRSV Strains Based on ORF5 Sequence Biochem Genet 44: 421–431 56 18 Cheon D.S Chae C., 2000 Restriction fragment length polymorphism analysis of open reading frame gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in Korea Arch Virol 145: 1481-1488 19 Christopher J., Nelson E.A., Nelson J.K., Benfield D.A., 1997 Effects of a modified-live virus vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome in boars Am J Vet Res 58 (1): 40-45 20 Collins J.E., Benfield D.A., Christianson W.T., Harris L., Hennings J.C., Shaw D.P., Goyal S.M., McCullough S., Morrison R.B., Joo H.S., 1992 Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs J Vet Diagn Invest (2): 117-126 21 Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H., Pirzadeh B., Rogan D., 2000 Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145 (4): 659-688 22 Dee S.A and Joo H.S., 1994 Recurrent reproductive failure associated with porcine reproductive and respiratory syndrome in a swine herd J Am Vet Med Assoc 205(7): 1017-1028 23 Drew T.W., Meulenberg J.J., Sands J.J., Paton D.J., 1995 Production, characterization and reactivity of monoclonal antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Gen Virol 76: 1361-1367 24 Feng Y., Zhao T., Tung Nguyen, Innui K., Ma Y., Hoa Nguyen, Cam Nguyen, Liu D., Anh Bui, Thanh To, Wang C., Tian K., Gao G.F., 2008 Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Vietnam and China, 2007 Emer Infect Diseases 14 (11): 1774-1776 25 Forsberg R., Storgaard T., Nielsen H.S., Oleksiewicz M.B., Cordioli P., Sala G., Hein J., Botner A., 2002 The genetic diversity of European type PRRSV is similar to that of the North American type but is geographically skewed within Europe Virology 299: 38–47 26 Gao Z.Q., Guo X., Yang H.C., 2004 Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Arch Virol 149:1341–1351 27 Golberg T.L., Hahn E.C., Weigel R.M., Scherba G., 2000 Genetic, geographical and temporal variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Illinois J Gen Virol 81: 171-179 57 28 Guarino H., Goyal S.M., Murtaugh M.P., Morrison R.B., Kapur V., 1999 Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by reverse transcription-polymerase chain reaction using different regions of the viral genome J Vet Diag Invest 11: 27-33 29 Guarino H., Goyal S.M., Murtaugh M.P., 1997 Comparison of four RNA extraction methods for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by RT-PCR Microbiologica 20: 319-324 30 Halbur P.G., Paul P.S., Meng X.J., Lum M.A., Andrews J.J., Rathje J.A., 1996 Comparative pathogenicity of nine U.S porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolates in a five-week-old cesareanderived, colostrum-deprived pig model J Vet Diagn Invest 8: 11-20 31 Hennings J.C., Faaberg K.S., Murtaugh M.P., et al., 2002 Porcine reproductive and respiratoty syndrome (PRRS) diagnostic: Inetrpretatin and limitation J Swine Heath Prod 10 (5): 213-218 32 Hesse R.A., Couture L.P., Lau M.L., Dimmick S.K., and Ellsworth S.R., 1996 Efficacy of Prime Pac PRRS in controlling PRRS reproductive disease: Homologous challenge In Proc 27th Annu Meet Am Assoc Swine Pract, pp 103-105 33 Hill H.T., 1990 Overview and history of mystery swine disease (swine infertility/respiratory syndrome) In Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, Livestock Conservation Institute, Madison, pp 29-31 34 Itou T., Tazoe M., Nakane T., Miura Y and Sakai T., 2001 Analysis of ORF5 in Japanese porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates by RFLP J Vet Med Sci 63: 1203-1207 35 Kapur V., Elam M.R., Pawlovich T.M., Murtaugh M.P., 1996 Genetic variation in PRRSV isolates in the midwestern United States J Gen Virol 77: 1271– 1276 36 Keffaber K.K., 1989 Reproductive failure of unknown etiology American Association of Swine Practitioners Newsletter 1: 1-19 37 Key K.F., Haqshenas G., Guenette D.K., Swenson S.L., Toth T.E & Meng X.J., 2001 Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates Vet Micro 83: 249–263 38 Kinney R.M., Johnson B.J., Welch J.B., Tsuchiya K.R., Trent D.W., 1989 The 58 full-length nucleotide sequences of the virulent Trinidad donkey strain of Venezuelan equine encephalitis virus and its attenuated vaccine derivative, strain TC-83 Virology 170: 19-23 39 Larochelle R., D’Allaire S., Magar R., 2003 Molecular epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Quebec Virus Res 96: 3–14 40 Magar R., Larochelle R., Dea S., Gagnon C.A., Nelson E.A., ChristopherHennings J., Benfield D.A., 1995 Antigenic comparison of Canadian and US isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using monoclonal antibodies to the nucleocapsid protein Can J Vet Res 59 (3): 232-234 41 Magar R., Larochelle R., Nelson E.A., Charreyre C., 1997 Differential reactivity of a monoclonal antibody directed to the membrane protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Can J Ve.t Res 61(1): 69-71 42 Mardassi H., Mounir S., Dea S., 1994 Identification of major differences in the nucleocapsid protein genes of a Quebec strain and European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Gen Virol 75: 681685 43 Martelli P., Cordioli P., Fallacara F., Terreni M and Cavirani S., 2003 Genetic diversity (ORF5) of PRRSV isolates from a herd with sams In Proceedings 4th International symposium on emerging and re-emerging pig diseases Italy, pp 56-57 44 Meng X.J., Paul P.S., Halbur P.G., Lum M.A., 1995 Phylogenetic analyses of the putative M(ORF6) and N (ORF7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A and Europe Arch Virol 140(4): 745-755 45 Mengeling W.L., Lager K.M., Vorwald A.C., 1998 Clinical effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on pigs during the early postnatal interval Am J Vet Res 59(1):52-55 46 Mengeling W.L., Larger K.M., Vorward A.C., 1996 An overview an vaccination for porcine reproductive and respiratory syndrome In Proc 23d Allen D Leman Swine Conf, pp 139-142 47 Meredith M.J., 1995 Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) Pig disease information centre, University of Cambridge 59 48 Meulenberg J.J., de Meijer E.J., Moormann R.J., 1993 Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV Virology 192(1): 62-72 49 Murtaugh M.P., Elam M.R., and Kakach L.T., 1996 Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus Arch Virol 140: 1451-1460 50 Nelsen C.J., Murtaugh M.P., Faaberg K.S., 1999 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents J Virol 73(1): 270-280 51 Nelson E.A., Christopher-Hennings J., Benfield D.A., 1994 Serum immune responses to the proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus J Vet Diagn Invest 6: 110-115 52 Nielsen H.S., Oleksiewicz M.B., Forsberg R., Stadejek T., Botner A and Storgaard T., 2001 Reversion of a live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine investigated by parallel mutations J Gen Virol 82: 1263-1272 53 Opriessnig T., Pallarés F.J., Nilubol D., et al, 2005 Genomic homology of ORF5 gene sequence between modified live vaccine virus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus challenge isolates is not predictive of vaccine efficacy J Swine Health Prod 13(5): 246–253 54 Pesch S., Meyer C., Ohlinger V.F., 2005 New insights into the genetic diversity of European porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Vet Microbiol 107: 31–48 55 Pirzadeh B., Gagnon C.A and Dea S., 1998 Genomic and antigenic variations of porcine reproductive and respiratory syndrome virus major envelope GP5 glycoprotein Can J Vet Res 62: 170-177 56 Plagemann P and Moenning V., 1992 Lactate dehydrogenase-elevating virus, equine arteritis virus, and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive strand RNA viruses Adv Virus Res 41: 99–192 57 Polson D.A., 1994 A PRRS vaccine review NOBL Laboratories, Inc., P.O Box 59, Sioux Center, IA 51250 58 Punprapa N., Rungsipipat A., Tatsanakit A., Wongyanin P and Thanawongnuwech R., 2004 PCR-RFLP analysis in an open reading frame of variants of PRRSV isolated in Thailand Thai J Vet Med 34 (2): 47-56 60 59 Snijder E.J and Meulenberg J.J., 1998 The molecular biology of arteriviruses J Gen Virol 79: 961-979 60 Snijder E.J., van Tol H., Pedersen K.W., Raamsman M.J., de Vries A.A., 1999 Identification of a novel structural protein of arteriviruses J Virol 73(8): 6335-6345 61 Stanway G., Hughes P.J., Mountford P.C., Reeve P., Minor P.D., Schild G., Almond J.W., 1984 Comparison of the complete nucleotide sequences of the genomes of the neurovirulent polio virus P3/Leon/37 and its attenuated Sabin vaccine derivative P3/Leon/12aib Proc Natl Acad Sci USA 81: 1539-1543 62 Straw B.E., Allaire S.D., Mengeling W.L., Taylor D.J., 1999 Diseases of Swine 8th ed Iowa State Univ Press, Ames 63 Suarez P., Zardoya R., Martin M.J., Prieto C., Dopazo J., Solana A., Castro J.M., 1996 Phylogenetic relationships of European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) inferred from DNA sequences of putative ORF-5 and ORF-7 genes Virus Res 42:159-165 64 Thanawongnuwech R., Amonsin A., Tatsanakit A., and Damrongwatanapokin S., 2004 Genetics and geographical variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Thailand Vet Microbiol 101:9–21 65 Tian K., Yu X., Zhao T., Feng Y., Cao Z., et al, 2007 Emergence of Fatal PRRSV Variants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark PLoS ONE 2(6): e526 66 Wensvoort G., Terpstra C., Pol J.M., ter Laak E.A., Bloemraad M., de Kluyver E.P., Kragten C., van Buiten L., den Besten A., Wagenaar F., 1991 Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus Vet Q 13(3): 121-130 67 Wesley R D., Mengeling W L, Lager K M, Clouser D F., Landgraf J G., Frey M L., 1998 Differentiation of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain fromNorth American field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF J Vet Diagn Invest 10: 140-144 68 Wills R.W., Zimmerman J.J., Yoon K.J., Swenson S.L., McGinley M.J., Hill H.T., Platt K.B., 1995 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: Isolation from chronically infected swine In Proc 26th Annu Meet Am Assoc Swine Pract., pp 387-389 61 69 Wu W.H., Fang Y., Farwell R., Steffen-Bien M., Rowland R.R., ChristopherHennings J., Nelson E.A., 2001 A 10-kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b Virology 287(1): 183-191 70 Yang H.C., Huang F.F., Guo X., 2001 Sequence of genome of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate BJ-4 J Agricult Biotechnol 9: 212–218 71 Yang S.X., Kwang J., Laegreid W., 1997 Comparative sequence analysis of open reading frames to of the modified live vaccine virus and other North American isolates of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus Arch Virol 143: 601-612 72 Yoon K.J., Zimmerman J.J., Swenson S.L., McGinley M.J., Eernisse K.A., Brevik A., Rhinehart L.L., Frey M.L., Hill H.T., Platt K.B., 1995 Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection J Vet Diagn Invest 7: 305-312 73 Yoon K-J, Chang C-C, Zimmerman J.J., Harmon K.M., 2001 Genetic and antigenic stability of PRRSV in persistently infected pigs: clinical and experimental prospective Adv Exp Med Biol 494: 25-30 74 Yoshii M., Kaku Y., Murakami Y., Shimizu M., Kato K., and Ikeda H., 2004 Polymerase chain reaction-based genetic typing of Japanese porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Vet Diagnos Invest 16: 342–347 75 Yuan S., Mickelson D., Murtaugh M.P., Faaberg K.S., 2001 Complete genome comparison of porcine reproductive and respiratory syndrome virus parental and attenuated strains Virus Res 79: 189–200 TỪ INTERNET 76 www.porcillis-PRRS.com/images/virus-structure.jpg 77 www.porcillis-PRR.com/pathogenesis-PRRS.asp 78 www.porcillis-PRR.com/pathogenesis-PRRS.asp 79 Phòng dịch tễ, Cục thú y Việt Nam, tháng – 2009, “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn” http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id= 530&Itemid=91 62 PHỤ LỤC Bảng 1: Phần trăm tương đồng trình tự nucleotide chủng virus PRRS dựa vào khung đọc mở ORF5 63 ... cứu Chẩn đốn phân biệt virus chủng vaccine nhược độc thực địa gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) tiến hành nhằm xây dựng phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa virus PRRS vaccine. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ….W U X… ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HƠ HẤP TRÊN HEO (PRRS). .. trình thực đề tài Chân thành cảm ơn, Đặng Ngọc Thùy Dương iv TĨM TẮT Đề tài nghiên cứu Chẩn đốn phân biệt virus chủng vaccine nhược độc thực địa gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS)